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专利名称：一种检测磷脂依赖性凝血因子x激活物酶活性的方法
技术领域：
本发明涉及药品、生物制品领域，具体涉及一种生色底物法测定磷脂依赖性凝血因子X激活物(FXA)酶活性的方法。
背景技术：
蛇毒血凝酶是从蝰蛇毒中提取并利用现代生物技术分离纯化精制而成。它是一种以止血作用为主的酶制剂，含有两种可促进血液凝固的成分，分别为蝰蛇巴曲酶(Batroxobin)和磷脂依赖性凝血因子X激活物(简称FXA)。其中FXA是一种高度特异性的、具有蛋白水解酶特性的酶类，在响尾蛇和蝰蛇的蛇毒中分布广泛。绝大多数蛇毒FXA是从圆斑蝰蛇和Macrovipera Iebetina中纯化得到的，分别称作为RVV-X和VLFXA，其中RVV-X 的活力最强。这两种FXA均由一条重链a及两条由二硫键相连的C型凝集素结构的轻链&、Y组成，a重链和Y轻链的初级结构在两者中相似，重链均含有金属酶、去整合素和半胱氨酸富集结构域。1994年Gowda等人用质谱测定得到RVV-X的分子量为92，880Da, SDS-PAGE显示重链为57，600Da，轻链分别为19，400和16，400Da，等电点pi为4. 2 7. 8。其在中性条件下(pH = 6. 5-8. 0)稳定，在酸性(PH = 3 6)和碱性(PH = 9 11)条件下活性迅速下降。RVV-X的含糖量为10%，脱糖基化可显著地影响其活力，催化速率下降约130倍。早在1934年，Macfarlane和Barnett就发现FXA能够加速血液凝固，并需要Ca2+参与才能够达到最大活力，而且受金属螯合剂的抑制。1962年，Wi 11 iams和Esnouf用DEAE纤维素柱分离纯化得到了促凝血物。FXA是一种能够作用于凝血因子X和凝血因子IX的金属酶，能够切断浓集于磷脂反应表面的凝血因子X重链上的Arg51-Ile52肽键，将其激活成为Xa。后者可参与外源性凝血和内源性凝血过程，与Ca2+、凝血因子Va及血小板磷脂(PF3)形成复合物(凝血酶原激活物)，将凝血酶原转变为凝血酶，纤维蛋白原又被凝血酶酶解为纤维蛋白单体，其可促使凝血酶对因子XIII的激活，在XIII与钙离子的参与下，相邻的纤维蛋白发生快速共价交联，形成不溶的稳定的纤维蛋白凝块。因此，FXA最终可促使血管破损处的凝血酶形成,促进出血部位血小板聚集。此外，凝血因子X的活化与肿瘤细胞的迁移有关。肿瘤细胞中含有一种蛋白可以直接把凝血因子X活化为Xa，这种行为会导致凝血纤维蛋白附着在肿瘤细胞表面上，使得肿瘤细胞在体内容易扩散。肿瘤细胞中的这类蛋白极难获得，FXA可以模拟这种蛋白活化凝血因子X，这对肿瘤迁移机理有一定的意义。目前，主要采用底物法测定FXA的活性，根据作用底物的不同可将测定方法分为两大类第一大类为天然底物法，即以人血浆为底物，通过判断FXA的加入导致其发生凝固的时间来进行FXA活性测定，该法在20世纪80年代初得到普遍应用，方法常规，但需目测判断纤维蛋白原凝固时间，受检测者主观干扰较大；另一大类为通过FXA水解生色底物产生有特征吸收的生色产物来进行活性测定。但目前多采用两步法测定，即在FXA作用于凝血因子X —段时间后加入终止剂，同时加入生色底物,根据特定时间内Xa的生成量计算FXA的活性。此方法不能排除在活化的早期阶段时间和Xa生成量之间可能存在非线性关系，因而不能精确地反映酶的活性作用特点。鉴于上述方法的局限性，寻找一种高效、经济的活性测定方法成为磷脂依赖性凝血因子X激活物应用研究的关键之一。

发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、可靠、准确地检测磷脂依赖性凝血因子X激活物(FXA)酶活性的方法。本发明中的FXA能够将Human Factor X转换成有水解酶活性的Xa因子(FactorXa)，Xa因子可切开其生色底物S-2765 (Suc-Ile-Gly (Y-Pip) Gly-Arg-PNA)中的肽键，释放出在405nm波长处有特定吸光值的黄色产物对硝基苯胺(PNA)，通过检测405nm处PNA的吸光度，即可对FXA的酶活性进行测定，在这一波长下，其它物质对光的吸收小于PNA对光吸收的I %。随着酶活性梯度变化，吸光度也呈现梯度变化，在一定时间内，反应产物吸光度 与酶活线性相关。据此可绘制FXA标准曲线并计算待测样品的酶活性。该方法包括以下步骤(I)配制 pH = 7. 4，浓度为 0. 02M 的 Tris-HCl 缓冲液； (2)配制浓度为0. 075M的CaCl2溶液；(3)用IOml⑴步制备的缓冲液将IOmg人血清白蛋白配制成浓度为lmg/ml血清白蛋白稀释液；(4) FXA生色底物S-2765与(I)步制备的缓冲液和(2)步制备的CaCl2溶液混合，配制成溶液A ;(5)用(I)步制备的缓冲液将Human Factor X稀释成溶液B ；(6)用(I)步制备的缓冲液和(3)步制备的血清白蛋白稀释液将已知浓度的FXA单体标准品稀释成一系列不同浓度的母液Cn(n ^ I)；(7)用(I)步制备的缓冲液和(3)步制备的血清白蛋白稀释液将待测样品稀释成溶液Dn(n彡I)；(8)将相同体积的一系列不同浓度标准品母液C1X2X3......Cn(n^l)与待测样
品溶液Dn分别加到酶标板不同孔中，再向每孔中补充相同体积的溶液A和相同体积的溶液B，保持每孔溶液的总体积一致，把孔内溶液混匀，立即放入预热至37°C的酶标仪中反应，分别测定每孔中酶解产物对硝基苯胺(PM)的吸光度A405，并根据测定得到的不同浓度标准品母液吸光度A405值，绘制FXA单体标准品的浓度-吸光度线性标准曲线；(9)将测定得到的待测样品吸光度A405值，代入⑶步得到的PNA标准曲线，计算待测样品的酶浓度和活性。其中，优选地，上述(5)步中Human Factor X溶液稀释后的浓度为2. 5 ii M。优选地，上述⑷步中FXA生色底物S-2765溶液的制备过程为用⑴步制备的缓冲液将FXA生色底物S-2765配制成3mM的浓度后，精密量取0. 8ml已制备3mM S-2765溶液并加入0. 6ml (2)步制备的CaCl2溶液，混匀。优选地，上述(6)步中稀释后FXA单体标准品母液的浓度分别为1.4、1.2、1.0、0. 8、0. 6、0. 4、0. 2Ku/ml。
优选地，上述⑶步中酶标板每孔加入(6)步制备的不同浓度FXA单体标准品母液或(7)步制备的待测样品溶液体积均为7 iil，(4)步制备的生色底物S-2765溶液体积为23 ill和(5)步制备的Human Factor X溶液体积为30 U 1，每孔溶液总体积为60 yl。优选地，上述(8)步中酶标仪预热时间为不少于15分钟，反应时间为15分钟后测定405nm波长处每孔酶解产物对硝基苯胺(PNA)的吸收值A405。本发明中FXA生色底物S-2765中需加入合适浓度的钙离子，一方面作为整个反应的激活剂，另一方面可以稀释底物。本发明中需加入过量生色底物S-2765，因酶量一定时，酶反应随着底物浓度不断增加到一定程度将表现为0级反应，即酶反应速率不再受底物浓度的影响。因此，在底物远远过量的情况下，酶反应速率对酶浓度呈线性关系。优选地，上述酶标板中每孔溶液总反应体积为60 ill时，加入FXA单体标准品母液活性单位< 2Ku/孔，生色底物S-2765溶液浓度^ 0. 039mM。 本发明反应需预热至少15分钟，然后再37 V反应15分钟的原因未预热时反应体系里的底物分子和酶分子不能完全接触，易造成局部反应，预热可以加速分子混匀，保证整个体系都能在37°C以最大反应速度反应，容易得到线性反应曲线。与现有测定方法相比，本发明中整个反应过程在96孔板中进行，体系体积�。�效率高，酶标仪的使用也大大减少了吸光度的读数时间。因此，本方法过程简单，便于控制，易于操作，重复性很好。本发明中，酶与底物生色反应无终止剂，为取得较好的实验结果，整个操作过程需紧凑，以免人为造成标准曲线有较大误差。


图I是本发明实施例I中的FXA标准曲线；图2是本发明实施例2中的FXA标准曲线； 图3是本发明实施例3中的FXA标准曲线。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式
。I.仪器与试药FXA 生色底物 S-2765 (Suc-Ile-Gly ( Y-Pip) Gly-Arg-pNA)(购于 Bedford 公司),Human Factor X(购于Thermo公司规格100 ii g/支)，人血清白蛋白(购于通路生物制药有限公司规格10ml 2g) ,0. 02M Tris-HCl 缓冲液(pH 7. 4)0. 075M CaCl2 溶液，FXA 单体标准品(标定浓度为2Ku/ml)，待测样品。酶标仪(型号Biorad 680)。2.实验方法(I)实施例 I①用0. 02M Tris-HCl缓冲液(pH 7. 4)将FXA生色底物S-2765配制成浓度为3mM的溶液；精密量取0. 8ml制备好的3mM S-2765溶液并加入0. 6ml 0. 075M CaCl2溶液，混匀待用；
②取Human Factor X 一支(100 U g)，用 0. 02M Tris-HCl 缓冲液(pH 7. 4)稀释成浓度为2. 5 ii M的溶液，混匀待用；③取IOmg人血清白蛋白加入到IOml 0. 02M Tris-HCl缓冲液(pH 7. 4)中，配制成浓度为lmg/ml的血清白蛋白稀释液；④用已制备好的lmg/ml血清白蛋白稀释液和0. 02M Tris-HCl缓冲液(pH 7. 4)将FXA单体标准品稀释成7个不同浓度的标准品母液，其浓度分别为1. 4、I. 2、I. 0,0. 8,0. 6、0.4、0. 2Ku/ml ；⑤随机选取兆科药业(合肥)有限公司生产留样的、批号为20100628的蛇毒血凝酶注射液制剂作为待测样品(标示为lKu/ml)，用0. 02M Tris-HCl缓冲液和lmg/ml血清白蛋白稀释液稀释该待测样品，该批样品稀释后浓度为0. 4Ku/ml ；⑥在酶标板中，每孔加入①中制备的生色底物S-2765溶液23 ii L，②中制备的 Human Factor X溶液30 yl、④中制备的不同浓度的FXA单体标准品溶液7 或⑤中制备的待测样品7iU，立即混匀。其中，每个浓度标准品母液各3个复孔，待测样品2个复孔。把酶标板放入预热至少4分钟至37°C的酶标仪中，反应15分钟后分别测定405nm波长处每孔对硝基苯胺(PNA)的吸光度A405。以FXA单体浓度(Ku/ml)为横坐标，相应的PNA的吸光度A405为纵坐标，测定不同浓度FXA单体标准品母液相对应PNA吸光度，绘制PNA标准曲线(试验结果获得的标准曲线方程为y = 0. 212x+0. IllLR2 = 0. 9979)。测定待测样品的A405值为0. 205，将该值代入标准曲线计算得到的该待测样品实际效价为I. 0242Ku/ml,不同浓度标准品母液相对应PNA吸光度值见表I。
表I实施例I不同浓度标准品母液相对应PNA吸光度值
权利要求
1.ー种检测磷脂依赖性凝血因子X激活物(FXA)酶活性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 (1)配制pH= 7. 4，浓度为0. 02M的Tris-HCl缓冲液； (2)配制浓度为0.075M的CaCl2溶液； (3)用IOml⑴步制备的缓冲液将IOmg人血清白蛋白配制成浓度为lmg/ml血清白蛋白稀释液； (4奸乂ム生色底物5-2765与(I)步制备的缓冲液和(2)步制备的CaCl2溶液混合，配制成溶液A ； (5)用(I)步制备的缓冲液将HumanFactor X稀释成溶液B ; (6)用(I)步制备的缓冲液和(3)步制备的血清白蛋白稀释液将已知浓度的FXA単体标准品稀释成一系列不同浓度的母液Cn(n ^ I)； (7)用(I)步制备的缓冲液和(3)步制备的血清白蛋白稀释液将待测样品稀释成溶液Dn(n ^ I)； (8)将相同体积的一系列不同浓度标准品母液C1.C2、C3......Cn(n ^ I)与待测样品溶液Dn分别加到酶标板不同孔中，再向每孔中补充相同体积的溶液A和相同体积的溶液B，保持每孔溶液的总体积一致，把孔内溶液混匀，立即放入预热至37°C的酶标仪中反应，分别测定每孔中酶解产物对硝基苯胺(PNA)的吸光度A405，井根据测定得到的不同浓度标准品母液吸光度A405值，绘制FXA单体标准品的浓度-吸光度线性标准曲线； (9)将测定得到的待测样品Dn的吸光度A405值，代入(8)步得到的PNA标准曲线，确定待测样品的酶浓度和活性。
2.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在干，(5)步中溶液B的浓度为2.5 PM。
3.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在干，(4)步中溶液A的制备过程为用(I)步制备的缓冲液将FXA生色底物S-2765配制成3mM的浓度后，精密量取0. 8ml已制备3mMS-2765溶液并加入0. 6ml (2)步制备的CaCl2溶液，混匀。
4.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在干，(6)步中母液C的浓度分别为1.4、I.2> I. 0、0. 8、0. 6、0. 4、0. 2Ku/ml。
5.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在干，(8)步中酶标板每孔加入标准品母液C和待测样品溶液D体积均为7 ill，溶液A体积为23 ill、溶液B体积为30 ill，每孔溶液总体积为60 u I0
6.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述酶标板中每孔溶液总反应体积为60 ill时，加入FXA单体标准品母液C活性单位く 2Ku/孔，溶液A浓度彡0. 039mM。
7.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述(8)步中酶标仪预热时间为4分钟，反应时间为15分钟。
全文摘要
本发明公开了一种快速、特异性地测定磷脂依赖性凝血因子X激活物酶活性的方法，采用生色底物法，使用酶标仪，在一定反应时间和一定活力的标准品范围内获得线性反应曲线，建立产物吸光值和磷脂依赖性凝血因子X激活物浓度的线性关系，据此计算样品的相应酶活。此外，还对该标准曲线的回收率和精密度做了仔细研究，该方法准确度高，步骤简单，方便实验室操作，适用于X激活物原料及蛇毒血凝酶制剂的质量控制。
文档编号G01N21/31GK102798598SQ201110136028
公开日2012年11月28日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者戴向荣, 刘娟娟, 方丽, 杨中强, 李小羿, 张国辉 申请人:兆科药业(合肥)有限公司