专利名称：胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物、检测方法和诊断模型的制作方法
技术领域：
本发明属于医学诊断领域，特别涉及对胰腺癌早期诊断灵敏度、特异性高的血清肿瘤标志物、检测方法和蛋白质指纹图诊断模型。
背景技术：
胰腺癌是恶性程度最高、预后最差的肿瘤之一，胰腺癌患病率和病死率迅速上升， 发病年龄逐渐提前已引起普遍关注。由于临床上缺乏好的肿瘤标志物检测方法，绝大多数的胰腺癌患者确诊时已是中晚期。早期诊断、早期治疗是提高胰腺癌生存率和降低死亡率的关键。但是目前，胰腺癌早期诊断缺乏有效手段，目前主要手段靠影像学检查，但结果不尽人意。在早期阶段，尤其是亚临床阶段CT、MR则无能为力。肿瘤标志物的诊断是近年来研究的热点。然而单一的肿瘤标志物往往难以反映肿瘤的全貌，从理论上讲，最有可能成为理想肿瘤标志物的应是联合数个或多个的肿瘤标志物。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，为了提高胰腺癌早期诊断水平，从而有助于改善胰腺癌患者的预后，本发明的目的旨在建立胰腺癌早期诊断的蛋白质指纹图诊断模型，进一步可筛选出胰腺癌早期诊断的新的体液蛋白质肿瘤标志物。本发明的目的是通过以下技术方案得以实施的
本发明首先提供了胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物，所述的血清肿瘤标志物由11 个蛋白质质荷比峰组成6684Da、6668Da、8591Da、6471Da、4121Da、877OTa、4290Da、665OTa、 2959Da、5913Da和 5346Da。本发明还提供了一种胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物的检测方法，包括
(1)血清准备，
(2)质谱数据收集，筛选出差异蛋白峰，建立胰腺癌早期诊断的蛋白质指纹图诊断模
型，
(3)进一步用遗传算法结合支持向量机模型的方法筛选出血清肿瘤标志物。作为优选方案，根据本发明所述的一种胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物的检测方法，其中，所述的步骤(2)中质谱数据收集设置激光强度为180，检测灵敏度为6，检测上限为100000m/Z，收集数据范围为2000-20000 m/z，信号收集位置从20-80。本发明还提供了一种胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物的蛋白质指纹图诊断模型，其中，所述的血清肿瘤标志物由11个蛋白质质荷比峰组成6684Da、6668Da、8591Da、 6471Da、4121Da、8775Da、4290Da、6655Da、2959Da、5913Da和 5346Da,
所述的蛋白质指纹图诊断模型按下述方法建立
(1)利用表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪测定肿瘤患者与健康人血清标本的蛋白质组图谱，
(2)结合生物信息学的方法筛选出相应的血清肿瘤标志物并建立诊断模型。
本发明与现有技术相比，具有以下优点
(1)利用SELDI-T0F-MS技术从低丰度的血清样本中检测出血清肿瘤标志物。(2)联合在血清中筛选的候选的肿瘤标志物，对胰腺癌患者的早期诊断提供新的途径和方法，弥补了影像学的不足。影像学技术的进步，在早期胰腺癌患者诊断方面取得了一定的突破。(3)相关的支持向量机等生物信息学软件的开发和应用，提高诊断的准确率。(4)本发明从一个崭新的技术平台和理念检测胰腺癌的联合蛋白质肿瘤标志物， 可望提高胰腺癌早期诊断水平，从而有助于改善胰腺癌患者的预后。说明书附图
图1是本发明实验方法的流程示意图。图2是本发明所有样本的递加质谱蛋白质峰示分布意图。图3是早期胰腺癌组与健康人对照组两组样本支持向量机散点分布图，图中，纵坐标principal component表示主成分,横坐标SVM predict labels表示支持向量机预测值，SVM Result Scatter Plot表示支持向量机散点分布结果。图4是所有样本的质谱表达图。图5是人胰腺癌血清样本与相应羊抗人抗体反应过夜后经SELDI检测结果图。
具体实施例方式下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。实施例1
1、样本和资料
胰腺癌患者共M例(早期22、晚期3 ，术后病理确诊，平均年龄65岁。健康对照组共20例，来源于体检，平均年龄为63岁。共分两组进行血清的蛋白质谱分析对比
①早期胰腺癌组vs健康人对照组，
②早期胰腺癌VS晚期胰腺癌组。各组年龄和性别均配对，有相似的暴露史，无影响血清中蛋白质含量的其他相关疾�。谇宄靠崭共杉】等思盎颊咧瘟魄巴庵芫猜鋈�5ml，4°C静置1-池，3000 r/min 条件下离心lOmin，分离血清，-80°C冰箱保存备用。2、实验方法主要仪器设备及试剂
1 Ciphergen PBS- II -PLUS 型 SELDI-TOF-MS 系统 1 蛋白质芯片CMlO芯片实验试剂的配制
41.U9血清变性溶液9 mol/1尿素，2 % CHAPS, 1 % DTT。配制完成后分装，-80°C低温冰箱保存。2. 50% 饱和 SPA 溶液=SPA 的溶剂为 50% H2O + 50% 乙腈+ 0. 5% TFA。将 SPA 溶解于其溶剂中直至过饱和，13，OOOrpm离心1分钟后取上清液，与溶剂1 :1混合即可。室温避
光保存。3. CMlO 芯片 Binding Buffer :50 mmol/1 乙酸钠(pH = 4. 0)。乙酸钠 2. 051g 溶于去离子水中，HCl调节pH值至4.0，定容为500ml。实验方法(流程图见附图1) 芯片的预处理
1 每孑L中力口入 200 μ 1 Binding Buffer
1摇床上振荡(600rpm，室温)5分钟使充分平衡后去除液体，重复平衡一次。血清的预处理
1 冰浴上缓慢融解血清(30 60分钟)，IOOOOrpm离心5分钟(4°C )。1 10 μ 1 U9血清变性溶液中加入血清5yL，摇床上振荡使充分混合(600rpm， 4°〇，30分钟)。1 用Binding Buffer将U9处理后的血清稀释至200 μ 1用于上样，摇床上振荡使充分混合(600rpm，4°C，2分钟)。至此血清被稀释约40倍。蛋白质与芯片结合
1取上述经U9处理并稀释过的血清100 μ 1加到芯片上，仔细检查并去除每个孔中的气泡以免其影响蛋白质与芯片的结合。1芯片与血清充分反应1小时(600rpm摇床上振荡，4°C)后去除样品。结合后冲洗
1 每孔加入200 μ 1相应的Binding Buffer，摇床上振荡5分钟(600rpm，室温)后除
去液体。重复该过程2次。1 用水(纯度朋⑶级力⑷^ 1快速清洗每个孔1次，用力甩干并将Bio-processor 倒扣在清洁的吸水纸上轻拍以去除多余的水。1 将芯片从Bio-processor中取出，自然干燥。加能量吸收分子(EAM)
每孔点加50%饱和的SPA溶液1 μ 1，待其自然干燥后重复点加1次。自然干燥即可上机检测。数据采集及统计学处理
SELDI质谱仪参数设置及原始数据采集和输出
首先用已知分子量的标准蛋白质芯片All-in-One将SELDI质谱系统的分子量误差校正到<0. 1%，再将结合好蛋白质的芯片放入质谱仪中进行检测。原始数据由ftOteinchip Software 3. 2软件采集，设置激光强度为180，检测灵敏度6，检测上限100，000 Λ，优化收集数据范围2000 20000 ，信号收集位置从20 80，每个样本取168个点所收集信号的平均值。用ftOteinchip Software 3. 2软件将原始数据以xlm的格式输出。数据处理
采用 ZJU-PDAS (ProteinChip Data Analyze System)软件分析，整个流程如下1.原始质谱图上传到服务器，
2.先用小波变换(UDWTundecimated discrete wavelet transform)去除质谱仪器本身造成的噪音，
3.修正去除噪音后的质谱图的基线，
4.校正整个图谱的分子量值，
5.用局部极值法找出蛋白值峰，用信噪比和这个峰在各个样本中出现的比率过滤蛋白质峰，
6.均一化所有样本数据，
7.对预处理完筛选出来的蛋白质峰做进一步的检验分析，筛选出P<0.05差异蛋白峰，
8.对筛选的差异蛋白峰进一步用遗传算法结合支持向量机模型的方法筛选最佳模型， 用留一法评估模型的预测效果，选出建立支持向量机模型预测的约登指数最高的组合作为最终的候选标志物，建立的模型和留一法交叉验证的结果作为最终的结果。9.输出各种统计结果和图片。结果
1、早期胰腺癌组(阳性组)vs健康人对照组
22例早期胰腺癌组和20例健康人对照组进行t检验，筛查ρ值小于0. 05的差异蛋白质。共检测到153个经过信噪比和强调过滤的高质量质谱蛋白质峰，发现有14个蛋白质峰含量有统计学差异O°<0. 05)，从中筛选出11个蛋白质峰用于建立SVM判别模型。所有样本的递加质谱蛋白质峰示分布意图见图2。两组样本支持向量机散点分布图，见图3，每一点表示一个样本，纵坐标为主成分，横坐标为SVM预测值，两组可清晰的区分。 表1: P值小于0.05的所有14个峰的统计结果
权利要求
1.胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物，其特征在于，所述的血清肿瘤标志物由11个蛋白质质荷比峰组成:6684Da、6668Da、8591Da、6471Da、4121Da、877OTa、4290Da、6655Da、 2959Da、5913Da和 5346Da。
2.一种胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括(1)血清准备，(2)质谱数据收集，筛选出差异蛋白峰，建立胰腺癌早期诊断的蛋白质指纹图诊断模型，(3)进一步用遗传算法结合支持向量机模型的方法筛选出血清肿瘤标志物。
3.根据权利要求2所述的一种胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物的检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)中质谱数据收集设置激光强度为180，检测灵敏度为6，检测上限为 100000m/z，收集数据范围为2000-20000 m/z，信号收集位置从20-80。
4.一种胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物的蛋白质指纹图诊断模型，其特征在于， 所述的血清肿瘤标志物由11个蛋白质质荷比峰组成6684Da、6668Da、8591Da、6471Da、 4121Da、8775Da、4290Da、6655Da、2959Da、5913Da 和 5346Da,所述的蛋白质指纹图诊断模型按下述方法建立(1)利用表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪测定肿瘤患者与健康人血清标本的蛋白质组图谱，(2)结合生物信息学的方法筛选出相应的血清肿瘤标志物并建立诊断模型。
全文摘要
本发明属于医学诊断领域，特别涉及一种胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物，所述的血清肿瘤标志物由11个蛋白质质荷比峰组成6684Da、6668Da、8591Da、6471Da、4121Da、8775Da、4290Da、6655Da、2959Da、5913Da和5346Da。本发明还提供了胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物的检测方法和诊断模型。本发明利用SELDI-TOF-MS技术从低丰度的血清样本中检测出联合肿瘤标志物，建立了胰腺癌早期诊断的蛋白质指纹图诊断模型，对胰腺癌患者的早期诊断提供了新的途径和方法，弥补了影像学的不足，可望提高胰腺癌早期诊断水平，从而有助于改善胰腺癌患者的预后。
文档编号G01N27/64GK102435665SQ20111028638
公开日2012年5月2日 申请日期2011年9月23日 优先权日2011年9月23日
发明者刘建 申请人:浙江省新华医院
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