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专利名称：一种检测髓过氧化物酶的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测方法，特别是涉及一种检测髓过氧化物酶同型或亚型的免疫测定方法及试剂盒。
背景技术：
髓过氧化物酶(myeloperoxidase, ΜΡ0)是中性粒细胞嗜天青颗粒产生的一种重要的过氧化物酶，主要存在于嗜中性粒细胞和单核细胞中。成熟的MPO由两个亚单位聚合而成，每个亚单位由一个59-64kDa的重链和一个14kDa的轻链构成，每个亚单位中含有一个共价结合的血红素，具有MPO特有的绿色光谱特性。MPO能催化过氧化氢与氯的反应产生次氯酸，具有很强的抗微生物作用，在机体产生和调节炎症反应方面发挥作用。然而，MPO催化反应生成过量的氧化剂时，会导致氧化应激和氧化性组织损伤。 髓过氧化物酶的活性与人类多种疾病的发生、发展密切相关，神经炎症疾病方面包括多发性硬化症，阿尔茨海默氏症，帕金森氏症和中风等。其他炎性疾病如慢性阻塞性肺病，囊肿性纤维化，动脉粥样硬化，炎症性肠�。膊。鲂∏蛩鹕撕屠喾缡亟谘�。肺癌也显示和MPO水平升高有关。此外，根据之前的研究显示，MPO水平和心血管疾病密切相关。然而，这些以往的研究都没有涉及MPO同型和/或亚型与特定的疾病状态存在具体相关。目前，用于检测MPO的方法有酶联免疫吸附法、光激化学发光检测法、流式细胞仪测定法、毛细管电泳法等。然而这些方法均未涉及到对MPO同型或亚型的检测。因此，急需一种专门检测MPO同型或亚型的检测方法，用于鉴定过敏症、炎症、心血管疾病或自身免疫性疾病的状态。

发明内容
本发明的目的之一是提供一种高特异性的检测分析方法，特别是一种高特异性和高灵敏度的检测MPO同型或亚型或其组合物中的至少一种的方法，包括(a)所述MPO同型、亚型或其组合物中的至少一种能够和所述MPO同型、亚型或其组合物的特异性结合的包被抗体结合。(b)所述MPO同型、亚型或其组合物中的至少一种与一个标记抗体中结合；从而辅助诊断或预后过敏性疾病、炎症性疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病的状态；本发明进一步提供用于实施所述方法的试剂盒。下面提供一种新的诊断或预后分析MPO同型或亚型的方法。本发明公开了一种评估患者是否有过敏性疾病、炎症性疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病的诊断实验。另一方面，公开了一种评估患者发展为过敏性疾病、炎症疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病风险的预后检测方法。可以确定的是，所述方法包括不同的检测实验样本中的MPO同型或亚型的方法。尽管一些方法、设备和材料和本发明所述相似或相同，能够用于实现本发明权利要求所述的方法，但是，本发明所述的是特殊的方法、设备和材料。本发明提供了一种辅助诊断或预后过敏性疾病、炎症疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病状态的方法，通过检测样本中至少一种，而不是全部MPO同型或亚型或其组合，所述方法包括(a)所述MPO同型或亚型或其组合中的至少一种，而不是全部，与所述特异性结合包被抗体发生特异性结合反应。(b)所述MPO同型或亚型或其组合中的至少一种，而不是全部，与所述标记抗体结
口 ο
所述MPO同型或亚型或其组合能够被所述的具有MPO同型或亚型或其组合中的至少一种特异性结合的标记抗体检测，或和标记过的MPO同型或亚型或其组合中的至少一种竞争性结合。进一步的，标记抗体与所述MPO同型中的特异性结合，但是不能和MPO亚型结
入
口 ο进一步而言，对MPO同型或亚型或其组合中的至少一种的检测是和过敏性疾病、炎症疾病、心血管疾病或自身免疫疾病相关的。所述炎症疾病主要指肠炎症疾�。凰鲎陨砻庖咝约膊∈羌毙圆ド⑿阅约顾柩祝⒌疑喜。恐毙约怪祝沽字固遄酆险鳎偕习云堆陨砻庖咝愿窝祝骨患膊。寺薅鞑〉奶悄虿。疟臼喜。胤⑿匝“寮跎傩宰像埃彀呃谴喾⑿杂不ⅲ刂⒓∥蘖Γ由窬祝祓宕⑿缘ㄖ愿斡不喾缡亟谘祝稍镒酆险鳎陨砻庖咝匀苎云堆蛭じ衲扇庋恐字械囊恢�。本发明所述包被抗体为单克隆抗体、单一特异性多克隆抗体或抗体结合片段。进一步而言，包被抗体是偶联到具有蛋白偶联表面的固相支持物上的，这种具有蛋白偶联表面的固相支撑物可以是一种微孔板，一种胶体金粒子，一种氧化铁离子或聚珠。所述标记抗体为单克隆抗体、单一特异性多克隆抗体、抗体结合片段中的一种，进一步而言，标记抗体包括一种可检测标记。可检测标记为化学发光剂、比色剂、酶、酶反应的底物、荧光剂或放射性同位素。所述酶可以是碱性磷酸酶，淀粉酶，荧光素酶，过氧化氢酶，β -半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，己糖激酶，辣根过氧化物酶，内酰胺酶，脲酶，苹果酸脱氢酶中的一种。所述诊断和预后的方法是免疫分析法，进一步而言，所述免疫分析是指固相免疫分析。所述测试样品可以是全血、血浆、血清、细胞提取物或组织提取物中的一种。本发明的另一个目的是提供一种辅助诊断或预后过敏性疾病、炎症疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病的试剂盒，试剂盒测量样本中MPO同型或亚型或其组合物中的至少一种。所述试剂盒包括能够和MPO同型或亚型或其组合物中的至少一种特异性结合的包被抗体和标记抗体。所述标记抗体是一种能够和MPO同型或亚型或其组合物中的至少一种结合，并能直接或间接与可检测标记结合，从而检测所述MPO同型或亚型或其组合物中的至少一种。本发明所述试剂盒辅助诊断或预后的疾病状况为过敏性疾病、炎症疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病。其中炎症性疾病主要是指肠炎症疾病。自身免疫性疾病为急性播散性脑脊髓炎，阿狄森氏病强直性脊柱炎，抗磷脂抗体综合征，再生障碍性贫血，自身免疫性肝炎，腹腔疾�。寺薅鞑。悄虿。纬鲅鲅鬃酆险鳎疟臼喜。低承院彀呃谴喾⑿杂不ⅲ刂⒓∥蘖Γ由窬祝祓宕⑿缘ㄖ愿斡不喾缡亟谘祝稍镒酆险鳎陨砻庖咝匀苎云堆蛭じ衲扇庋恐�。本发明所述试剂盒也包含一种定量检测样本中至少一种MPO同型或亚型或其组合物的校准品。所述校准品可以是一种或更多预制的校准品，也可以是一种能够在溶液中重组形成一种或更多校准品的物质。本发明所述试剂盒包含一种包被抗体，所述包被抗体为单克隆抗体、单一特异性多克隆抗体或抗体结合片段。进一步而言，包被抗体偶联到具有蛋白偶联表面的固相支持物上，这种固相支持物包括但不限于一种微孔板、一种胶体金粒子、一种氧化铁离子或一种聚珠。所述标记抗体为单克隆抗体、单一特异性多克隆抗体或抗体结合片段。所述标记抗体可以结合MPO同型或亚型中至少一个。进一步而言，标记抗体还包括可检测的示踪物。 可检测示踪物为化学发光剂、比色剂、能量转移剂、酶、酶反应的底物、荧光剂或放射性同位素。其中酶可能是碱性磷酸酶、淀粉酶、荧光素酶、过氧化氢酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、己糖激酶、辣根过氧化物酶、内酰胺酶、脲酶或苹果酸脱氢酶。髓过氧化物酶本发明提供一种确定哺乳动物实验样本MPO同型或亚型水平的方法，用MPO水平作为诊断因子来诊断或预后过敏性疾病、炎症疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病状态。特别的，成熟和无活性的MPO不能被检测。在这些方法中，检测出MPO同型或亚型水平与正常人的样本相比改变或升高，可作为诊断或预后疾病病情的分析因素。本发明中所用术语“水平升高”或“较高水平”是指MPO同型或亚型的水平，水平高于正常或者质控的对照样本。本发明所述“质控水平”(或者正常水平)是指没有患疾病状态的患者的样本中检测出的MPO同型或亚型水平的范围。“水平升高”是指MPO同型或亚型水平在质控水平范围之上。所述包被抗体是指能够在适当的条件下与MPO同型或亚型结合的任何分子或分子复合体。一般来说，结合具有足够的特异性排除与其他配体发生的结合。本发明中的“标记抗体”是一种抗体或配体结合的片段或类似物。“标记抗体”也可能是能够与MPO同型或亚型结合其他蛋白质、核酸或类似物。包被抗体优先或特异性的结合特点，体现于在相同或相似的结合条件下只和一个MPO异构体结合，不与第二个(不同的)MPO同型或亚型结合。具体而言，标记抗体可能有一个MPO亚型高亲和力，或一个、两个或三个MPO亚型的高亲和力，但对其他抗原的亲和力显著降低，包括其他MPO同型或亚型。例如，一种抗体可能结合到一个MPO的亚型或两个、三个MPO的亚型，比其他非目标MPO形式高至少5倍、10倍、20倍、或100倍亲和力。根据本发明的一个具体实施方案，MPO同型或亚型或组合的中至少有一个的水平变化与过敏性疾病、炎症疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病的状态相关联。MPO同型或亚型或组合水平的改变，和测试样品的病情存在关联，可作为所述病情未来的发展的预后指标。自身免疫性疾病包括但不限于急性播散性脑脊髓炎、阿狄森氏病、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、腹腔疾病、克罗恩病、糖尿病、肺出血肾炎综合征、桥本龙太郎的病、特发性血小板减少性紫癜、红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、视神经炎、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、类风湿关节炎、Reiter综合征、干燥综合征、自身免疫性溶血性贫血或韦格纳肉芽肿。检测样本的制备“测试样品”、“病人样本”或“体内样本”在本发明中可以互换使用。诊断方法中的测试样品为全血、血浆、尿液、血清、人体组织提取物或细胞提取物。全血可以使用标准的临床程序从个人或测试患者获得。血浆可从全血样本离心抗凝后获得。离心后底层为浓缩红细胞，中间的白细胞层和上层血清。血清可以通过离心未加抗凝剂的全血获得。全血允许离心前有一定的血凝块。黄色或淡黄色液体就是离心获得的血清。白细胞可以通过多种方法从全血样本中分离获得，包括浮力密度离心法。
试验样品，也可能是临床细胞学标本(如细针乳腺活检或细胞学肺部组织标本)或组织样本如，胃癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，胰腺癌，心脏组织样本。组织样本可以是新鲜的也可以是冷冻的。试验样品可以从从人或商品性的哺乳动物获得，哺乳动物包括但不限于牛或马。测试样本也可以是宠物，包括但不限于猫或狗。本发明的抗体MPO同型或亚型可以用来培养多克隆抗体和单克隆抗体。本发明所述的抗体，优先与MPO同型或亚型结合，不和成熟的MPO结合。此外，在下面将详细讨论，抗体可能是泛特异性抗体。“泛特异性抗体”是指一种抗体，选择性结合相关的多肽组中至少两个成员(如MPO同型或亚型)，不选择结合组外相关多肽。此处所用的“抗体”，是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分。这种抗体包括，但不仅限于多克隆抗体，单克�。ヌ匾煨远嗫寺】固澹倏固澹逗咸澹チ矗現ab、Fab’和F(ab’)2片段、Fv和Fab表达库。在一般情况下，抗体分子是从人类相关的任何免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgE和IgD获得的，这些分子由于分子中的重链的本性不同而各不相同。某些种类的分子又可分为相应的亚类，如IgGl，IgG2等。此外，在人类中，轻链可以是K链或一个λ链。此处所述抗体包括所有这些类，子类和类型的抗体的所有类型。更好的，一个抗体分子最好具有较弱的或不能结合无MPO同型或亚型表达的细胞。在某种情况下，抗体还显示不能和成熟的MPO结合。抗体分子和目标抗原的反应活性可以通过本发明所述的方法以任何合适的方式来确定。给单个的标记抗体进行标记是一种可行的方案。探测分子可能直接或间接产生检测信号，最好是可定量的信号。标记抗体的结合可以是共价键、肽键或非共价键等。通过肽键的结合可能是抗体和标记抗体基因融合编码的重组表达。确定抗体分子结合实际模式不是本发明的特点，技术人员可根据他们的喜好和通用知识来选择合理的方式。已经证明抗体片段可以执行结合抗原的功能。此处所用“抗原结合片段”，包括但不限于(i)Fab片段，包括VL、VH、CL和CHl结构域；(ii)FD片段包括VH和CHl结构域；(iii)Fv片段包括单一抗体的VL和VH结构域；(iv) dAb片段包括VH的结构域；(V)独立的CDR区域；(vi)F(ab’ )2片段；(vii)单链Fv分子(scFV)，其中VH结构域和VL结构域由一个肽键链接，它允许两个域形成一个抗原结合位点；(viii)双特异性单链抗体二聚体和( χ)通过基因融合构建的双体、多价体和多特异性片段。MPO同型或亚型或其片段可作为一种抗原，另外可以用来制备与抗原表位进行免疫特异性结合的抗体，使用标准技术制备多克隆和单克隆抗体。抗原肽包括至少10个氨基酸残基，或15个氨基酸残基，或20个氨基酸残基，或30个氨基酸残基。“抗原表位”或本“抗原决定簇”在本发明中可以互换使用，指抗体中能够被特定的抗体识别并特异性结合的部分。当抗原是一种多肽，抗原表位可由一种蛋白质的连续的氨基酸和不连续的氨基酸折叠构建形成的三级结构。由连续的氨基酸形成的表位通常在蛋白质变性后能保留下来，而由折叠形成的表位通常在蛋白质变性后失去活性。抗原表位通常是一个包括至少3个，通常是5个或8-10氨基酸的一个 独特的空间构象。抗体“选择性结合”或“特异性结合”的意思是抗体应答反应或结合更加频繁，更加迅速，持续周期更长，亲和性更强。“选择性结合”或“特异性结合”的意思是，例如，抗体结合的蛋白分子量至少大约O. ImM，但更通常至少约luM。“选择性结合”或“特异性结合”的意思是抗体结合蛋白有时分子量至少大约O. IuM,或者更好至少大约O. OluM。这里所用的术语“非特异性结合”和“背景结合”，当用在抗体和蛋白或肽键的相互作用不依赖于特殊结构(即，抗体是和一般的蛋白结合，不是特定抗原结构如抗原表位)。MPO同型或亚型的特异性抗体可以通过文献中报道的一些方法获得，包括盘选分离法和亲和层析的方法。对于多克隆抗体的制备，可用MPO同型或亚型、合成的变异体、衍生物或者片段注射免疫实验动物(如兔，羊，老鼠或其他哺乳动物)来获得。合适的免疫原包括，自然生成的MPO同型或亚型免疫原，具有的MPO同型或亚型免疫原性的化学合成多肽，或具有的MPO同型或亚型免疫原性的重组表达多肽的或其碎片。此外，该蛋白可能结合对被免疫的哺乳动物中的具有免疫原性的另一种蛋白质。这种免疫蛋白包括但不限于锁孔戚血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。制备程序还包括一种佐剂。用于增强免疫应答的佐剂包括但不仅限于，矿物凝胶(例如，氢氧化铝)，单磷酸类月旨，合成海藻糖)。MPO同型或亚型多克隆抗体可以根据已知的方法来制备。多克隆抗体可以通过免疫动物(如兔子，大鼠，小鼠，驴等)来制备，通过多个皮下或腹腔注射相关的MPO同型或亚型(纯化的多肽片段，全长重组蛋白，融合蛋白等)，随机性地结合到锁孔戚血蓝蛋白(KLH)，血清白蛋白等，在无菌生理盐水中稀释，并结合佐剂(如完全或不完全弗氏佐剂)，以形成稳定的乳液。多克隆抗从免疫动物的全血、腹水或相关体液中提取获得。采集的血液经过凝固，血清倾析，离心澄清，抗体检测。多克隆抗体可以从血清或腹水中纯化，文献中报道的已知的标准方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶电泳、透析等。最终的哺乳动物血清中制备出来的多克隆抗体中为最终的抗体制备做准备，单个的淋巴细胞可以从脾、淋巴结或外周血中获得，用于提供单系的单克隆抗体。在一些实施方案中，淋巴细胞取自于脾脏。本发明中所使用的“单克隆抗体”(mAbs)，是指一个只包含一种抗体分子的抗体分子群，所述抗体由一个唯一的轻链基因的产物和唯一的重链基因产物的组成。群体中所有单克隆抗体分子的决定区域都是相同的，单克隆抗体包含一个抗原结合位点，能通过唯一的结合亲和力与特定抗原表位发生免疫反应。取自于被免疫的哺乳动物的淋巴细胞和能无限增殖的肿瘤细胞系(例如骨髓瘤细胞系)融合形成杂交瘤细胞，杂交瘤细胞能无限增殖并能产生淋巴B细胞的遗传编码抗体。杂交瘤细胞通过筛选、稀释、培养被分离成单一细胞株，每个细胞株含有单个抗体的基因。杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和生长，该培养基包含一种或多种物质，这些物质能够抑制未融合的骨髓瘤细胞的生长和存活胞。本发明中涉及的试剂、细胞系和杂交瘤形成、筛选和生长的培养基都可以通过商业渠道购买到，标准制备过程也已确立。一般来说，杂交瘤细胞生长的培养基，被用来分析单克隆抗体的制备。具体而言，通过杂交瘤细胞产生的具有特异性结合能力的单克隆抗体通过免疫沉淀或体外试验，如放射免疫法(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)来鉴定。在确定杂交瘤细胞产生的抗体具有所需的特异性、亲和性和/或活性后，杂交瘤细胞株有限稀释成亚克隆继续培养，亚克隆杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体可以从培养基上分离出，或者腹水或血清中纯化提�。� 提取方法可以是基磷灰石层析法、凝胶电泳法、透析法或亲和色谱法。所述“修饰抗体”指任何与MPO同型或亚型或组合发生免疫反应的抗体或抗原结合片段或重组子，其恒定区的片段至少有一部分被删除或者修饰过，以满足所需要的生物特性，同时具有完全抗体的结合特异性。具体而言，本发明所述的修饰抗体恒定区的片段至少有一个被删除。现已有多种技术来制备抗体片段。传统上，片段是由完整的抗体水解衍生而来。然而，现在可以直接通过重组宿主细胞来生产片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可以在大肠杆菌中表达和分泌，从而灵活地生产出大量的片段。另外，Fab’-SH片段可以直接从大肠杆菌中回收，化学偶联形式形成F(ab’)2片段。F(ab’)2片段的另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养基中分离。生产抗体片段的其他技术对于有经验的从业者来说是轻而易举的。一个选择的抗体，可以是单链Fv片段(scFv)。Fv和sFv是唯一的具有完整结合位点的缺乏恒定区的片段种类，有完整的结合位点的片段，因此，适用于在体内使用过程中减少非特异性结合。sFv融合蛋白可以构建来产生的效应蛋白sFv。抗体片段，也可能是一个“线性抗体”，这种线性的抗体片段，可能是单特异性或双功能。应该理解，本发明的组份和方法对诊断多种过敏性疾病、炎症疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病的状态是十分有用的。如上所述，本发明所述修饰抗体能够和MPO同型或亚型发生免疫反应。更为普遍地，本发明具体实施例中，可用的修饰抗体可以从能够和MPO亚型或别的形式发生反应的任何抗体中获得或衍生。此外，抗体的母体或前体，或片段，被用来产生本发明所述的修饰抗体的可以是小鼠、人、嵌合体、或灵长类动物。在其他具体情况下，本发明所述的修饰抗体也可以是具有改变的恒定区的单链抗体结构。因此，任何与此处所述一致的抗体修饰方法均适合本发明。在其他适合的具体情况中，使用传统的程序，DNA编码的单克隆抗体被迅速分离和测序(例如，通过使用具有特异性结合能力的寡核苷酸探针来基因编码小鼠抗体的重链和轻链)。这种分离和亚克隆的杂交瘤细胞作为这种DNA的来源。一旦被分离，DNA就会被转入表达载体，然后转移入原核的或真核的宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，否则不产生免疫球蛋白。更特别的是，被分离出的DNA(可按照本发明所主方法进行修饰)可能被用来克隆抗体的恒定和可变区序列来制备抗体，这些均纳入本发明的内容，作为本发明的参考。从本质上讲，这需要从选定的细胞中提取RNA，转换成cDNA，使用免疫球蛋白特异性引物进行PCR扩增。正如将在下面更详细地讨论，表达所需的抗体的转化细胞会大量生产为临床和商业提供所需的免疫球蛋白。多核苷酸编码一种单克隆抗体可以用重组DNA技术来修饰抗体。具体而言，轻链和重链的恒定结构域，例如，鼠单克隆抗体可被取代为，I)人类抗体的恒定区而生成嵌合抗体；或2)非免疫球蛋白多肽而生成一个融合抗体。具体而言，不变的区域被截断或删除，以产生所需的单克隆抗体的抗体片段。可变区的直接点突变或高密度的基因突变，可用于优化单克隆抗体的特异性和亲和力等。也可以这样理解，DNA编码抗体或抗体片段，也可以从抗体噬菌体库衍生。有很多出版物已经描述通过链替换制备具有高亲和力的人抗体产物，以及组合感染和体内重组来构建大容量噬菌体库。这些给传统杂交瘤技术提供了可选的分离和克隆单克隆抗体的方法，在本发明所涉及的范围之内。本发明的其他体现包括在转基因动物(如小鼠)中产生大量人类抗体，这些抗体无内源性免疫球蛋白产物。例如，抗体重链中纯合子的缺失和生殖系突变的小鼠完全抑制内源性抗体生产。人类免疫球蛋白基因组如果转移到这种生殖系突变小鼠，将面临无法生产人类抗体的挑战。本发明参考了另一种使用重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠产生人抗体 的方式，人类抗体的遗传物质也可以被分离和制备。它也可以进一步理解为，本发明的范围包括本发明所述的DNA序列的所有等位基因、变异体和突变体。根据本发明的具体实施例，存在制备针对本发明中涉及的多肽的单链抗体的方法。此外，存在构建Fab表达库，这种Fab片段的单克隆抗体能快速、有效识别并特异性结合MPO同型或亚型、或衍生物、片段、类似物或同源基因等。本发明的目的在于，修饰抗体包括任何类型的MPO同型或亚型相关抗体的可变区域。可变区可以从任何类型哺乳动物衍生出来的，这些哺乳动物可诱导产生免疫应答并生成抗MPO同型或亚型的免疫球蛋白、。因此，修饰后的抗体可变区可以是人类、小鼠或非人类灵长类动物(如猕猴，猕猴等)。在一些具体实施例中，，修饰后的免疫球蛋白的可变区和恒定区均源于人类。在其他实施例中，免疫球蛋白(通常取自动物)的可变区通过基因工程改善成具有更好的结合属性或降低了免疫原性的分子。在这方面，本发明的具体实施例中的可用的可变区可能是人源化的，或氨基酸序列发生过修饰的。人类抗体也是可以产生的。例如，现在可以生产转基因动物(如小鼠)，这些转基因动物在缺乏内源性免疫球蛋白的产生的情况下通过免疫能生产完整人类抗体组分。例如，抗体重链连接区基因的纯合子缺失，和完全丧失内源性抗体生产的生殖系突变小鼠。人类免疫球蛋白基因芯片的转移进入种系突变小鼠，将生成相应抗原的人类抗体。本发明还包括双特异性抗体，专门识别MPO同型或亚型。双特异性抗体是指能够特异性识别和结合至少两个不同的表位的抗体。不同的表位能够存在于同一个分子(例如相同的MPO同型或亚型)上，或者、不同的分子上，例如，抗体可以特异地识别和结合多个MPO同型或亚型。双特异性抗体可以是完整的抗体或抗体片段。多效价抗体如三特异性抗体也可考虑。另外，噬菌体展示技术可通过未接受免疫接种的供体内免疫球蛋白可变(V)区域结构与基因所有组成成分，来体外生产人类抗体和抗体片段，。根据这项技术，抗体的V结构域基因克隆到一个的丝状噬菌体外壳蛋白基因，在噬菌体颗粒表面上表现出抗体片段的作用。由于丝状噬菌体中含有单链DNA的噬菌体基因组，基于抗体的功能特性的选择，也同时选择抗体基因编码。因此，噬菌体类似于B细胞的某些特性。噬菌体展示技术，可以以各种不同的形式来完成。V-基因可以用于噬菌体展示技术。本发明所展示的技术可用于生产特异性结合MPO同型或亚型的单链抗体。此外，本发明所述方法可用于Fab表达库的构建，从而快速和有效的鉴别具有MPO同型或亚型，或衍生物、片段、类似物或同源基因特异性的单克隆Fab片段。可以用来制备MPO同型或亚型的抗体片段的技术包括但不限于(a)胃蛋白酶水解抗体分子产生F(ab’)2片段；(b)减弱F (ab’)2的二硫键生成Fab片段；(c)木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段，及(d)Fv片段。它可以进一步理解为，尤其是在抗体片段的情况下，通过修饰抗体以增加其在血清半衰期。通过抗体片段中合适区域的突变将受体结合表位混合到抗体片段，或通过将表位混合到多肽，然后融合到抗体片段的一个末端或中间部位(例如，通过DNA或多肽合成)。异源偶联抗体也属于本发明所涉及的范围内。异源偶联抗体是由两个共价结合抗体组成。抗体可通过蛋白的化学合成的方法在体外制备，包括交联剂。例如，免疫毒素可通过二硫键 交换反应或者硫醚键来构建。所述技术用于生产所需的特异性抗体。例如，可以生成一个对所有MPO同型或亚型的泛特异性抗体。此外，也可以制备对一个或多个MPO同型或亚型具有特异性的抗体。可以制备一个对MPO亚型I和亚型3具有特异性的抗体，但很少或根本不能和亚型2反应。可以生成一个对MPO亚型具有特异性的抗体，但有很少或根本不能和任何亚型发生反应。也可以是只能对一个MPO同型或亚型具有特异性的抗体。可以使用已知的方法，如酶联免疫吸附试验、酶联免疫斑点法、免疫印迹来鉴别所需的特异性抗体。免疫分析测定利用包被抗体和一个标记抗体来定量捕获的分子的检测系统是众所周知的。本发明所示的免疫分析的方法包括但不仅限于，放射免疫法(RIA)，荧光免疫法(FLA)，化学发光法(CA)，酶联免疫吸附试验(ELISA)等。免疫分析可以是固相分析和液相分析。一方面，免疫测定法可设计自动化，高通量的仪器。例如，贝克曼公司Access 系列，非常适合完成本发明的免疫测定法。Access 免疫测定系统允许通量可达每小时100次的快速测试，通过一个反应容器装载机，拥有长达3小时的连续样本处理的能力。另一方面，包被抗体的目标分子的数量可以采用竞争结合实验来确定。在一个实施例中，包被抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的MPO同型或亚型或其组合物用于确定分析物的浓度。测试样品中至少有一个MPO同型或亚型竞争包被抗体的结合位点。经洗涤去除未结合的标记物后，HRP的显色信号可以显示结果。HRP的检测可通过测量HRP与热基底物的反应在450nm处的吸光度。测试样品中MPO同型或亚型或其组合的浓度与信号强度成反比的信号表不。对于固相免疫分析，包被抗体(如单克隆抗体)被固定在固相支持物上。在检测程序前包被抗体通过吸附法、非共价结合或共价偶联的方法固定在固相支撑物上(例如，用戊二醛或碳化二亚胺法交联，反应激活剂，硝酸或还原剂及的免疫沉淀法。固定使用的固相可能是任何惰性载体或不溶于水的支撑物，支持物的形式可以是表面剂、颗粒，多孔基质等。常用的支持物包括薄板，葡聚糖凝胶，聚氯乙烯，塑料珠，用聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯制成的试验板或试管以及颗粒材料，如滤纸，琼脂糖，交联葡聚糖和其它多糖。包被抗体也被固定在支持物上，如珠聚合物，胶体金属或氧化铁粒子。珠可以是塑料，玻璃，或任何其他合适的材料，通常在1-20微米范围内。在一些具体实施例中，使用顺磁性珠。胶体金与银粒子和氧化铁粒子的胶体金属颗粒，可以是通过商业化的或已知的技术制备的。另外，非水溶性基质如溴化氰可激活的碳水化合物，可用来固定包被抗体。一方面，包被抗体固定在微孔板，另一方面，固相是一个多孔板，可以一次分析多个样品。固相板包被包被抗体，通过非共价键或共价相互作用或物理连接。如果是共价键形成，板或其他固相培养与交联剂和包被抗体一起孵育。
将包被抗体粘附在固相支持物上的常用的交联剂包括1，I- 二-氮-2-乙苯，戊二醛，N-羟基酯，同基双功能亚氨酸酯，双功能顺丁烯二酰亚胺。涂层板封闭液封闭，封闭液没有结合特异性，封闭液渗透到未被结合的位点以阻止外在的自由配体结合到微孔中。适当的阻断剂包括，明胶，牛血清白蛋白，卵白蛋白，酪蛋白，脱脂乳。封闭在常温下进行，需要约1-4小时，一般约I. 5至3小时。包被和封闭后，对校准液(已知浓度的MPO同型或亚型，作为校准)或检测样品进行分析，适当稀释，添加到固定板上。通常情况下，稀释率约为5-15% (V/V)。包被抗体的数量相对于校准品足够多，以便于给出良好的信号结果。但并不是摩尔数高于样品中MPO同型或亚型s或其组合的最高水平。为了有足够的灵敏度，测试样品量应增加，以致固定的包被抗体摩尔浓度比适当稀释后测试样样品中游离分析物最大摩尔浓度高，这种预期的最高水平，主要取决于样品中MPO同型或亚型的浓度和被分析病人的临床状况之间的相关。一般来说，样品和固定的包被抗体的孵育条件，，选择以最大限度地提高分析灵敏度的检测，以最大限度地减少分解，并确保分析物样品中有足够的分析物与固定的包被抗体结合。据了解，选择最佳的反应条件，一般只需要常规的实验。孵育是在相当恒定的温度范围，从0°C至约40°C时，一般室温来完成的。孵化的时间一般不超过10个小时左右。如果为防止降解MPO同型或亚型而添加蛋白酶抑制剂，孵育持续时间可能会更长。 标记抗体可以是任何可检测到的示踪物，这些可检测到的示踪物不干预包被抗体和检测试剂的结合。合适的示踪物可以是能够直接检测的，如荧光，化学发光物，色度剂和放射性标记，以及需要通过反应或衍生才能被检测到的基团，如酶。这些示踪物的例子包括放射性同位素32P，14C，125I，3H，和1311，荧光基团如稀土荧光螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰基，伞形花内酯，萤火虫荧光素酶的细菌荧光素酶，荧光素，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，淀粉酶，过氧化氢酶，内酰胺酶，脲酶，己糖激酶，苹果酸脱氢酶的P-半乳糖苷酶，糖化酶，溶菌酶，糖类氧化酶，如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环，如尿酸和黄嘌呤氧化酶氧化酶，采用过氧化氢的氧化染料前体的酶，如HRP，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/亲和素，生物素/链霉亲和素，生物素/链霉亲和，自旋标记，噬菌体标签，稳定的自由基，诸如此类。示踪物和标记抗体结合，如抗体，在免疫测定技术中是一个标准的操控程序。传统的方法是蛋白质或多肽共价结合到示踪物部分。例如偶联试剂戊二醛，二亚胺，顺丁烯二酰胺，双重氮化联苯胺等，可以用上述荧光、化学发光、酶来标记抗体。荧光或化学发光的示踪物可将灵敏度放大至约5-10pg/mL。不是作为一种限制，与包被抗体结合的MPO同型或亚型分析物的数量，可以通过从固相支持物上洗脱未结合的标记抗体，测量与分析物结合的标记抗体上示踪物的数量来检测。示踪物可以是一种酶。检测信号的数量和被捕获的分析物正相关。例如，当HRP为示踪物，颜色是通过量化检测光密度值(0D值)在450nm处的吸光度来实现。另一方面，对与包被抗体结合的分析物可间接测定。本发明所述方法还提供了一种定量个体样本中MPO同型或亚型水平的方法，和所述水平与疾病状况的相关性。一方面，确定样本中的个体MPO同型或亚型的相对水平，与特定疾病的存在或发生倾向的相关性。例如MPO亚型X水平的升高和亚型Y水平的降低预示疾病状态I的存在或将来的发展趋势，而亚型Y的水平的升高和亚型Z的水平的升高预示疾病状态2的存在或将来的发展趋势。在其他情况下，例如，亚型X和亚型Z，预示疾病状态3的存在或将来的发展趋势。可以认为，三种MPO同型或亚型的水平和/或比率可以被 用来预测疾病的存在或未来的病情发展。试剂盒本发明所述的测定方法，可以以试剂盒的形式提供。这种试剂盒是一个包装组合，由以下基本要素组成(a)至少有一个包被抗体，该包被抗体能够和至少一个MPO同型或亚型结合；(b)至少有一个标记抗体，可以和MPO同型或亚型中至少一种结合，或者和一个标记的MPO同型或亚型或其组合结合；(c)如何使用这些试剂执行检测方法的说明书。一方面，该试剂盒可进一步提供MPO同型或亚型的特定校准，用于诊断过敏性疾病、炎症疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病的条件的相关性。该校准器通常具有定量MPO同型或亚型多肽或其组合的功能，它能够从自然表达MPO同型或亚型的细胞中分离出来或使用现有的技术重组获得。另一方面，该试剂盒还包括包被抗体的固相支持物，这种固相支持物可作为一个单独的元素或作为包被抗体已经固定的元素。所以，试剂盒中的包被抗体或者已经被固定在固相支持物上，包含在试剂盒中由客户来执行固定，或者作为试剂盒一个独立的组分。标记抗体可能是已标记的分子(如抗体)，或未标记的通过标记的抗体来检测的分子，。标记物如果是一种酶，试剂盒通常包括酶所需的底物和辅助因子，标记物如果是一种荧光染料，试剂盒包括染料前体；标记是生物素，如抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白，则偶联到一个载体上。该试剂盒进一步包括一份说明书，描述如何使用检测试剂盒。


附图为以MPO亚型的特异性单抗作为包被抗体的试剂盒的标准曲线图。
具体实施例方式以下结合实施例进一步阐述本发明。本实施例通过酶联免疫技术来实施本发明方法，具体选用辣根过氧化物酶(HRP)作为标记抗体的标记物，用HRP底物TMB作为显色剂。试剂盒包括固相板、酶标记的MPO亚型标记抗体、MPO校准品、TMB显色剂、终止液、洗涤液。I.制备MPO亚型单克隆抗体分别用纯化的MPO亚型蛋白免疫纯系小鼠，小鼠血清产生相应的抗体时，即可将小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合。利用HAT选择杂交瘤细胞，并用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测。对于检测抗体阳性的杂交瘤细胞应用有限稀释液进行克�。北４嫜粜韵赴辏肂ALB/c纯系小鼠制备大量的单克隆抗体，同时对抗体特异性的鉴定、识别抗原表位的鉴定、亲和力的鉴定及配对试验，筛选出效果最好的一对细胞株。将筛选到的细胞株重新植入小鼠腹腔中，过5-6天取出腹水，利用硫酸铵盐析及亲和层析纯化得到的单克隆抗体。2.微孔包被MPO亚型单克隆抗体包被到96孔I型微孔板上。在O. 2M NaP04，PH值为6. 5的缓 冲液中制备O. 01mg/Ml MPO亚型单克隆抗体溶液。将100 μ L抗体溶液添加到各微孔板中，并在4°C温育整夜。然后除去抗体溶液，用300 μ L IOmM PH值7. 4的磷酸盐缓冲液冲洗各微孔，添加150μ L含1%牛血清蛋白溶液，PH值7. 4的IOmM磷酸盐缓冲液到各微孔中，微孔板在室温中温育整夜。除去含1%牛血清蛋白溶液，往各微孔中添加250μ L含2. 5%蔗糖溶液，PH值7. 4的磷酸盐缓冲液，温育4小时。除去蔗糖溶液，真空干燥微孔板整夜。微孔板保持干燥。3.辣根过氧化物酶的结合使用前，用IL PH值9. 6的O. OlM碳酸氢钠缓冲液透析5mgMP0亚型单克隆抗体，2-8°C下整夜。此外，7. 5mg辣根过氧化物酶溶解于I. 9L蒸馏水中，混合式逐滴将O. 4mLO. IM的高碘酸钠溶液加入辣根过氧化物酶中。在暗处混合25分钟，然后用ILPH值4. 3的ImM醋酸盐缓冲液透析该溶液，2-8°C下整夜。之后将透析的辣根过氧化物酶溶液添加到纯化的MPO亚型单克隆抗体中，该溶液在室温下暗处混合3-4小时。将定量的硼氢化钠溶液添加到反应混合物中，并置于2-8°C两小时，期间不时混合。最后，用IL PH值7. 2，含O. 85%氯化钠的O. 05M磷酸盐缓冲液透析该溶液。再用S-300柱进一步纯化该结合物溶液。4.标准曲线的制备用胎牛血清将MPO 亚型稀释到 0，I. 5，3. 0，6. 0，12，24，48，96，及 192ng/ml.将稀释好的标准品分别取100 μ L加入到各微孔板中。室温下在3，OOOrpm的旋转振荡器上振荡温育60分钟。除去温育的混合物，用蒸馏水冲洗微孔5次，除去所有残留水滴。往各孔中添加HRP标记的MPO亚型标记抗体，室温下在3，OOOrpm的旋转振荡器上振荡温育60分钟。除去温育的混合物，用蒸馏水冲洗微孔5次，除去所有残留水滴。添加IOOyL ΤΜΒ。室温下在3，OOOrpm的旋转振荡器上振荡温育20分钟。添加100 μ L IN HCL终止显色反应。在15分钟内用酶标仪在450nm处读取吸收值。标准曲线如图所示。5.终止液和洗涤液的制备量取83. 3mL浓盐酸缓慢加至916. 7mL纯化水中，充分溶解既得IN HCL0量取200mL0. 5M磷酸钾缓冲液添加至795mL的纯化水中，充分混匀后，加入85. Og NaCL充分溶解，再量取5mL Tween 20加入上述溶液中充分溶解，调PH至7. 2。使用时用蒸馏水稀释20倍。6.检测样本中的MPO亚型
于晨起7 10时对患者进行空腹抽前臂血，立即加入EDTA和/或肝素等抗凝剂，离心后取血清置于_20°C备检。将包被好的固相板编号，放置于固定的位置。在每个微孔中加入100 μ L的样本，室温振动孵育2小时，转速为750rpm。用洗涤液冲洗微孔板4次，再用蒸馏水冲洗I次，并在干净的吸水纸将残留的水分扣干。在每个微孔板中加入100 μ L的MPO标记抗体，室温振动孵育2小时，转速为750rpm。用洗涤液冲洗微孔板4次，再用蒸馏水冲洗I次，并在干净的吸水纸将残留的水分扣干。每孔中加入1000 μ L的TMB试剂，室温暗处振动孵育20分钟，转速为750rpm。在每孔中加入100 μ L的盐酸终止液，轻轻混匀20秒，在20分钟内，于Α450处读取吸光度。7.取本实施例所诉的试剂盒，对20份急性冠状动脉综合症患者血样和15份正常人血样进行检测。结果显示20份急性冠状动脉综合症患者血样中检出MPO亚型，15份正常人血样中14份未检出MPO亚型的存在，I份血样中含有微量MPO亚型。说明本实施例试剂盒具有良好的特异性和灵敏度。 虽然本发明的具体情况已经在上述具体实施例中加以描述，但是应该理解，这些仅仅是以具体实施例的形式展现给专业内同行，并不是限制其适用范围和方式。它将给技术领域内的人士揭示各种形式和细节的变化而不分离本发明的精神和范围。因此，本发明的广度和范围不应只限于由任何上述的模式体现，而应该理解为落在本发明权利要求和其等价的范围之内。
权利要求
1.一种检测髓过氧化物酶(MPO)同型或亚型或其组合物来诊断或预后过敏性疾病、炎症疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病状态的方法，包括:ΜΡ0同型、亚型或其组合物中的至少一种能够和特异性结合的包被抗体结合;ΜΡ0同型、亚型或其组合物中的至少一种能够和一个标记抗体结合。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述MPO同型或亚型或其组合能够被所述MPO同型或亚型或其组合的特异性结合的标记抗体检测。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述标记抗体为单克隆抗体、单一特异性多克隆抗体、抗体结合片段中的一种。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述标记抗体包括一种可检测标记，所述可检测标记为化学发光剂、比色剂、酶、酶反应的底物、荧光剂或放射性同位素。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶可以是碱性磷酸酶，淀粉酶，荧光素酶，过氧化氢酶，β -半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，己糖激酶，辣根过氧化物酶，内酰胺酶，脲酶，苹果酸脱氢酶中的一种。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述包被抗体为单克隆抗体、单一特异性多克隆抗体或抗体结合片段中的一种。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述包被抗体是偶联到具有蛋白偶联表面的固相支持物上的，所述固相支撑物可以是一种滴定板，一种胶体金粒子，一种氧化铁离子或聚珠。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述诊断和预后的方法是固相免疫分析法。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述测试样品可以是全血、血浆、血清、细胞提取物或组织提取物中的一种。
10.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述对MPO同型或亚型或其组合的检测是和过敏性疾病、炎症疾病、心血管疾病或自身免疫疾病相关的。
11.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述炎症疾病为炎性肠�。鲎陨砻庖呒膊∥毙圆ド⑿阅约顾柩祝⒌疑喜。恐毙约怪祝沽字固遄酆险鳎偕习云堆陨砻庖咝愿窝祝骨患膊。寺薅鞑〉奶悄虿。疟臼喜。胤⑿匝“寮跎傩宰像埃彀呃谴喾⑿杂不ⅲ刂⒓∥蘖Γ由窬祝祓宕⑿缘ㄖ愿斡不喾缡亟谘祝稍镒酆险鳎陨砻庖咝匀苎云堆蛭じ衲扇庋恐字械囊恢�。
12.—种检测样本中MPO同型或亚型或其组合的试剂盒,包括包被抗体、标记抗体和固相载体。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述包被抗体为单克隆抗体、单一特异性多克隆抗体或抗体结合片段。
14.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述包被抗体是偶联到具有蛋白偶联表面的固相支持物上的，所述固相支撑物可以是一种微孔板，一种胶体金粒子，一种氧化铁离子或聚珠。
15.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述标记抗体为单克隆抗体、单一特异性多克隆抗体、抗体结合片段中的一种。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述标记抗体包括一种可检测标记，可检测标记为化学发光剂、比色剂、能量转移剂、酶、酶反应的底物、荧光剂或放射性同位素。
17.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含一种定量检测样本中至少一种MPO同型或亚型或其组合物的校准品。 ·
全文摘要
本发明提供了一种检测髓过氧化物酶(MPO)同型或亚型或其组合物的方法，特别是一种通过检测样本中MPO同型或亚型或其组合物中的一种，而不是全部的高特异性和高灵敏度的免疫测定方法。辅助诊断患者是否有过敏性疾病、炎症疾病、心血管疾病或自身免疫性疾�。蛟ず蠡颊叻⒄刮粜约膊�、炎症疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病风险的分析。本发明进一步提供一种用于实施所述方法的试剂盒。
文档编号G01N33/573GK102914651SQ201210334748
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者张开山, 苏广宇, 高阳 申请人:杭州华得森生物技术有限公司