专利名称：用于微流体器件的紧凑型光检测系统的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及检测光学器件领域，尤其涉及用于检测荧光信号的紧凑型光 学系统以及与该紧凑型光学检测系统兼容的干聚焦(dry-focus)微流体器件。
背景技术：
微流体器件的现有光学检测系统较大、昂贵且不灵活。在现有微流体器件仪 器中，光学检测系统是最昂贵的子系统。当前光学检测系统的大小、花费和僵化主 要由这种系统使用多个高质量激光器来激发荧光以及使用多个电荷耦合装置 (CCD)相机来检测而造成。
现有光学检测系统的校准和聚焦也存在问题。通常，通过观察荧光染料流过 微流体器件中的通道对光学器件进行校准和聚焦。在进行校准和聚焦过程之前必须 使染料到达微流体器件的检测区域。对于某些微流体器件，这会占用几分钟。此外， 在聚焦之后通常将荧光染料冲洗出通道，这是耗时且有时困难的过程。最后，染料 是昂贵且不稳定的，从而增加了该过程的成本和复杂性。
因此，期望提供克服上述和其它缺点的光学检测系统以及校准和聚焦装置及 方法。
发明内容
本发明的一个方面是用于微流体器件的光学检测系统。该系统包括发光二 极管(LED);将由LED发射的光准直的装置；非球面、熔融石英物镜；引导经准 直的光使其通过物镜到达微流体器件的装置；以及检测从微流体器件发射的荧光信号的装置。该系统可包括第二、外部光源，该光源可以是LED或激光器。从物
镜到微流体器件的工作距离可调节为允许沿倾斜路径引入来自LED或激光器的光
以照射微流体器件。
本发明的另一方面是干聚焦微流体器件。该器件包括第一基板；在第一基 板上形成的多个通道，其中至少一个是微流体通道;具有曲壁的多个光学校准标记， 这些标记在第一基板上形成并与通道间隔开；以及结合到第一基板以形成覆盖通道 和封闭光学校准标记的第二基板。将通道中的至少一个定位在光学校准标记中的至 少两个之间。
本文使用的术语"微流体"定义了具有0.1微米至500微米量级上的横截面尺 寸的腔和流动通路。微流体流动通道和流体处理区域具有0.1微米至100微米(通 常2.0微米至50微米)量级上的较佳深度。这些通道具有2.0微米至500微米量级 上的较佳宽度，3.0微米至100微米量级则更佳。对于许多应用，5.0微米至50微 米宽的通道会很有用。器件中的腔通常具有更大的尺寸，例如几毫米。
结合未按比例绘制的附图，通过阅读以下当前较佳实施方式的详细描述，本 发明的上述和其它特征和优点将变得进一步显而易见。详细描述和附图仅为说明本 发明，并非对由所附权利要求书机器等效方案限定的本发明的范围进行限制。
图1是根据本发明的光学检测系统一实施方式的示意图； 图2示出图1系统的激发光路； 图3示出图l系统的检测光路；
图4是根据本发明的光学检测系统另一实施方式的示意图； 图5是根据本发明的干聚焦微流体器件的一实施方式的示意图； 图6示出图5器件的检测区域的放大示意图； 图7是根据本发明的单个校准标记的横截面图8A和8B示出诸如由图6所示的两个校准标记阵列产生的光学信号;
图9是根据本发明的干聚焦微流体器件另一实施方式的示意图；以及
图10是从图9的干聚焦微流体器件获得的光学数据的截屏。
具体实施例方式
本发明的一个方面是光学检测系统。根据本发明，该系统的一个实施方式在图1中100处示出。在当前的非限制性示例中，系统100包括LED光源110;狭缝120;包括三个开缝透镜元件132、 134和136的开缝透镜130;激发带通滤波器 140;分束器150;物镜160;拒波滤波器(rejection filter) 170;衍射光栅180;包 括CCD透镜元件192和194的CCD透镜190;以及CCD阵列195。可以是激光 器或LED的第二光源在115处示出。微流体器件在165处示出。狭缝120在其背后被LED 110照射。LED可代替激光光源或与其一起使用， 如以下说明。LED的大小、形状、波长和功率水平可以改变。当前，在包括UV、 蓝色、蓝绿色和绿色在内的各种颜色中都可以使用LED,这些颜色表示发射波长 为400-750 nm。多个LED可装载在系统中(例如置于具有马达机构的转动架上) 并针对待检测的荧光剂来选择。来自LED 110的光通过狭缝120。如同对任何分光计的情况一样，本发明的 光谱分辨率与灵敏度成反比。因此，设置更宽的狭缝会造成更高的灵敏度但更差的 色彩分离。对于许多试验，仅需要两个或三个色带，因此允许为了高灵敏度而将狭 缝设置得更宽。在通过狭缝120之后，来自LED 110的光由开缝透镜130收集并准直，该透 镜对在光通过物镜160导向器件165时在物镜160处引入的轴向色差(axial color) 进行补偿。为了防止透射到用于激发的微流体器件上的狭缝像变得�：�(smear out)从而导致空间分辨率降低，彩色校正透镜(color corrector lens)是必要的。 可针对一个以上的波长范围即本示例中为350-400 nm和430-480 nm进行彩色校 正。狭缝-透镜距离针对各个范围可例如通过用户可用的软件控件进行不同设定。开缝透镜130包括开缝透镜元件132、 134和136。在本示例中，各个透镜元 件是用户定制并由UV透光、色散玻璃制成。开缝透镜130是针对UV LED所发 射的UV波长而设计的。它与物镜160 —起工作以在微流体器件165上形成狭缝 120的清晰像。开缝透镜元件132由Hoya玻璃类型TAC6制成并具有14 mm的边 缘直径和10.9 mm的中心厚度。开缝透镜元件134由Hoya玻璃类型NBFD12制成 并具有23 mm的直径和3.14 mm的中心厚度。开缝透镜元件136由熔融石英制成 并且是物镜160的复制品，如以下完整描述。在平坦的二向色性分束器150 (例如二向色面镜)将LED 110所发射的经准 直的激发光向下引导通过物镜160到达微流体器件165之前，激发带通滤波器140 使所需范围外的频率衰减。完整的激发光路在图2中示出。物镜160是高效率、用户定制的熔融石英物镜，其数值孔径(NA)是0.5且所收集的光的总锥角是60度。从图1可见，物镜必须不仅传输激发光而且收集并准直荧光。光收集效率大致与NA的平方成比例。物镜160的高收集效率允许使用 诸如LED 110这种功率较低且因此较便宜的光源。物镜160是单个熔融石英元件以减少不期望的背景荧光，该荧光会因透镜在 落射荧光(epifluorescence)模式中使用而限制试验的灵敏度。因为透镜由具有有 限色散的单种材料制成，所以其焦距与波长稍稍相关。该透镜具有27 mm的边缘 直径和15.02 mm的厚度。透镜边缘倾斜45度成0.5 mm最大表面宽度。透镜的背 面是非球面以校正球面象差。系统的孔径光阑位于透镜的背侧，且从这里没有渐晕 到CCD阵列上。物镜160通过用图像位于近轴焦点的近轴透镜对其建模来在单个波长(550 nm)下优化。物平面建模成位于由熔融石英制成的平行平板(即微流体器件的顶 面)下方700微米。因此，将物镜优化成在无限远处成像。所有物场点都经相同加 权。在本示例中，物镜160到微流体器件165的工作距离为16 mm。物镜直径(27 mm)和工作距离为在例如45度角引入的外部激光束照射提供间隔。各种激光器 可与本发明实施方式结合使用。例如，蓝光LED可与红色激光器耦合。可同时使 用共线引入的一个LED和一个或多个激光束。如以下详细描述，来自第二LED的 光也可为校准和聚焦目的而沿倾斜路径从外部引入。光源115表示激光器或LED 光源。物镜160到微流体器件165的工作距离也提供宽视场(3.4 mm)，从而允许在 多达16个彼此间距为200微米的通道中进行荧光测量或在20个彼此间距为150 微米的通道中进行荧光测量。完整的检测光路在图3中示出。系统100允许在400 nm与750 nm范围内的 发射波长。如图可见，从微流体器件165中发射的荧光信号通过二向色性面镜150， 同时反射最小。拒波滤波器170防止激发光沿检测路径传播。在检测路径上拒波滤波器170之后便是衍射光栅180，该光栅是经防反射涂敷 的BK7闪耀衍射光栅，用于使荧光色散成其各种组成色彩使得它们能被单独检测。 将光栅闪耀角选择成使可见光向一级的传输最优化。零级和二级较佳地不投射到 CCD阵列196上。因为物镜160是单态，所以它引入色差，主要是轴向色差形式。这些色差在 CCD透镜192和194处得到校正。通过使CCD阵列196和CCD透镜192和194阵列196倾斜便校正 了轴向色差。CCD透镜190包括CCD透镜元件192和194。透镜元件192是边缘直径为16.5 mm且厚度为7.63 mm的场透镜。CCD透镜元件194是因其色散特性而被选中的 各种玻璃的三体联合(triplet)。 CCD透镜不需要由低荧光玻璃制成，因为激发光 不会通过它们。CCD透镜194具有40mm的总边缘直径，并且该透镜的三个部分 的厚度分别是14.0mm、 2.5mm和2.5mm。CCD阵列195作为探测器使用。在本示例中，阵列的格式是658 x496像素， 7.4微米的像素大小。像素组合是可通过软件接口进行编程的。在探测器用于实际 试验中之前，用户能够选择所需检测带。检测带通常对应于微流体器件165上通道 的位置。如上所述，本实施方式被设计成从多达16个彼此间距为200微米的通道 或20个彼此间距为150微米的通道中引起和采集荧光。探测器所使用的检测带可 使用以下所述技术与这些通道对齐。在试验进行过程中，探测器输出两维阵列，其 中通道形成阵列的一个轴，而检测到的色彩形成另一个轴。例如，设计成检测从微 流体器件内的12通道中发射的绿色和红色荧光的系统将会输出12x2阵列。本领域技术人员应该理解，根据本发明的光学检测系统可以以许多方式改变。 例如，可改变系统中所使用的透镜的设计参数，其中包括直径、数值孔径、焦距和 材料，且期望物镜较佳地是熔融石英。光源也可改变，可使用不同的CCD和激光 光源的组合。CCD阵列的格式也可改变。也可进行其它改变。例如，图4示出另一种更加便宜的非多光谱实施方式。 该非限制示例使用具有上述用户定制、高数值孔径的物镜的商用部件。系统400 包括LED光源410、由激发带通滤波器413将两者分开的聚光透镜412和414、狭 缝420、单个开缝透镜430、分束器450、用户定制的高数值孔径物镜460、折叠式 反射镜470以及由发射带通滤波器494使其与CCD阵列496分开的CCD透镜492。 物镜460与在图4中在465处示出的微流体器件之间的工作距离与上述示例类似， 从而允许该系统与激光器以及LED —起使用。激发和检测光路两者都在图4中示 出。LED光源410是蓝光LED (例如Cree XLamp 7090 LED)。聚光透镜412是用 具有单层MgF2涂层的B270玻璃制成、有效焦距为12 mm的15 mm直径的透镜(例 如来自Newport公司)。透镜412的有效焦距为12 mm。聚光透镜414是带有1/4波长MgF2涂层的BK7玻璃制成的25 mm直径的透镜(例如来自Edmund Optics)。 透镜414的有效焦距为30 mm。激发带通滤波器413由NBK7玻璃制成，其中心 波长为470 nm、直径为25 mm、以及厚度为5 mm (例如来自Semrock)。狭缝420是500微米涂铬的钠钙玻璃狭缝，其直径为25.4 mm且厚度为1.5 mm (例如来自Lenox Laser)。开缝透镜430是使用具有1/4波长MgF2涂层的SF5玻 璃制成、有效焦距为27 mm的18 mm直径的透镜(例如来自Edmund Optics)。分束器450是扩展带二向色性分束器(例如来自Semrock)。物镜460是也在 160处示出并在上文描述的用户定制、高数值孔径物镜。折叠式反射镜470是标准 商用折叠式反射镜。CCD透镜492是例如用于Rolera-XR CCD相机即CCD阵列496的Nikon 50mm fl.4透镜。发射带通滤波器494由NBK7玻璃制成，中心波长为531 nm、直径 为25 mm、且厚度为5 mm (例如来自Semrock)。实际上，根据本发明的光学检测系统提供优于现有系统的许多优点。例如， 透镜布置允许如落射荧光系统中轴向地或以倾斜角度外部传输激发光。用户定制、 熔融石英物镜的高数值孔径允许使用LED形式的低功率且更便宜的光源。例如， 蓝光LED花费约$25，而蓝色激光器则花费约$10,000。本透镜系统也允许使用单 个CCD而非多个CCD，额外节省了费用。除了比典型光学检测系统更便宜之外， 所述系统更加紧凑。由于根据本发明的系统的低成本和小尺寸，若干不同颜色的 LED可结合到如图l所示的系统中，从而提供了各种激发颜色的嵌入式灵活性。 检测波长可通过用户可用的软件控件来设定。根据本实施方式的光学检测系统的另一优点是来自第二LED的光可为校准 和聚焦目的从外部以一倾斜角度传输到微流体器件。为了解决与使用流动荧光染料 关联的问题，诸如上述的光学检测系统可与干聚焦微流体器件组合以形成分析单 元。根据本发明的一个干聚焦微流体器件实施方式在图5中500处示出。本领域 技术人员应该理解，腔和流动通路的数量和排列方式可根据器件的预期用途而改 变。干聚焦器件的至少一个通道是微流体的。图5的检测区域515在图6中被放大。虽然检测区域515包括12个通道和总 共22个光学校准标记，它们排列成以平行于通道外侧的方式而定位的两个阵列(每 个阵列11个标记)，但是图6所示的通道数量已减少到四个以使单个元件具有更好 的可视性。如图6所示，对于12个或更少的通道而言，各个通道610之间的间距13至16个通道而言则是150微米。各个 标记620之间的间距621为100微米。以622示出的标记620与相邻通道610之间 的距离为至少200微米，而与通道的数量和间距无关。额定照射长度630为500 微米。额定检测中心在640示出。上述通道通常是使用本领域公知的标准光刻方法在基板中蚀刻而成的。校准 标记也被蚀刻到基板中并具有与通道相同的深度。在本实施方式中，标记620使用 正方形、10 x IO微米的掩模单元形成，得到比掩模单元稍大的校准标记。在制作 校准掩模620时使用各向同性的蚀刻，得到具有平底、曲壁的标记。例如参照图7， 示出单个校准标记620的横截面图。第二基板或盖子625通常结合到经蚀刻的基板， 形成覆盖通道610和封闭光学校准标记620。白光LED可用于照射校准标记620。将来自LED的光615从外部沿倾斜路径 引入。如上所述，诸如上述的光学检测系统配置成带有位于该器件上方以允许该倾 斜路径的物镜。如图7所示，为照射和检测而定位微流体器件，使校准标记的基底 最靠近光学器件。以将该光导入光学检测系统物镜中的角度在曲壁上反射掉来自白 光LED的光615。因为器件表面几乎是平的，所以斜角入射的光并不从这些表面 反射到物镜中。因此与校准标记同时刻蚀并具有相同曲度的通道几乎不可见，因为 它们填充有使光通过通道壁而不从曲壁反射出的液体。本领域技术人员应该意识 到，微流体器件通常在使用之前填充缓冲物或其它液体。图8A示出诸如上述并在图6中示出的由两个校准标记阵列产生的光学信号。 如图可见，各个阵列产生不同的峰810。虽然该阵列可包括任意数量的校准标记， 但是本领域技术人员应该理解，较佳地使用多个校准标记以便于产生能很容易地与 由微流体器件中或其上的灰尘斑点或其它小缺陷所产生的峰相区分的峰。图8B示 出校准峰810以及由器件中或其上的缺陷产生的峰815。如图可见，由校准标记产 生的峰810比由缺陷产生的峰815高很多。通过使用诸如图8A和8B中可见的不同校准峰，自动聚焦算法可简单地搜索 两个最高峰。因为已向自动聚焦算法提供了关于两个校准标记阵列之间距离以及各 个阵列到相邻通道的距离和各通道的间距的数据，可将光学检测系统聚焦并校准到 校准标记，然后移动适当距离以对准微流体通道。因此，通过拒绝小峰以及通过验 证期望峰之间的间距，便可使上述自动聚焦算法在对抗缺陷方面很有力。本领域技术人员应该理解，根据本发明的干聚焦微流体器件可以以许多方式 更改。例如，本发明的实施方式可用于单通道以及多通道微流体器件。校准和聚焦可以手动控制而非由自动聚焦算法自动控制。校准标记无需蚀刻，而可通过诸如冲压(stamp)、压印、铸模、和激光烧蚀基板等其它工艺来形成。标记的数量可以改变。标记的形状也可改变；然而，对于上述实施方式，形状和大小进行了优化。标记的深度并不关键，而是可以改变。沿与通道平行方向的准确位置也并不关键。标 记相对于通道的布置也可改变，只要不将标记定位得太靠近通道而使得通道的完整 性收到威胁即可。多个不同光波长可用于照射光学校准标记。此外，固态荧光材料 可置于光学校准标记内以增加由标记产生的光学信号。对光学校准标记可使用各种图案。例如，图9示出一备选实施方式，其中校 准标记910置于四个通道920的每个之间以及每个最外通道外侧。四通道的每个在 图的上半部分分支成三个通道。图10所示的截屏包括从诸如上述的CCD阵列获 得的线模式。当来自校准标记910的反射光所产生的五个峰位于来自光学检测系统 的CCD线模式数据中心时，白带得到正确地定位以感测来自干聚焦微流体器件上 通道920的荧光信号。本发明的另 一方面是用于校准和聚焦光学检测系统的方法。提供了具有多个 通道和多个光学校准标记的微流体器件。上述通道中的至少一个是微流体的。较佳 地，通过使用各向同性蚀刻和正方形10x IO微米掩模单元在基板中蚀刻出标记， 便形成了光学校准标记。该器件相对于光学检测系统的光学器件定位，使得光学校 准标记的底部比标记的顶部更靠近光学器件。将来自外部白光LED的光以斜角引 入以照射光学校准标记。将光学检测系统的数据收集设定为线模式。该系统通过使 用从光学校准标记的反射光来进行校准。该系统通过使用从光学校准标记的反射光 来进行聚焦。将所获得的关于光学校准标记位置的数据与驻留在光学检测系统中的 关于光学校准标记相对于通道的间距的数据结合起来以定位光学检测系统从而感 测来自通道的荧光信号。本发明的实施方式具有优于先前公知方法和设备的许多优点。 一个优点是本 发明不需要使染料在通道中流动来进行光学校准和间距。不使染料流动消除了昂贵 且不稳定染料的使用、不需要等待染料贯穿、并且不需要在校准和间距之后清洗掉 染料。虽然本文公幵的本发明的实施方式现在被示为较佳，但是可进行各种变化和 更改而不背离本发明的精神和范围。本发明的范围在所附权利要求书中说明，且落 在等效方案的内涵和范围内的所有变化和更改都将包含在其中。
权利要求
1.一种干聚焦微流体器件，包括第一基板；在所述第一基板中形成的多个通道，其中至少一个通道是微流体通道；在所述第一基板中形成、与所述多个通道间隔开的多个光学校准标记，各个校准标记具有曲壁；以及结合到所述第一基板使得所述通道被覆盖且所述校准标记被封闭的第二基板；其中至少一个通道定位在至少两个校准标记之间。
2. 如权利要求l所述的器件，其特征在于，所述光学校准标记形成两个阵列， 其中所述多个通道包括至少两个平行通道，且所述平行通道定位于所述两个阵列之间。
3. 如权利要求l所述的器件，其特征在于，所述光学校准标记通过从由蚀刻、 冲压、压印、铸模、激光烧蚀、及其组合组成的组中选择的方法形成。
4. 如权利要求1所述的器件，其特征在于，所述光学校准标记是通过使用各 向同性蚀刻和正方形的10x IO微米掩模单元而被蚀刻到所述基板中的。
5. 如权利要求1所述的器件，其特征在于，所述器件包括至少12个平行通道 和至少22个光学校准标记，其中所述校准标记形成两个各有11个光学校准标记的 阵列，所述阵列与所述通道平行并在其外侧定位。
6. —种用于微流体器件的光学检测系统，包括 发光二极管；使所述发光二极管所发射的光准直的装置； 非球面、熔融石英物镜；引导经准直的光使其通过所述物镜到达微流体器件的装置；以及 检测从所述微流体器件中发射的荧光信号的装置。
7. 如权利要求6所述的系统，其特征在于，所述物镜的数值孔径为0.5。
8..如权利要求6所述的系统，其特征在于，所述准直装置包括狭缝和开缝透镜。
9.如权利要求6所述的系统，其特征在于，所述引导装置包括二向色性分束器。
10. 如权利要求6所述的系统，其特征在于，所述检测装置包括CCD。
11. 如权利要求IO所述的系统，其特征在于，还包括CCD透镜。
12. 如权利要求12所述的系统，其特征在于，所述CCD透镜包括三体联合透 镜元件。
13. 如权利要求6所述的系统，其特征在于，还包括聚光透镜、激发带通滤波 器、拒波滤波器、衍射光栅、分束器、折叠式反射镜和发射带通滤波器中的一个或 多个。
14. 如权利要求6所述的系统，其特征在于，由所述LED发射的光被轴向传输到所述微流体器件。
15. 如权利要求6所述的系统，其特征在于，还包括外部光源。
16. 如权利要求15所述的系统，其特征在于，从所述物镜到所述微流体器件 的工作距离被调节成允许用来自所述外部光源并以斜角传输的光照射所述微流体 器件。
17. 如权利要求16所述的系统，其特征在于，所述从所述物镜到所述微流体 器件的工作距离为16mm。
18. 如权利要求15所述的系统，其特征在于，所述外部光源是发光二极管和激光器之一。
19. 如权利要求15所述的系统，其特征在于，所述微流体器件是如权利要求 1所述的干聚焦微流体器件，且所述校准标记由所述外部光源照射。
20. 如权利要求19所述的系统，其特征在于，所述外部光源为白光LED。
21. 如权利要求19所述的系统，其特征在于，还包括计算机可使用的介质。
22. 如权利要求19所述的系统，其特征在于，所述计算机可使用的介质包括 含有自动聚焦算法的程序。
23. 如权利要求20所述的系统，其特征在于，所述计算机可使用的介质包括 用于设定检测波长的计算机程序代码。
24. 如权利要求20所述的系统，其特征在于，所述计算机可使用的介质包括 用于设定狭缝-透镜距离的计算机程序代码。
25. —种用于校准和聚焦光学检测系统的方法，包括提供具有蚀刻到基板中的多个光学校准标记和多个通道的微流体器件，其中 所述通道中的至少一个为微流体通道；将所述器件相对于所述光学检测系统的光学器件定位使得所述光学校准标记的底部比所述标记的顶部更加靠近所述光学器件；以斜角引入来自外部白光LED的光来照射所述光学校准标记；将用于所述光学检测系统的数据收集设定为线模式；使用从所述光学校准标记处反射的光来校准所述光学检测系统；使用从所述光学校准标记处反射的光来聚焦所述光学检测系统；将关于所述光学校准标记的线数据与驻留在所述光学检测系统中的关于所述光学校准标记相对于所述通道的间距的数据结合起来以定位所述光学检测系统从而感测来自所述通道的荧光信号。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述光学校准标记是通过使用 各向同性蚀刻和正方形的10x IO微米掩模单元而被蚀刻到所述基板中的。
全文摘要
描述了一种用于微流体器件的光学检测系统以及与该紧凑型光学检测系统兼容的干聚焦微流体器件。该系统包括LED；将由LED发射的光准直的装置；非球面、熔融石英物镜；将经准直的光引导通过物镜到达微流体器件的装置；以及检测从微流体器件中发射的荧光信号的装置。物镜与该器件之间的工作距离允许来自外部LED或激光器的光沿倾斜路径引入以照射微流体器件。干聚焦微流体器件包括多个通道和多个具有曲壁的封闭光学校准标记。这些通道中的至少一个定位在上述标记中至少两个之间。为校准和聚焦目的，由来自外部白光LED的沿倾斜路径引入的光来照射上述标记。
文档编号G01N21/64GK101663576SQ200680011481
公开日2010年3月3日 申请日期2006年4月12日 优先权日2005年4月12日
发明者A·鲁利森, E·C·W·李, J·A·沃克, M·J·简森, M·斯拉特 申请人:卡钳生命科学股份有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
