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专利名称：生物组织内源性成分的多模式多光子显微成像装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于多模式的多光子显微技术对生物组织内源性不同成分的微结构进行成像的装置。
背景技术：
1931年,物理学家梅耶(Maria Goppert-Mayer)在她的博士论文中提出多光子激发的概念。随着超短脉冲锁模激光器的问世，为多光子激发荧光分子提供了必要的高瞬时能量密度，以锁模激光器为光源，1990年Denk和Webb实现了双光子激发荧光显微成像。随后，多光子显微成像技术迅速发展，至今，已经有包括双光子激发荧光(Two-photon excited fluorescence, 2PEF)、三光子激光突光(Three-photon excited fluorescence, 3PEF )、二次谐波(Second harmonic generation, SHG)和三次谐波(Third harmonic generation imaging, THG)等四种不同的多光子成像模式。生物组织的许多内源性成分在无须外加分子探针的情况就能产生较强的自体荧光和谐波信号，例如弹力蛋白、角蛋白、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸等都能够通过双光子激发产生自体荧光；血清素、色氨酸和多巴胺等都能够通过三光子激发产生自体荧光；具有非中心对称结构的胶原蛋白、肌浆球蛋白、微管和骨格肌等能产生二次谐波信号；生物组织成分的不均匀性分布在超短脉冲激光的作用下，极易产生三次谐波，从而可以观察如细胞膜的微结构。不同模式的多光子显微成像可以展示生物组织内源性不同成分的微结构，在实际应用中通常采用不同模式相结合的多模式多光子显微成像方法。由于多光子成像的模式不同，需要的激光光源和探测装置也相应的不同，目前，主要采用的有其中两种或三种模式相结合的多模式多光子显微成像。若能够同时实现基于2PEF、3PEF、SHG和THG四种模式的多光子显微成像，将能够更全面地反映生物组织的生理病理状态变化引起的组织中不同成分的改变，从而拓展多光子显微技术在生物医学领域的应用。

发明内容
本发明的目的是提供一种基于多模式的多光子显微成像装置，该装置基于2PEF、 3PEF、SHG和THG四种模式，可以对生物组织内源性不同成分的微结构进行全面的、高对比度的成像。本发明的技术方案是这样实现的由飞秒激光器产生的飞秒激光，通过分光镜将飞秒激光分成两路，其中第一路飞秒激光作为泵浦光入射到光学参量振荡器后产生波长比第一路飞秒激光长的激发光；其中第二路飞秒激光通过反射镜和延迟线，与第一路飞秒激光产生的激发光实现同步汇合，以形成汇合激光，该汇合激光通过第一双色分光镜入射到扫描器上，而后再通过第二双色分光镜并由物镜聚焦到检测样品上，汇合激光与检测样品产生的2PEF、3PEF、SHG和THG光信号反向通过物镜收集，再由第二双色分光镜反射到探测系统，所述探测系统包括用于反射出2PEF、3PEF、SHG和THG光信号的长通滤波片和分别设置在该些长通滤波片的反射光方向上的光电倍增管，所述光电倍增管将2PEF、3PEF、SHG和THG光信号分别转换成电信号，所述电信号分别接至计算机的输入端，由计算机同时显示来自生物组织内源性不同成分微结构的高对比度成像。上述飞秒激光器采用钛宝石飞秒激光器，所述钛宝石飞秒激光器的激发波长选用 800nm,作为泵浦光入射到光学参量振荡器后产生的激发光波长是1260nm。上述分光镜为80/20分光镜,第一路飞秒激光为拥有80%能量的光,第二路飞秒激光为拥有20%能量的光。
汇合激光与检测样品产生的双光子激发荧光2PEF、三光子激光荧光3PEF、二次谐波SHG和三次谐波THG光信号反向通过相同的物镜收集，不经过扫描器直接由第二双色分光镜反射到探测系统，避免了因扫描器对产生光信号的衰减而影响三光子激光荧光和三次谐波光信号的探测，而且，来自组织的二次谐波光信号由两个光电倍增管转换成的两种电信号，分别接至计算机的输入端，在计算机内的叠加将提高组织二次谐波成像的亮度。利用光学参量振荡器和延迟线，获得同时实现基于2PEF、3PEF、SHG和THG四种模式的多光子显微成像所需的1260nm和800nm两种不同波长的同步激发光源。上述的第一双色分光镜满足可透过1260nm并同时反射SOOnm的激发光。上述的第二双色分光镜满足可透过飞秒激光器发出的入射光，同时反射飞秒激光与检测样品相互作用产生的发射信号光。该些长通滤波片分别是390、410、430、620和640nm的长通滤波片。更具体地阐述钛宝石飞秒激光器产生800nm的飞秒激光，通过一个80/20的分光镜将飞秒激光分成两路，一路拥有80%能量的光作为泵浦光入射到光学参量振荡器后产生 1260nm的激光，另一路拥有20%能量的光通过反射镜和延迟线，与第一路产生的1260nm的激光实现同步汇合，通过第一双色分光镜入射到扫描器上。而后通过第二双色分光镜由物镜聚焦到检测样品上，激光与检测样品产生的2PEF、3PEF、SHG和THG光信号反向通过相同的物镜收集，再由第二双色分光镜反射到探测系统。探测系统的长通滤波片390、410、430、 620和640nm分别与光电倍增管f 5组成5个探测通道，将激发光与检测样品相互作用产生的2PEF、3PEF、SHG和THG光信号转换成电信号k E，分别接至计算机的输入端，最后由计算机同时显示来自生物组织内源性不同成分微结构的高对比度成像。本发明的显著优点在于(I)巧妙选择实现2PEF、3PEF、SHG和THG四种模式的多光子显微成像所需的两种激发光源的波长，即1260nm和800nm，避免来自生物组织内源性不同成分的2PEF、3PEF、SHG和THG信号的相互重叠，从而获得不同成分的微结构高对比度成像。(2)激光与检测样品产生的2PEF、3PEF、SHG和THG光信号反向通过相同的物镜收集，不经过扫描器直接由第二双色分光镜反射到探测系统，避免了因扫描器对产生光信号的衰减而影响3PEF和THG光信号的探测，而且，来自组织的SHG光信号由光电倍增管PMT2 和PMT5转换成的电信号B和E，分别接至计算机的输入端，在计算机内的叠加将提高组织 SHG成像的亮度。(3)利用光学参量振荡器和延迟线，获得同时实现基于2PEF、3PEF、SHG和 THG四种模式的多光子显微成像所需的1260nm和800nm两种不同波长的同步激发光源。


图I为本发明实施例的构造示意图。图中1为钛宝石飞秒激光器,2为分光镜,3为光学参量振荡器,4为反射镜,5为延迟线，6为第一双色分光镜,7为扫描器,8为第二双色分光镜,9为物镜，10为检测样品，11 为计算机，LPF390为390nm长通滤波片，LPF410为410nm长通滤波片，LPF430为430nm长通滤波片，LPF620为620nm长通滤波片，LPF640为640nm长通滤波片，PMTl PMT5为光电倍增管，A飞为电信号。
具体实施方为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，并配合附图，作详细说明如下。钛宝石飞秒激光器I (Ti : Sapphire Laser)产生800nm的飞秒激光，通过一个 80/20的分光镜2将飞秒激光分成两路，一路拥有80%能量的光作为泵浦光入射到光学参量振荡器3 (Optical Parametric Oscillator)后产生1260nm的激发光，另一路拥有 20%能量的光通过反射镜4 (Mirror)和延迟线5 (Delay Line)，与第一路产生的1260nm的激发光实现同步汇合，通过第一双色分光镜6 (Dichroic Beam Splitter)入射到扫描器 7 (Galvanometer X-Y Scanner)上。而后通过第二双色分光镜8 (Dichroic Beam Splitter) 由物镜9 (Objective Lens)聚焦到检测样品10 (Sample)上,1260 nm激光与检测样品产生的THG和SHG光信号与800 nm激光与检测样品产生的2PEF、3PEF、SHG光信号反向通过相同的物镜9收集，再由第二双色分光镜8反射到探测系统。探测系统由5部分组成(I) 390nm长通滤波片LPF390 (Long Pass Filter 390)反射小于390nm的光信号到达光电倍增管 PMTl (Photomultiplier tube I),探测 800nm 的光激发产生的 320nm-390nm 波段的 3PEF信号；(2) 390nm长通滤波片透射的大于390nm的光信号，被410nm长通滤波片LPF410 反射小于410nm的光信号到达光电倍增管PMT2，探测800nm的光激发产生的390nm_410nm 波段的SHG信号；(3) 41Onm长通滤波片透射的大于410nm的光信号，被430nm长通滤波片LPF430反射小于430 nm的光信号到达光电倍增管PMT3，探测1260nm的光激发产生的 410nm-430nm波段的THG信号；(4) 430nm长通滤波片透射的大于430nm的光信号，被620nm 长通滤波片LPF620反射小于620 nm的光信号到达光电倍增管PMT4，探测800nm的光激发产生的430nm-620nm波段的2PEF信号；(5) 620nm长通滤波片透射的大于620nm的光信号， 被640nm长通滤波片LPF64反射小于640 nm的光信号到达光电倍增管PMT5，探测1260nm 的光激发产生的620nm-640nm波段的SHG信号。光电倍增管PMTl PMT5将2PEF、3PEF、SHG 和THG光信号分别转换成电信号Al，分别接至计算机的输入端，最后由计算机11同时显示来自生物组织内源性不同成分微结构的高对比度成像。在本发明的最佳实施例中，钛宝石飞秒激光器I的激发波长应该选用800nm，作为泵浦光入射到光学参量振荡器3后产生的激发光波长应该是1260nm，这样才能够避免来自生物组织内源性不同成分的2PEF、3PEF、SHG和THG信号的相互重叠，从而获得不同成分的微结构高对比度成像。上述的激光与检测样品产生的2PEF、3PEF、SHG和THG光信号反向通过相同的物镜9收集，不经过扫描器直接由第二双色分光镜8反射到探测系统
上述的80/20的分光镜2与第一双色分光镜6之间800nm光传输的光路设有延迟线5 和反射镜4，实现1260nm和800nm两种不同波长的激发光源同步与检测样品相互作用。上述的第一双色分光镜6，应该满足可透过1260nm并同时反射SOOnm的激发光。
上述的第二双色分光镜8，应该满足可透过激发光源发出的入射光，同时反射激发光源与检测样品相互作用产生的发射信号光。以上所述仅为本发明的较 佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
权利要求
1.一种生物组织内源性成分的多模式多光子显微成像装置，其特征在于由飞秒激光器产生的飞秒激光，通过分光镜将飞秒激光分成两路，其中第一路飞秒激光作为泵浦光入射到光学参量振荡器后产生波长比第一路飞秒激光长的激发光；其中第二路飞秒激光通过反射镜和延迟线，与第一路飞秒激光产生的激发光实现同步汇合，以形成汇合激光，该汇合激光通过第一双色分光镜入射到扫描器上，而后再通过第二双色分光镜并由物镜聚焦到检测样品上，汇合激光与检测样品产生的2PEF、3PEF、SHG和THG光信号反向通过物镜收集， 再由第二双色分光镜反射到探测系统，所述探测系统包括用于反射出2PEF、3PEF、SHG和 THG光信号的长通滤波片和分别设置在该些长通滤波片的反射光方向上的光电倍增管，所述光电倍增管将2PEF、3PEF、SHG和THG光信号分别转换成电信号，所述电信号分别接至计算机的输入端，由计算机同时显示来自生物组织内源性不同成分微结构的高对比度成像。
2.根据权利要求I所述的生物组织内源性成分的多模式多光子显微成像装置，其特征在于所述飞秒激光器采用钛宝石飞秒激光器，所述钛宝石飞秒激光器的激发波长选用 800nm,作为泵浦光入射到光学参量振荡器后产生的激发光波长是1260nm。
3.根据权利要求I或2所述的生物组织内源性成分的多模式多光子显微成像装置，其特征在于所述分光镜为80/20分光镜,第一路飞秒激光为拥有80%能量的光,第二路飞秒激光为拥有20%能量的光。
4.根据权利要求I所述的生物组织内源性成分的多模式多光子显微成像装置，其特征在于汇合激光与检测样品产生的双光子激发荧光、三光子激光荧光、二次谐波和三次谐波光信号反向通过相同的物镜收集，不经过扫描器直接由第二双色分光镜反射到探测系统， 避免了因扫描器对产生光信号的衰减而影响三光子激光荧光和三次谐波光信号的探测，而且，来自组织的二次谐波光信号由两个光电倍增管转换成的两种电信号，分别接至计算机的输入端，在计算机内的叠加将提高组织二次谐波成像的亮度。
5.根据权利要求I所述的生物组织内源性成分的多模式多光子显微成像装置，其特征在于所述的第一双色分光镜满足可透过1260nm并同时反射SOOnm的激发光。
6.根据权利要求I或4所述的生物组织内源性成分的多模式多光子显微成像装置，其特征在于所述的第二双色分光镜满足可透过飞秒激光器发出的入射光，同时反射飞秒激光与检测样品相互作用产生的发射信号光。
7.根据权利要求I所述的生物组织内源性成分的多模式多光子显微成像装置，其特征在于该些长通滤波片分别是390、410、430、620和640nm的长通滤波片。
全文摘要
本发明涉及一种生物组织内源性成分的多模式多光子显微成像装置，钛宝石飞秒激光器产生800nm的飞秒激光，通过一个80/20的分光镜将激光分成两路，一路拥有80%能量的光作为泵浦光入射到光学参量振荡器后产生1260nm的激光，另一路拥有20%能量的光通过反射镜和延迟线，与第一路产生的1260nm的激光实现同步汇合，通过第一双色分光镜入射到扫描器上，而后通过第二双色分光镜由物镜聚焦到检测样品上。激光与检测样品产生的光信号反向通过相同的物镜收集，再由第二双色分光镜反射到探测系统。探测系统将激发光与检测样品相互作用产生的2PEF、3PEF、SHG和THG光信号转换成电信号A~E，分别接至计算机的输入端，最后由计算机同时显示来自生物组织内源性不同成分微结构的高对比度成像。
文档编号G01N21/64GK102621121SQ20121012019
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月24日 优先权日2012年4月24日
发明者刘嫩容, 卓双木, 朱小钦, 谢树森, 陈建新 申请人:福建师范大学