专利名称：荧光藻体显微成像仪的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种利用荧光光谱成像的浮游植物显微成像仪器，特别是涉及其荧光显微成像装置部分。
背景技术：
目前，国内已经有关于采用CCD数字相机监测赤潮以及湖泊蓝绿藻类方面的专利文献报导(海洋赤潮及湖泊蓝绿遥测装置CN136499/上海交通大学(孔海南).-2002.08.21)，但其子站点的现场监测仪器主要是CCD数字相机，监测的准确性不高。
利用荧光光谱鉴定浮游植物色素种类的研究开始于20世纪80年代；20世纪90年代，德国Bbe-moNaenke公司制造的荧光藻类分析仪，可测定并储存五个门类浮游植物的激发荧光光谱指纹，用于浮游植物的粗略分类。一篇日本专利文献(METHOD AND APPARATUS FORCOUNTING BLUE-GREEN ALGAE，ALGAE AND FINE PARTICLEJP2000338030/FUJI ELECTRIC COLTD(INUI TAKASHI，et al.).-2000-12-08)公开了一种监测水净化工厂的未净化水中的蓝绿藻类或全部藻类以及细小颗粒的数量、密度的荧光藻类分类和计数装置及方法，利用三个装置(藻青蛋白产生的荧光、藻类的叶绿素产生的荧光和常规光散射)分别监测蓝绿藻类或全部藻类以及细小颗粒。但上述的两种荧光藻类分析装置结构复杂，价格昂贵，推广使用受到限制。
发明内容
本实用新型要解决的技术问题是提供一种较低成本，使用方便的荧光藻体显微成像仪，解决探测和分析包含复杂背景的沉淀物样品中微藻的问题。
为解决上述问题，本实用新型的荧光藻体显微成像仪包括由光源和透镜纠正结构组成的光源照明装置，显微成像装置，CCD数码相机，图像采集卡以及计算机；显微成像部分的入射光源处有第一滤色片，产生激发光；接收口处设置有第二滤色片对显微成像滤波。
本实用新型的改进之处还在于光源部分包括若干不同色光的光源和透镜纠正结构；透镜纠正结构由圆形光源载板，光学聚集装置，和光源切换装置构成。利用光源切换装置控制圆形光源载板的转动，使不同色光光源分别在透镜焦点上点亮，完成对光源的切换，从而解决了视场照明不均的问题。
作为优选方案，入射光源处的第一滤色片为350nm中心波长，10nm半波宽，透射率为50％的的滤色片，在接收口处的第二滤色片为580nm的高通滤色片，入射光源选取30～50w的冷光源灯，这一方案所得到的图像，有效的去除了赤潮藻的背景噪声，为后继图象处理提供了清晰的位置信息。
本实用新型的有益效果是提供一种结构简单，造价低廉，使用方便的仪器，利用该仪器所获得的荧光图象可以有效的去除背景噪声，为后继图象处理提供清晰的位置信息，再结合灰度图象所提供的海藻的轮廓和纹理信息，从而使得从复杂的背景噪声中对海藻进行识别和计数简单有效。
以下结合附图和实施例对本实用新型进一步说明。
图1为硬件装置的基本结构框架荧光显微成像装置硬件结构图图2为光源照明装置结构示意图图3为赤潮异弯藻在不同激发光下荧光的产生情况示意图图4为三种藻类对不同激发光的680nm荧光响应强度曲线具体实施方式
如图1所示，荧光显微成像装置硬件结构包括光源照明装置，显微成像装置，特定波长滤色片，光学CCD数码相机，图像采集装置及高性能计算机。荧光显微成像工作原理如下选定光源载盘决定光源的强度，光源发出的光经凸透镜纠正结构后成为平行光，然后经特定中心波长滤色片，成为所希望的荧光激发光，之后海藻样品经显微成像装置成像，先通过接收滤色片滤波，之后通过CCD成像装置把荧光显微图像数字化传输前存储。其硬件结构基本框图见图1。
1、光源照明装置如图2所示，光源为若干不同色光的光源，透镜纠正结构由圆形光源载板，光学聚集装置，光源切换装置构成；光源切换装置在单片机的控制下，转动圆形光源载板，使不同色光光源分别在透镜焦点上点亮，从而完成对光源的切换。
2、图像采集卡图像采集卡采用大恒公司生产的DH-CG300，该图像采集卡可提供丰富的接口函数。分析软件通过调用这些接口函数即可得到所需图像，同时可以对采集参数进行设置。需设置的参数有(1)视频输入制式采用PAL标准电视制式(625行，50场/秒，色负载波4.43MHz)。
(2)输入窗口大小对于PAL制式，最大窗口尺寸为768×576像素。
(3)输出窗口大小输出窗口必须小于输入窗口尺寸，并且长宽都应是4的整数倍，本软件采用760×560像素大小。
(4)色彩空间数字化后的图像格式是YUV4:2:2，用户可以根据需要进行YUV-RGB转换，本软件采用RGB8:8:8格式。
(5)图像卡采集控制图像卡采集控制包括视频源路、亮度、对比度、色调、色饱和度。
3、CCD摄像头的选取主要考虑以下因素(1)有效视场要与光学视场匹配为使显微镜视场内的藻在CCD光敏面上有效成像，CCD摄像头的有效视场必须大于显微镜视�。�1/2英时CCD摄像头，可满足要求。
(2)解像度为得到足够清晰的图像，根据测量范围的下限值，同时考虑到上限值，微藻在视场内应有足够的数目用于统计测量。因此选取解像度为600线。
4、显微镜放大倍数的调整为兼顾技术和鉴别的需要，选取显微镜的放大倍率在1～100之间调整。对于微藻直径的上端，为有效计数，在视场内要有足够数量的藻，因此要求显微镜的放大倍率小一些，视场大一些，选取显微镜视场为Φ18mm，放大倍率为1，对于直径为1500μm的夜光藻，视场内可观察到最多大约144个藻，满足计数要求。为鉴别藻种，可在视场内选取一小部分，改变显微镜倍率观察细节。对于10μm的藻，视场内藻的数量不成问题，主要是要有足够的放大倍率，以便鉴别，选取显微镜的放大倍率为40倍结合电子学放大，总倍率1000倍，计算机屏幕上的图像可达10mm，足以鉴别。
5、荧光显微成像在大部分的赤潮藻中都含有叶绿素A，从而在特定波长的激发过的照射下，赤潮藻将产生相应荧光，其荧光波长主峰约在680nm，半波宽约为20nm。激发光波长以350和450效果最为显著。以上参数因不同藻的叶绿素的含量不同，藻的形态结构的不同以及与其它色素的比例不同会略有区别。为此采用F-4500FL Spectrophotometer对多种藻类进行荧光参数测定实验。图3是赤潮异弯藻在各种不同波长的激发光下其荧光的产生情况示意图，其中(a)图是采用350nm激发光的荧光效果，(b)图是采用450nm激发光的荧光效果，(c)图是采用550nm激发光的荧光效果。各图分别在各处的激发光波处因瑞利散射产生了一个峰，该峰不应计在荧光谱内。由图可见，在350和450主峰高度最高(由于测量浓度过高，到10000单位荧光峰被截止，截止宽度越大，表明峰值越高)但无论是哪种波长的光照射下，在680nm左右会产生荧光主峰其半波宽约为20nm，因此，以下荧光实验中采用680nm做为接收峰中央频率，20nm为其接收峰半波宽。图4是在选定680nm做为接收峰中央频率的情况下，测量新月菱形藻、赤潮异弯藻、裸甲藻对不同波长的激发光所激发的荧光强度图谱。由图可见，各藻在350nm处都将产生较明显的荧光响应。为此，采用350nm做为激发光波长进行荧光实验。
为降低成本，增加使用的方便性，本实验采用了对普通显微镜进行改造的方法实现了荧光摄象。尤其是，在入射光源处选取的为350nm中心波长，10nm半波宽，透射率为50％的的滤色片，在接收口选取的为680nm的高通滤色片，入射光源选取30～50w的冷光源灯。
再者，有些藻类除叶绿素a外，还含有其它色素或荧光物质，从而可以产生特异波长的荧光，因此可以根据所产生的荧光不同来鉴别藻的种类。
基于上述优点，荧光海藻显微成像仪将在浑浊海水赤潮监测中起到重要作用，对海藻的识别和计数工作都有重要辅助作用。
权利要求1.一种荧光藻体显微成像仪，包括由光源和透镜纠正结构组成的光源照明装置，显微成像装置，CCD数码相机，图像采集卡以及计算机，其特征是所述显微成像装置的入射光源处有第一滤色片，产生激发光；接收口上设置有第二滤色片对显微成像滤波。
2.按权利要求1所述的荧光藻体显微成像仪，其特征是所述光源为若干不同色光的光源，所述透镜纠正结构由圆形光源载板，光学聚集装置，光源切换装置构成；所述光源切换装置控制圆形光源载板的转动，使不同色光光源分别在透镜焦点上点亮，完成对光源的切换。
3.按权利要求1或2所述的荧光藻体显微成像仪，其特征是所述第一滤色片的中心波长为350nm，半波宽为10nm，透射率为50％。
4.按权利要求1或2所述的荧光藻体显微成像仪，其特征是第二滤色片的中心波长为580nm，半波宽为20nm。
5.按权利要求1或2所述的荧光藻体显微成像仪，所述光源照明装置的光源为30～50w的冷光源灯。
专利摘要本实用新型涉及的利用荧光光谱成像的浮游植物显微成像仪器，包括由光源和透镜纠正结构组成的光源照明装置，显微成像装置，CCD数码相机，图像采集卡以及计算机，显微成像装置的入射光源处设置第一滤色片，产生激发光；接收口上设置有第二滤色片对显微成像滤波。其光源可以为30～50W的冷光源灯，第一滤色片可以是中心波长为350nm中心，半波宽为10nm，透射率为50％的滤色片，第二滤色片可以是中心波长为580nm，半波宽为20nm的滤色片。本实用新型结构简单，成本低廉，使用方便，可用来进行赤潮或其他种类的藻类的监测，对海藻的识别和计数工作都有重要辅助作用。
文档编号G01N21/64GK2748908SQ20042005636
公开日2005年12月28日 申请日期2004年12月3日 优先权日2004年12月3日
发明者王学民, 曹红宝, 孙勇, 常晓剑, 王谨, 陈韵 申请人:天津大学
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