专利名称：一种乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方法
技术领域：
本发明涉及一种乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方法，具体地说是一种用于检 验生鲜动物乳液中是否含有抗生素残留及其它发酵抑制物质的方法。
背景技术：
动物乳液中的发酵抑制物是指抗生素残留物和其它发酵抑制物质，其它发酵抑制物质 的范围很广，主要包括清洗剂或消毒剂的残留、药品的残留物、乳品防腐剂等物质。
牧场内经常使用抗生素治疗乳牛或羊的各种疾�。簿股刂瘟乒娜榕：脱颍� 所分泌的乳液在一定时期内仍残存着抗生素。对抗生素有过敏体质的人(服)食用此种乳 液后就会发生过敏反应，也会使人体内的某些菌株对抗生素产生抗药性。因此，随着人们 对食品安全意识的提高，促使乳品加工企业对乳制品的主要原料 一 生鲜牛乳的质量控制 日趋严格，因此检査乳液中有无抗生素残留已成为常规、必要的检验工作。
在目前的现有技术中，主要的检测方法有微生物抑制法和酶联免疫法[1]。微生物检测 法是应用最早而广泛的方法，其测定原理是根据抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制 作用来定性或定量确定样品中抗微生物药物残留，如纸片法(PD)、TTC法、拭子法(STOP) 等。采用上述传统的微生物检测方法的优点是可靠，价格低，易操作。缺点是(l)时间长，
需2.5小时以上；(2)显色状态判断通过肉眼辨别，易产生误差，对微红色者无法做出准确 判断；(3)操作复杂。其中，纸片法和TTC法是牛奶中药物残留检测的两种常用的微生物 检测法[13]。采用传统的酸奶培养方法在2.5小时内亦可有良好的结果[14]，还可以分类断 定不同的微生物种类[15]。国际乳品联合会推荐的微生物检测抗生素残留菌种为嗜热脂肪芽 孢杆菌(5acz7/ws WearaA^vwop/ 7i var.calidolactis)，由于它对抑制物质的敏感性较高[16' 17]。已有大量的快速检测筛选方法问世并应用，微生物抑制法的主要试剂盒有 DELVOTEST、 CHARM SCIENCE、 BRILLIANT BLACK REDUCTION等；但由于标准方 法所需时间长，测定手续亦繁琐，因此，在生产中趋向研究更为灵敏、准确、简便、快速 的微生物检测方法。
目前药物残留免疫分析技术主要分为两大类 一为相对独立的分析方法，即免疫测定法(immunoassays, IAs)，如RIA、 E1JSA、固相免疫传感器(solid phase immunosensor ) 等[25]; 二是将免疫分析技术与常规理化分析技术联用，如利用免疫分析的高选择性作为理 化测定技术中的净化手段，典型的方式为免疫亲合色谱(i面uno affinity chromatography, IAC)。免疫分析技术最突出的优点是操作简单、速度快、分析成本低。以使用微量滴板的 ELISA为例，免疫测定法取样量�。按砑虻ィ萘看螅瞧骰潭鹊停觳饧抻隚C/MS 或GC/ECD相似，可方便地达到ng/g pg/g级，分析效率则为HPLC或GC的几十倍以上。目前 大部分抗生素己经建立了免疫测定法，如磺胺二甲基嘧啶、氯霉素、沙拉沙星、链霉素、 四环素、莫能菌素等[25'26]。 Strasser报道一种采用单克隆抗体和半抗原葡萄糖氧化酶间接 竞争法测定乳中多残留的方法，链霉素的检测极限可达到3.2ng/ml、磺胺嘧啶9. 0 ng/ ml、磺胺二甲氧嗪7.0 ng/ ml、邻氯青霉素0.8 ng/ml[26]。
以免疫法为基础的主要有e-LACTAMS、 DEVLX-PRESS、 BETASCREEN、 CHARM IIASSAY、 e-STAR、 CHARM-MRL、 PENZYM、 PARALLUX等。但该仪器价格昂贵， 非一般的中小型乳品加工企业和牧场所能承受。
丁东新、丁峰等提交申请"一种生鲜牛奶抗生素残留检测盒及其制造方法"(公开号CN 1793922A)，公开了一种微生物法的改良法，将乳酸菌和指示剂按最佳配比灌入盒中，在 检验时无需菌种，也不需要在检验过程中加入指示剂，更不需要试管等玻璃仪器，只需直 接加入待检乳样即可得出检验结果。但上述方法存在的缺点是需要至少2个多小时的保 温，才可以实现，由于没有设置对照，如果时间过短，则会产生很多误差。
参考文献叶兴乾，刘东红，陈健初牛奶抗生素残留快速检测技术进展及应用现状，农业工程
学报，2005， 21 (4) : 181 — 185 [5]邓斌，邓春来.牛奶中抗生素残留及其检测方法研究进展[J].饲料广角.2002,
24:19-22李淑坚.TTC法测定牛乳中残留的抗生素[J].兽药与饲料添加剂,2001，6(4),17-17
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种简便、快速且检验结果准确的乳品中是否含有 发酵抑制物的快速检验方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方
法，包括以下步骤1) 、将液态的待测乳品设置成相同规格的2份，l份为对照组，另l份为检验组；在 对照组和检验组内分别加入相同数量的液态发酵剂均匀混合，液态发酵剂与对照组中待测 乳品的体积比为1.4~1.6: 10;
2) 、在对照组中加入作为指示剂的试剂I并均匀混合；然后用滴定的方式加入试剂II 并均匀混合，使对照组成淡红色，记录滴定所需的量(v)，试剂II为碱溶液；
3) 、将检验组在42 48'C的温度下培养10 15分钟，然后加入与步骤2)相同数量 的试剂I和试剂II并均匀混合；
4) 、获得检验结果如果步骤3)所得物呈乳白色，则说明待测乳品中没有发酵抑制 物质；如果步骤3)所得物呈现淡红色，则说明待测乳品中含有发酵抑制物质。
作为本发明的乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方法的改进液态发酵剂为由保 加利亚乳杆菌与嗜热链球菌组成的菌种液，具体制作方法如下取1L新鲜无残留奶，先在 98 10(TC中巴氏杀菌，接着冷却到44'C;取0.1 0.5克纯的冷冻干燥活性菌种，先溶解于 200ml的新鲜无残留奶中，再混合于上述杀菌冷却后的1L奶中，于44'C下培养3 5小时(此 时乳会凝固，酸度达到70 75T左右)，冷冻干燥活性菌种中保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌 的重量比为1:05 2;最后冷却到4 6'C，保存于冰箱中，即为待用的液态发酵剂。
作为本发明的乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方法的进一步改进试剂I为酚 酞指示剂，试剂II为NaOH溶液，步骤l)中待测乳品的温度为19 2rC。
作为本发明的乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方法的进一步改进当待测乳品 为牛奶时，其酸度为16 22T;步骤3)中的培养时间为10分钟。当待测乳品为羊奶时， 其酸度为23 24T;步骤3)中的培养时间为15分钟。
作为本发明的乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方法的进一步改进步骤3)中 的培养温度为44°C。
在本发明的检验方法中，步骤2)中试剂I的用量为2-3滴，步骤l)中所使用的液态发 酵剂也可以通过市购获得。
采用本发明的检验方法，如果样品中含有抗生素或其它发酵抑制物质，由于其酸度没 有任何下降，在NaOH测定下在酚酞指示剂的存在时，则样品呈淡红色；如果没有抗生素 或其它发酵抑制物质，则样品的酸度会少量下降，同样的碱中和样品时，酸碱中和的结果 会使样品呈酸性，在酚酞指示剂存在时样品呈乳白色。
本发明的检验方法由于设置了对照样品，并且使保温发酵后的检验样品使用与对照样品相同的碱性溶液(例如为NaOH溶液)，因此可以保证测定结果的准确性。对待测乳品 设定的温度要求能达到液态发酵剂的最佳发酵条件，从而保证快速获得检测结果。
本发明的乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方法，与己有技术相比具有以下优
点
1、 操作简便、快速；可同时实现对多个样本进行检测。
2、 准确性高，正确率可高达100%;能用于快速地确认乳品中是否含有发酵抑制物。
3、 成本低廉检验所需设施和所用的试剂均为常规物品。
4、 本发明的方法可广泛应用于以下场合乳样接收时的检测，巴氏消毒奶样的检测 等等。
具体实施例方式
实施例l 、 一种乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方法，以生鲜牛奶作为待测乳 品，该生鲜牛奶符合以下条件温度为2(TC，酸度为16 22T;依次进行以下步骤
1 )、在试管A和B中各放入10ml上述生鲜牛奶，试管A为对照组，试管B为检验组； 在试管A和试管B中各加入1.5ml液态发酵剂；然后将试管A和试管B分别加盖后，上 下翻动，以摇匀管内的内容物。
上述液态发酵剂采用以下步骤制成
a、 取1L酸度为17 18T的新鲜无残留牛奶，先在98 10(TC中巴氏杀菌，接着冷却到 44°C;得灭菌奶；
b、 取0.2克纯的冷冻干燥的保加利亚乳杆菌活性菌种和0.2克纯的冷冻干燥的嗜热链球 菌活性菌种，先溶解于200ml的新鲜无残留牛奶中，摇匀；再与步骤l)所得的灭菌奶相混 合，于44。C下培养3 5小时；此时乳会凝固，酸度达到70 75T左右；
c、 上述培养结束后，冷却到4 6'C，保存于冰箱中；即为待用的液态发酵剂。
2) 、在试管A中加入2-3滴的酚酞指示剂后均匀摇晃；然后采用滴定的办法加入浓度 为0.1mol/L的NaOH溶液，边摇晃边滴定加入上述NaOH溶液，直至试管A中的牛奶呈 现淡红色。记录NaOH溶液总的用量(V)。
3) 、将试管B放于接种箱中在44'C的温度下培养10分钟。培养完毕后，取出试管B， 先加入2-3滴酚酞指示剂后均匀摇晃；然后再加入与步骤2)等量且相同的NaOH溶液(即 为对照组中NaOH滴定溶液的总用量V),然后均匀摇晃。
4) 、仔细观察试管B中内容物的色泽。如果呈乳白色，说明该生鲜牛奶中没有发酵抑制物质，可以直接进行后续的生产加工步骤。如果呈淡红色，则说明该生鲜牛奶中含有发 酵抑制物质，应作进一步确认检验。
结果发现该生鲜半奶呈乳白色，说明其不含发酵抑制物质。
实施例2、 一种乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方法，以巴氏消毒后的羊奶作 为待测乳品，该羊奶符合以下条件温度为2(TC，酸度为23 24T;依次进行以下步骤
1) 、在试管A和B中各放入10ml上述羊奶，试管A为对照组，试管B为检验组；在 试管A和试管B中各加入1.5ml液态发酵剂；然后将试管A和试管B分别加盖后，上下 翻动，以摇匀管内的内容物。
上述液态发酵剂采用以下步骤制成
a、 取1L酸度为23T的新鲜无残留羊奶，先在98 10(TC中巴氏杀菌，接着冷却到44'C; 得灭菌奶；
b、 取0.1克纯的冷冻干燥的保加利亚乳杆菌活性菌种和0.2克纯的冷冻干燥的嗜热链球 菌活性菌种，先溶解于200ml的新鲜无残留羊奶中，摇匀；再与步骤l)所得的灭菌奶相混 合，于44'C下培养3 5小时；此时乳会凝固，酸度达到70 75T左右；
c、 上述培养结束后，冷却到4 6X:，保存于冰箱中；即为待用的液态发酵剂。
2) 、在试管A中加入2滴酚酞指示剂后均匀摇晃；然后再加入2.5ml浓度为0.1mol/L 的NaOH溶液均匀摇晃，接着边摇晃边点滴加入上述浓度的NaOH溶液，直至试管A中 的羊奶呈现淡红色。记录NaOH溶液总的用量(V"2.5ml+滴定所用的量。
3) 、将试管B放于接种箱中在44'C的温度下培养15分钟。培养完毕后，取出试管B， 先加入2滴酚酞指示剂后均匀摇晃；然后再加入与步骤2)等量的相同的NaOH溶液(即 为NaOH溶液总用量V)均匀摇晃。
4) 、仔细观察试管B中内容物的色泽。如果呈乳白色，说明该羊奶中没有发酵抑制物 质，可以直接进行后续的生产加工步骤。如果呈淡红色，则说明该羊奶中含有发酵抑制物 质，应作进一步确认检验。
结果发现该羊奶呈淡红色，说明其含有某种发酵抑制物质。 采用现有的检测方法对本发明的检验方法进行验证，证明本发明的正确率达100%。 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，如将酚酞指标剂转换成其它的酸碱指示剂，则会有不同的颜色 出现；这些均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1. 一种乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方法，其特征是包括以下步骤1)、将液态的待测乳品设置成相同规格的2份，1份为对照组，另1份为检验组；在对照组和检验组内分别加入相同数量的液态发酵剂均匀混合，所述液态发酵剂与对照组中待测乳品的体积比为1.4～1.6∶10；2)、在对照组中加入作为指示剂的试剂I并均匀混合；然后用滴定的方式加入试剂II并均匀混合，使对照组成淡红色，记录滴定所需的量，所述试剂II为碱溶液；3)、将检验组在42～48℃的温度下培养10～15分钟，然后加入与步骤2)相同数量的试剂I和试剂II并均匀混合；4)、获得检验结果如果步骤3)所得物呈乳白色，则说明待测乳品中没有发酵抑制物质；如果步骤3)所得物呈现淡红色，则说明待测乳品中含有发酵抑制物质。
2、 根据权利要求l所述的乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方法，其特征是所述 液态发酵剂为由保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌组成的菌种液，具体制作方法如下取1L新鲜 无残留奶，先在98 10(TC中巴氏杀菌，接着冷却到44'C;取0.1 0.5克纯的冷冻干燥活性菌 种，先溶解于200ml的新鲜无残留奶中，再混合于上述杀菌冷却后的1L奶中，于44'C下培养3 5小时，所述冷冻干燥活性菌种中保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的重量比为1:05 2;最后冷却 到4 6'C，保存于冰箱中，即为待用的液态发酵剂。
3、 根据权利要求2所述的乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方法，其特征是所述 试剂I为酚酞指示剂。
4、 根据权利要求3所述的乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方法，其特征是所述 试剂II为NaOH溶液。
5、 根据权利要求4所述的乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方法，其特征是所述 步骤1)中待测乳品的温度为19~21°C。
6、 根据权利要求5所述的乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方法，其特征是所述 待测乳品为牛奶，其酸度为16 22T;步骤3)中的培养时间为10分钟。
7、 根据权利要求5所述的乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方法，其特征是所述 待测乳品为羊奶，其酸度为23 24T;步骤3)中的培养时间为15分钟。
8、 根据权利要求6或7所述的乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方法，其特征是 所述步骤3)中的培养温度为44'C。
全文摘要
本发明公开了一种乳品中是否含有发酵抑制物的快速检验方法，包括以下步骤1)将液态的待测乳品设置成相同规格的2份，1份为对照组，另1份为检验组；在对照组和检验组内分别加入相同数量的液态发酵剂均匀混合；2)在对照组中加入作为指示剂的试剂I、试剂II并均匀混合，使对照组成淡红色；3)将检验组在42～48℃的温度下培养10～15分钟，然后加入与步骤2)相同数量的试剂I和试剂II并均匀混合；4)获得检验结果如果步骤3)所得物呈乳白色，则说明待测乳品中没有发酵抑制物质；如果步骤3)所得物呈现淡红色，则说明待测乳品中含有发酵抑制物质。采用本发明的检验方法，能简便、快速地获得准确的检验结果。
文档编号G01N33/04GK101281138SQ20081005992
公开日2008年10月8日 申请日期2008年3月4日 优先权日2008年3月4日
发明者刘东红, 叶兴乾, 丹 吴, 方忠祥, 陈健初 申请人:浙江大学
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