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专利名称：一种紫薇属植物茎尖染色体制片方法
技术领域：
本发明涉及植物染色体制片方法，具体涉及紫薇属茎尖染色体制片方法。
背景技术：
紫薇属植物(Lagerstroemia)隶属于千屈菜科(Lythraceae),其主要种如大花紫薇、尾叶紫薇等都是我国夏季重要的观赏花木。与其他园林花卉相比，紫薇属染色体研究要落后很多，且该属植物多为中小染色体，不易染色，经典的细胞学手段难以识别其染色体，从而限制了深入理解紫薇属分子细胞遗传学机制研究的进行。因紫薇属植物多为非整倍体且染色体较小(Graham and Cavalcanti, 2001),所以此属植物染色体数目报道不统一，Bowden认为紫薇与大花紫薇染色体数目均为2n =50 (Bowden, 1945) ;Guha却认为其染色体数目仅为2n = 48 (Guha，1972).国内几种重要染色体图谱中对紫薇属植物染色体数目记载也各不相同，主要集中在2n = 50或2n = 48.宋平(2009)、童俊(2009)等在紫薇多倍体倍性鉴定时均采用常规压片法，目前尚未有人对紫薇染色体的制片技术进行系统研究。紫薇属植物由于细胞壁较厚且染色体小而多，使用常规压片法时会因预处理液及解离液的毒害作用而使染色体更加短縮，并且在压片过程中染色体易重叠，不易获得清晰分裂相，难以达到荧光原位杂交实验所需染色体的标准，不利于实验的进行。因此，使用常规压片方法制得的染色体压片只能用于常规观察计数及初歩核型分析，无法通过荧光原位杂交进行精确核型分析，迫切需要一种新的染色体制片技术，其制片能够满足荧光原位杂交精确核型分析的需要。

发明内容
本发明的目的在于提供一种紫薇属茎尖染色体制片方法，以克服现有技术的不足。本发明提供ー种紫薇属植物(Lagerstroemia)莖尖生长点染色体制片方法,包括以下步骤(I)取紫薇属茎尖生长点于固定液中固定；(2)将固定后的茎尖生长点用蒸馏水洗净转移至前低渗溶液处理；(3)蒸馏水洗净吸干水分，于混合酶液中酶解；(4)将酶解后的茎尖生长点用蒸馏水润洗，低渗处理；(5)将低渗处理后的茎尖置于载玻片，滴加步骤(I)所述的固定液，压碎茎尖，烤干载玻片；再次滴加固定液，再次烤干；冷却后滴加荧光染液染色；滴加荧光封片液。其中，步骤(I)为选取紫薇属一年生枝条茎尖生长点或初冬修剪经冷藏处理的枝条水培后新发出的茎尖生长点最内侧长度为0. 5 I. Ocm的茎尖部分。
其中，步骤⑴的取材时间优选为上午9:00 11:00。其中，步骤(I)固定液其配方为无水こ醇冰醋酸三氯甲烷体积比为5こ3こ2。所述冰醋酸、三氯甲烷均为分析纯。其中，步骤⑴固定时间为18 24h。其中，步骤(I)固定条件优选为-20°C。其中，步骤⑵前低渗溶液为0. 075mol/L的KCl。其中，步骤⑵前低渗溶液处理时间为20 30min。优选地，前低渗溶液处理时间为30min其中，步骤(3)混合酶液为2. 5%纤维素酶2. 5%的果胶酶0.01%蛋白酶K按体积比2 I 3配制得到。其中，步骤(3)酶解条件为37°C水浴酶解4 5h。其中，步骤(4)低渗处理的时间为20 30min。优选地，低渗处理时间为30min。步骤⑷采用双蒸水进行低渗处理。其中，步骤(5)的第一次烤干载玻片前，是将压碎茎尖后，弃去大块的组织，趁材料未干时加一滴固定液，使剩余组织均匀涂布于载玻片上，酒精灯火焰上微微加热烤干。其中，步骤(5)所述的荧光染液为g/mL DAPI荧光染液，加入量为20y L，染色时间为IOmin。其中，步骤(5)中染色后，冲去染液，滴加荧光封片液，得到具有紫薇属茎尖染色体的玻片。本发明提供了制的具有紫薇属茎尖染色体的玻片。本发明提供了上述制片方法在紫薇属基因组功能学中的应用。本发明采用火焰法制片，省去常规制片方法中预处理、解离、染色压片过程，通过直接固定，提高制片效率，避免预处理液及解离液对染色体的毒害作用，維持染色体原始形态，同时扩大了紫薇属染色体制片的取材范围。本发明提供了紫薇属茎尖染色体压片中各处理的最佳时间，找到了最适合紫薇属的染色体制片技术，克服了现有技术中压片过程中染色体易重叠，不易获得清晰分裂相等问题。同时，本发明的火焰干燥法没有染色和压片过程，这样在荧光原位杂交过程中避免了染色体结构遭到破坏，并免去了低温掀盖玻片过程，能够完好保存所有分裂相，保证良好的分裂相用于后期荧光原位杂交实验。


图I:本发明方法制得的屋久岛紫薇一年生枝条茎尖生长点染色体玻片100倍油镜镜检图。图2:本发明方法制得的福建紫薇一年生枝条茎尖生长点染色体玻片100倍油镜镜检图。图3:常规压片法制得的屋久岛紫薇一年生枝条茎尖生长点染色体玻片100倍油镜镜检图。图4:常规压片法制得的福建紫薇一年生枝条茎尖生长点染色体玻片100倍油镜镜检图。具体实施例方式以下实施例进ー步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用试剂为市售。实施例I本发明紫薇属屋久岛紫薇茎尖染色体制 片方法紫薇属屋久岛紫薇屋久岛紫薇栽植于国家花卉中心(北京小汤山)种质资源圃，于早上9:00取一年生植株茎尖生长点最内侧长度为0. 5cm的茎尖部分。直接放入固定液(按体积比，无水こ醇冰醋酸(分析纯)三氯甲烷(分析纯)=5 : 3 : 2)中于-20°C冰箱中固定18h。实验前取出，于蒸馏水中润洗洗净固定液，转移至0. O75mol/LKC1溶液中前低渗30min ;将前低渗处理后的茎尖生长点用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，放入混合酶液中于37°C水浴酶解4h，混合酶液为2. 5%纤维素酶2. 5%的果胶酶0. 01%蛋白酶K = 2 I 3(体积比)。酶解后，用蒸馏水润洗，使用ddH20进行后低渗30min;取ー张干净的载玻片，用镊子夹取适量茎尖置于其上，加一滴前述改良的固定液，迅速用镊子将茎尖压碎，夹去大块组织，趁材料未干时马上加一滴固定液，用镊子将剰余材料均匀涂布在载玻片上，在酒精灯火焰上微微加热烤干.然后迅速再滴加一滴固定液，在酒精灯上再次烤干。冷却后向载玻片上滴加20 ii L 2u g/mL DAPI荧光染液，染色IOmin流水冲去染液，加一滴抗淬灭荧光封片液，置于荧光显微镜下观察。镜检效果在100倍油镜的情况下，有60%的细胞分裂相，染色体清晰可见且分散良好，长度适宜，可以计数。结果见图I。实施例2本发明紫薇属福建紫薇茎尖染色体制片方法紫薇属福建紫薇福建紫薇栽植于国家花卉中心(北京小汤山)种质资源圃，于早上11:00取初冬修剪经冷藏处理的枝条水培后新发出的茎尖生长点最内侧长度为I. Ocm的茎尖部分。直接放入固定液按体积比，无水こ醇冰醋酸(分析纯)三氯甲烷(分析纯)=5 : 3 : 2中于-20°C冰箱中固定24h。实验前取出，于蒸馏水中润洗洗净固定液，转移至0. O75mol/LKC1溶液中前低渗20min ;将前低渗处理后的茎尖生长点用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，放入混合酶液中于37°C水浴酶解5h，混合酶液为2. 5%纤维素酶2. 5%的果胶酶0.01%蛋白酶K = 2 I 2 (体积比)。酶解后，用蒸馏水润洗，使用ddH20进行后低渗20min;取一张干净的载玻片，用镊子夹取适量茎尖置于其上，加一滴固定液，迅速用镊子将茎尖压碎，夹去大块组织，趁材料未干时马上加一滴固定液，用镊子将剰余材料均匀涂布在载玻片上，在酒精灯火焰上微微加热烤干.然后迅速再滴加一滴固定液，在酒精灯上再次烤干。冷却后向载玻片上滴加20 ii L 2 ii g/mL DAPI荧光染液，染色IOmin流水冲去染液，加一滴突光封片液，置于突光显微镜下观察。镜检效果在100倍油镜的情况下，有50%的细胞分裂相，染色体清晰可见且分散良好，长度适宜，可以计数。结果见图2。实施例3常规压片法紫薇属屋久岛紫薇染色体制片方法采用常规压片法进行制片。紫薇属屋久岛紫薇，于早上9:00取种子萌发的根尖。放入0. 002mol/L 8-羟基喹啉中20_25°C室温预处理3h。然后用蒸馏水洗净根尖，转入卡诺氏固定液(无水こ醇冰こ酸=3 1)4°C保存过夜。实验前取出，于蒸馏水中润洗洗净固定液，转移至0. O75mol/LKC1溶液中前低渗30min ;将前低渗处理后的根尖用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，放入浓盐酸与こ醇混合液(I I)中于室温下解离Ih 20min;解离后，用蒸馏水润洗，使用ddH20进行后低渗30min ;卡宝品红溶液染色30min后压片观察染色体制片效果。镜检效果在100倍油镜的情况下，有30%的细胞分裂相，染色体清晰可见，分散程度一般，可以计数。结果见图3。实施例4常规压片法紫薇属福建紫薇染色体制片方法采用常规压片法进行制片。紫薇属福建紫薇，于早上11:00取种子萌发的根尖。放入0. 002mol/L 8-羟基喹啉中20_25°C室温预处理3h。然后用蒸馏水洗净根尖，转入卡诺氏固定液(无水こ醇冰こ酸=3 I)4°C保存过夜。实验前取出，于蒸馏水中润洗洗浄固定液，转移至0. O75mol/LKC1溶液中前低渗30min ;将前低渗处理后的根尖用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，放入浓盐酸与こ醇混合液(I I)中于室温下解离Ih IOmin;解离后，用蒸馏水润洗，使用ddH20进行后低渗30min ;卡宝品红溶液染色30min后压片观察染色体制片效果。镜检效果在100倍油镜的情况下，有20%的细胞分裂相，染色体清晰可见，分散程度一般，可以计数，结果见图4。通过比较实施例1-4的制片效果，发现使用常规压片法时会因预处理液及解离液的毒害作用而使染色体更加短縮，而且压片过程中染色体易重叠，不易获得清晰分裂相，只能用于常规观察计数及初歩核型分析.本发明的火焰法制片省去预处理、解离、染色压片过程，直接固定，提高制片效率，避免预处理液及解离液对染色体的毒害作用，維持染色体原始形态，获得更好的分裂相。同时，火焰干燥法没有染色和压片过程，这样在荧光原位杂交过程中避免了染色体结构遭到破坏，并免去了低温掀盖玻片过程，能够完好保存所有分裂相，保证良好的分裂相用于后期杂交实验。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。权利要求
1.ー种紫薇属植物(Lagerstroemia)莖尖生长点染色体制片方法,包括以下步骤 1)取紫薇属茎尖生长点于固定液中固定； 2)将固定后的茎尖生长点用蒸馏水洗净转移至前低渗溶液处理； 3)蒸馏水洗净吸干水分，于混合酶液中酶解； 4)将酶解后的茎尖生长点用蒸馏水润洗，低渗处理； 5)将低渗处理后的茎尖置于载玻片，滴加步骤I)所述的固定液，压碎茎尖，烤干载玻片；再次滴加固定液，再次烤干；冷却后滴加荧光染液染色；滴加荧光封片液。
2.如权利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述步骤I)为选取紫薇属一年生枝条茎尖生长点或初冬修剪经冷藏处理的枝条水培后新发出的茎尖生长点最内侧长度为0.5 I. Ocm的茎尖部分。
3.如权利要求2所述的制片方法，其特征在于，所述步骤I)取材时间为上午9:00 11:00。
4.如权利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述步骤I)固定液其配方为无水こ醇冰醋酸三氯甲烷体积比为5:3:2。
5.如权利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述步骤I)固定时间为18 24h。
6.如权利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述步骤2)前低渗溶液处理时间为20 30mino
7.如权利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述步骤3)混合酶液为2.5%纤维素酶2. 5%的果胶酶0.01%蛋白酶K按体积比2 I 2-3配制得到。
8.如权利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述步骤3)酶解条件为37°C水浴酶解4 5h。
9.如权利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述步骤4)低渗处理的时间为20 30mino
10.权利要求1-9任一所述的制片方法在紫薇属基因组功能学中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种紫微属植物茎尖生长点染色体制片方法。本发明方法选取紫薇属植物一年生枝条茎尖生长点或初冬修剪经冷藏处理的枝条水培后新发出的茎尖生长点最内侧长度为0.5～1.0cm的部分，依次经固定液(按体积比乙醇∶冰醋酸∶三氯甲烷＝5∶3∶2)固定、前低渗处理、混合酶液酶解后低渗处理，火焰干燥法制片。本发明的染色体制片方法省去预处理、解离、染色压片过程，直接固定，提高制片效率，避免预处理液及解离液对染色体的毒害作用，维持染色体原始形态，获得更好的染色体分散效果，同时扩大了紫薇属植物染色体制片的取材范围及时间。本发明方法的制片能够用于荧光原位杂交实验，为紫薇属基因组的进一步研究奠定良好基础。
文档编号G01N1/28GK102645360SQ20121011191
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月16日 优先权日2012年4月16日
发明者孙明, 张启翔, 杨冰洁, 潘会堂, 王佳, 程堂仁 申请人:北京林业大学