专利名称：基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg<sup>2+</sup>检测芯片及方法
技术领域：
本发明涉及一种基于寡核苷酸链的荧光增强型汞离子检测芯片和方法，属于生物分析技术领域。
背景技术：
汞是高毒的全球性环境污染物，尤其是其具有高迁移性、持久性、甲基化作用性、生物富集性及食物链放大性的特点，即便是极微量的存在于环境中，对动植物及人类的健康也是极大的威胁。全世界的汞一年的排放量约I. 5万吨，主要来源于汞矿、冶金、氯碱工业、电器工业和矿物燃料的燃烧。汞以多种形式存在与环境中，水溶性的二价汞离子(Hg2+)是汞污染最常见和最稳定的形式之一。如何有效地进行环境中汞离子含量的测定，成为摆在广大分析工作者面前的一个 问题。目前传统的汞离子检测方法主要有原子(吸收，发射，荧光)光谱法及电感耦合等离子质谱仪(Inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)。尽管能够得到比较精确的检测结果，但这些技术依赖大型仪器设备、耗费耗时、需进行样品预处理，需要专门的技术人员进行操作，检测成本高，很难满足产地现场快速检测的要求，并且其中有些方法还需要用到有毒试剂，难以被分析人员接受。因此，人们迫切需要简便、快速、经济、准确的分析检测汞离子的方法。目前，国内外对汞离子进行现场检测的方法在灵敏度和专一性上不能够满足要求。近来的研究表明，汞离子能特异性地与两个胸腺嘧啶碱基(T)共价结合形成稳定的T-Hg2+-T结构。基于汞离子的这一特殊的性质，已发展了各种Hg2+检测方法如突光法(A. Ono, H. Togashi, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2004, 43, 4300.)、纳米金聚集比色法(J. S. Lee, M. S. Han, C. A. Mirkin, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2007, 46, 4093.电化学 (Z. Zhu, Y. Su, J. Li, D. Li, J. Zhang, S. Song, Y. Zhao, G. Li, C. Fan, Anal.Chem. 2009, 81，7660.)等。这些方法普遍具有选择性好、特异性强等特点，但多不适合现场检测。生物芯片是本世纪八十年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他物质的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化，能够实现对微量样品快速、准确的检测。本发明人在“基于寡核苷酸链的汞离子荧光检测芯片、制作及使用方法”的申请中(专利申请号201010533018.X)报道的汞离子检测芯片随着汞离子浓度增加，荧光信号减小。这种signal-off的工作模式容易引起假阳性。本发明在此基础上拟作出进一步改进，克服引起假阳性的缺点，提供一种Hg2+检测芯片方法及应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于寡核苷酸链的突光增强型Hg2+检测芯片及方法，本发明的特征在于结合汞离子能特异性地与两个胸腺嘧啶碱基(T)共价结合形成稳定的T - Hg2+ - T结构的这一特性以及生物芯片的优点，以实现对Hg2+低成本、高灵敏、准确、快速的检测。其特征在于利用Hg2+可特异性地与DNA的两个相邻胸腺嘧啶碱基(T)共价结合，介导T-T配对形成稳定的T-Hg2+-T结构，进而诱导与全T寡核苷酸链杂交的互补链的释放。通过在全T寡核苷酸链的一端引入一段随机序列，并预先用荧光标记的互补链与之杂交，再用荧光淬灭基团标记的聚腺苷酸链与全T寡核苷酸链片段杂交，荧光基团与淬灭基团之间发生荧光共振能量转移使得荧光淬灭，这样当Hg2+诱导T-Hg2+ - T结构形成而使得聚腺苷酸链被释放，就会引起荧光信号 增强(图I)。具体的说，首先将合成的含有富T寡核苷酸链片段以及随机序列片段的单链DNA固定在经修饰的玻片上；然后将荧光基团标记的随机序列互补链以及淬灭基团标记的聚腺苷酸链分别与单链DNA中的随机序列片段以及富T寡核苷酸链片段杂交，形成双链结构，制备好低荧光值的Hg2+检测芯片；使用所制作的检测芯片检测样品中Hg2+浓度时，则只需将待测样品添加到芯片上并保持一段时间，冲洗后利用荧光芯片信号分析系统扫描芯片，通过分析荧光信号的变化，实现对Hg2+的检测。若待测样品中含Hg2+时，则Hg2+能特异性地与单链DNA中富T寡核苷酸链片段上的T碱基共价结合，介导两条富T寡核苷酸链片段上的T - T配对形成稳定的分子间T - Hg2+ - T结构，从而诱导带有淬灭基团的聚腺苷酸链的释放，导致芯片斑点处荧光增强。荧光强度可通过荧光扫描仪定量分析。本发明基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg2+检测芯片的制作方法，其特征在于本发明中Hg2+检测芯片的制作方法包括如下步骤(I)化学修饰的含有富T寡核苷酸链片段以及随机序列片段的单链DNA固定在化学修饰的玻片上2-20 μ M化学修饰的单链DNA按I: I (V/V)的比例加入2 X点样缓冲液。通过以接触式Cartesian microarray制作系统点阵于化学修饰的载玻片。点样完毕，将玻片置于一定湿度，比如70%湿度、室温条件下48 72h进行固定。分别用O. 2% SDS(十二烷基硫酸钠)、去离子水洗2次，每次2min，然后用醛基封闭液(O. Ig硼氢化钠，30mL PBS, 10mL99%乙醇)封闭15min。再依次用0.2% SDS、去离子水各洗2次，每次2min，吹干，备用。(2)随机序列互补链与单链DNA中的随机序列片段杂交标记了荧光基团的随机序列互补链用杂交液稀释成1-10 μ M0将稀释好的溶液加在芯片的斑点处，盖上盖玻片。芯片置于湿盒中，25°C，过夜。次日早上，将芯片置于4°C，30min，再 25°C，15min。然后依次用 IOmM MOPS (3-吗啉丙磺酸)，IOOmM NaNO3, ρΗ7· 2 洗5-10min,吹干,备用。(3)聚腺苷酸链与单链DNA中的富T寡核苷酸链片段杂交标记了淬灭基团的聚腺苷酸链与单链DNA的杂交方法同(2)所述。本发明制备的Hg2+检测芯片的检测方法包括如下步骤用杂交液稀释制备好不同浓度的Hg2+，加不同浓度的Hg2+溶液于芯片斑点处，室温，反应 10-60min。IOmM MOPS, IOOmM NaNO3, pH7. 2 洗 3 次，吹干。用 General Scanning 公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描并分析结果。本发明基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg2+检测芯片、制作方法及其应用方法，具有如下的技术效果
I、本发明基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg2+检测芯片的制作方法简单易行。2、本发明基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg2+检测芯片灵敏度和专一性高。3、应用本发明检测Hg2+时，检测结果随着Hg2+浓度提高表现为荧光信号增强，从而避免了假阳性，易于理解和表达。4、应用本发明检测Hg2+时，样品、试剂消耗量少，成本低。5、本发明的检测结果用普通的扫描仪扫描观察及分析即可，不需要复杂的昂贵设备，使现场检测更简单方便。6、通过分析荧光信号的变化，即可实现对Hg2+的检测。样品中Hg2+浓度越高，荧光信号增强的越多。该方法可以检测的Hg2+的浓度范围是IOnM-IOO μ M。该芯片具有很好的离子选择性，其它常见金属离子对其没有响应。
·图I是基于寡核苷酸链的荧光增强型汞离子芯片检测原理图。图2 (A)-图2 (D)，是本发明实施例2中利用荧光增强型检测芯片检测Hg2+的分步荧光扫描照片。图A为检测探针A固定到玻片后的扫描照片，图B为探针B与探针A杂交后芯片的扫描照片，图C为探针C与探针A杂交后芯片的扫描照片，图D为利用芯片检测IOOnM Hg2+的扫描照片。荧光强度指示条指示了不同颜色代表的荧光强弱。荧光扫描照片中荧光强度平均值依次是:图(A) O,图(B) 65535，图(C) 7129，图(D) 25832。图3 (A)-图3 (B)，是本发明实施例3中利用荧光增强型检测芯片检测Hg2+的荧光扫描照片及标准曲线。图3(么)依次为检测缓冲液、101^、1001^、14 1、1(^1、10(^1 Hg2+的荧光扫描照片，照片中荧光强度平均值依次是缓冲液组7978，IOnM Hg2+组13880，IOOnMHg2+ 组 26202，I μ M Hg2+ 组 33572，10 μ M Hg2+ 组 55940，100 μ M Hg2+ 组 65535 ;图 3 (B)为分析结果。图4 (A)-图4 (B)，是本发明实施例4中利用荧光增强型检测芯片检测Hg2+和其他二价离子的荧光扫描照片及结果。图4 (A)依次为检测缓冲液、10 μ M Hg2+UOyM Pb2+、10 μ M Zn2+、10 μ M Ca2+UOyM Cu2+UOyM Ni2+、10 μ M Mg2+的荧光扫描照片。照片中荧光强度平均值依次是缓冲液组7035，Hg2+组56186，Pb2+组11307，Zn2+组9905，Ca2+组10292，Cu2+ 组 10823，Ni2+ 组 10744，Mg2+ 组 9990。图 4 (B)为分析结果。图5 (A)-图5 (C)，是本发明实施例5中利用荧光增强型检测芯片检测相同浓度的标准缓冲液中Hg2+和饮用水中掺入的Hg2+荧光扫描照片及结果。图5 (A)中依次为检测标准缓冲液中掺入0、500ηΜ、5μΜ Hg2+的荧光扫描照片，图5 (B)中依次为检测饮用水中掺入入0、500ηΜ、5μΜ Hg2+的荧光扫描照片。图5 (C)为分析结果。
具体实施例方式表I :本发明中使用的核酸探针序列。
探针名称序列
探针 A 5 ’ NH2-C12AGCGTATCGACGAAATTTTTTTTTTTTTT-3>
权利要求
1.一种基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg2+检测芯片，其特征在于利用Hg2+可特异性地与DNA的两个相邻胸腺嘧啶碱基(T)共价结合，介导T - T配对形成稳定的T - Hg2+ - T结构，进而诱导与全T寡核苷酸链杂交的互补链的释放。
2.按权利要求I所述的检测芯片，其特征在于所述诱导进而诱导与全T寡核苷酸链杂交的互补链的释放是在全T寡核苷酸链的一端引入一段随机序列，并预先用荧光标记的互补链与之杂交，再用突光淬灭基团标记的聚腺苷酸链与全T寡核苷酸链片段杂交,突光基团与淬灭基团之间发生荧光共振能量转移使得荧光淬灭；当Hg2+诱导T - Hg2+ - T结构形成而使得聚腺苷酸链被释放，引起荧光信号增强。
3.制备如权利要求I或2所述的检测芯片的方法，其特征在于首先将合成的含有富T寡核苷酸链片段以及随机序列片段的单链DNA固定在经修饰的玻片上；然后将荧光基团标记的随机序列互补链以及淬灭基团标记的聚腺苷酸链分别与单链DNA中的随机序列片段 以及富T寡核苷酸链片段杂交，形成双链结构，制备低荧光值的Hg2+检测芯片。
4.按权利要求3所述的方法，其特征在于制备步骤包括 (1)化学修饰的含有富T寡核苷酸链片段以及随机序列片段的单链DNA固定在化学修饰的玻片上 2-20 μ M化学修饰的单链DNA按体积比为1:1的比例加入2X点样缓冲液，通过以接触式Cartesian microarray制作系统点阵于化学修饰的载玻片，点样完毕，将玻片置于70%湿度，室温条件下48 72h进行固定；并分别用质量百分数为O. 2% SDS和去离子水洗2次，每次2min，然后用醛基封闭液封闭15min ;再依次用质量百分数为O. 2% SDS和去离子水各洗2次，每次2min，吹干，备用； (2)随机序列互补链与单链DNA中的随机序列片段杂交 标记了荧光基团的随机序列互补链用杂交液稀释成1-10 μ M。将稀释好的溶液加在芯片的斑点处，盖上盖玻片；芯片置于湿盒中，25°C，过夜。次日早上，将芯片置于4°C，30min，再 25°C，15min ;然后依次用 IOmMMOPS, IOOmM NaNO3, pH7. 2 洗 5-lOmin，吹干，备用； (3)聚腺苷酸链与单链DNA中的富T寡核苷酸链片段杂交 标记了淬灭基团的聚腺苷酸链与单链DNA的杂交方法如步骤(2)所述。
5.按权利要求4所述的方法，其特征在于 步骤(I)使用的探针A的序列为5’ NH2-C12 AGCGTATCGACGAAATTTTTTTTTTTTTT-3’ ； 步骤(2)使用的探针B的序列为5，Cy5-CGTCGATACGCT-3，； 步骤(3)使用的探针C的序列为5， AAAAAAAAAAAAAA-BHQ33，。
6.如权利要求I或2所述的检测芯片的使用方法，其特征在于只需将待测样品添加到芯片上保持一段时间，冲洗后利用荧光芯片信号分析系统扫描芯片，通过分析荧光信号的变化，实现对Hg2+的检测。
7.按权利要求6所述的使用方法，其特征在于 ①所述的芯片的Hg2+的检测范围为IOniTlOOμ M ； ②所述的芯片对Hg2+具有离子选择性，除Hg2+外的其他常见的金属离子没有响应性。
全文摘要
本发明涉及一种基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg2+检测芯片及方法，其特征在于利用了Hg2+能特异性地与两条相邻全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链上的T碱基共价结合，形成稳定的分子间T–Hg2+-T结构，进而诱导与全T寡核苷酸链杂交的互补链的释放。制备包括三个步骤首先将检测探针固定在经化学修饰的玻片上，然后将荧光标记以及淬灭基团标记的互补链分别与其杂交。使用芯片时只需将待测样品添加到芯片上并保持一段时间，冲洗后利用荧光芯片信号分析系统扫描芯片，通过分析荧光信号的变化即可实现对Hg2+的检测。样品中Hg2+浓度越高，荧光信号增强得越多。检测的Hg2+的浓度范围是10nM-100μM。具有很好的离子选择性。
文档编号G01N21/64GK102912011SQ20121030639
公开日2013年2月6日 申请日期2012年8月24日 优先权日2012年8月24日
发明者赵建龙, 娄新徽, 杜娟, 徐元森 申请人:中国科学院上海微系统与信息技术研究所
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
