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专利名称：同时分析毒死蜱和甲基对硫磷的酶联免疫吸附测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种同时适用于针对残留毒死蜱和甲基对硫磷进行分析的酶联 免疫吸附测定试剂盒，该试剂盒主要适用于快速测定批量的水样、土壤等环境 样品和中毒样品及蔬菜等食品样品中的毒死蜱和甲基对硫磷残留。属于残留农 药检测领域。 背景技术：
农药及其代谢物传统的残留分析方法主要是依靠气相色谱(GC)、高效液相 色谱(HPLC)、质谱(MS)等物理化学分析手段，但由于农药使用规模不断扩大， 农药残留造成环境影响和人类健康的慢性和长期效应日益受到人们关注和担 忧，对农药残留的限制也越来越严格，对分析测定对象、种类、数量、范围、 指标等诸方面都提出了新的要求和更高的标准，但传统的理化分析方法通常繁 瑣复杂，工作量大，仪器昂贵，并要有熟练的技术人员及较长的分析周期。因 此人们迫切希望有一种简单、快速、灵敏及廉价的检测技术能在野外和实验室 内进行大批量的检测应用。免疫分析法正具备这些优点，所以尽管将免疫分析 用于农药残留分析的时间很短，仍然很快用于环境样品和食品样品中农药残留 的分析。
毒死蜱(Chlorpyrifos)，自1965年由美国Dow公司开发推广后即作为 一种广 谱性高效杀虫剂，在世界范围内广泛应用于粮食、棉花等经济作物的多种害虫 防治，并且对地下害虫、家畜害虫以及卫生害虫也有很好的防治效果。但是由 于毒死蜱对人畜的毒性相当高，近年来，因毒死蜱中毒的报道，仍然屡见不鲜。 尤其是在作物和蔬菜上的大量使用，对人体健康造成极大的�：Γ�这已引起人 们的关注。甲基对硫磷(Parathion-methyl)由1944年德国希拉台尔(G.Schrader) 化学家首先合成，1949年拜尔公司首先建厂生产，嗣后世界各地大量有多家公 司相继投产，上世纪60年代之后我国产、用量都很大。甲基对硫磷作为一种广 谱性高效杀虫剂，在世界范围内广泛应用于粮食、棉花等经济作物的害虫防治。 但是由于甲基对硫磷对人畜剧毒，因甲基对硫磷中毒的报道，屡见不鲜，目前 我国虽然已经禁止生产和使用甲基对硫磷。开发一种简单快速同时适用于毒死 蜱和甲基对硫磷农药残留现场监控的痕量分析方法具有重要的现实意义。
检测毒死蜱和甲基对硫磷残留量常规方法为高效液相色谱法等。然而该方 法的灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响很大，且该方法需要昂贵的仪器, 且过程繁瑣，不适合大批量样品的检测与分析。免疫分析为毒死蜱和甲基对硫 磷的残留检测提供了一个新的分析检测途径。要将免疫分析方法运用到实际中，则需要将其制备成试剂盒。现有技术公开了多种试剂盒，其中包括了检测甲基 对硫磷、毒死蜱等残留物的试剂盒及其制备方法。而现有技术中没有关于方便 同时检测毒死蜱和甲基对硫磷的技术。
本发明正是针对这一空白，经过发明人长时间的实验和测试，得到了一种 适用于同时针对毒死蜱和甲基对硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒。
发明内容要解决的问题
本发明的目的是提供一种同时检测毒死蜱和甲基对硫磷残留的酶联免疫吸 附测定试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种具有高特异性、高灵敏度，操作方法简单快 速，并能用于大批量样品同时快速检测残留毒死蜱和甲基对硫磷的试剂盒。技术方案
本发明涉及一种同时用于毒死蜱和甲基对硫磷残留分析的酶联免疫吸附测 定试剂盒，它基于免疫反应和酶促反应，包括盒体、设在盒体内的酶标板和/或 试管和设在盒体内的试剂，其特征在于，在酶标板的每个孔内含有抗毒死蜱和 甲基对硫磷通用包被抗原，盒内试剂包含抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体、毒 死蜱和甲基对硫磷标准溶液、酶标记抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体。盒内试
剂还包含洗涤液、底物稀释液、底物溶液和反应终止液。
在具体的实施方案中，本发明试剂盒包括盒体、设在盒体内的96孔/40孔 酶标板/试管和设在盒体内的试剂。在所述酶标板的每个孔内，吸附着由包被液 包被能与抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体特异性结合反应的通用包被抗原，并 用5%明胶进行封闭，盒内试剂包含洗涤液(稀释液)、底物稀释液、抗毒死蜱和 甲基对硫磷共同抗体(间接ELISA)、毒死蜱和甲基对硫磷标准溶液、酶标毒死蜱 和甲基对硫磷共同抗体例如辣根过氧化物酶标记羊抗兔共同抗体(适用于间接竟 争ELISA法)或辣根过氧化物酶标记抗毒死蜱和甲基对硫磷兔共同抗体(适用于 直接竟争ELISA法)、底物溶液和反应终止液。
其中固相通用包被抗原的制备及盒体内试剂组成如下
将通用包被抗原用pH9.6， 0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液(含1 2g碳酸钠和 2 ~ 4g碳酸氢钠，双蒸水1L,即包被液)稀释成0.5 ~ 4ug/mL,点于％孔MO孔 酶标板上，100ug/孔，并用5%明胶封闭；其中通用包被抗原为例如N-(oc-萘乙 酰基)-6-氨基己酸与卵清蛋白的复合物；
洗涤液(稀释液)一瓶，40-80mL/瓶，组成比例为磷酸二氢钾0.1-0.3g、磷酸 氩二钠2-4g、氯化钾0.1-0.3g、吐温-200.5-3mL、双蒸水500ml-1000ml，为正常使用的15-30倍浓缩液；
底物稀释液一瓶，30-50mL/瓶，配制如下柠檬酸3-6g,磷酸氢二钠l-3g， 双蒸水，为正常使用的5-10倍浓缩液；
酶底物为30%过氧化氢，10-15mL/瓶和邻苯二胺固体粉末4-6支，10-20mg/
支；
抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体(IgG)4瓶，100ml/瓶，工作浓度为1: 500-1000(间接ELISA法)；所述的抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体(IgG)为通过 毒死蜱和甲基对硫磷和牛血清白蛋白合成的偶联物作为免疫源注射家兔后产生 的能与毒死蜱和甲基对硫磷分子、毒死蜱和甲基对硫磷包被原特异性结合的免
疫球蛋白(IgG);
辣根过氧化物酶标记抗毒死蜱和甲基对硫磷兔共同抗体(直接ELISA法)或 者辣根过氧化物酶标记羊抗兔共同抗体(间接ELISA法)一瓶，200-400uL/瓶，为 正常使用时800-1500倍浓缩液；上述辣根过氧化物酶标抗毒死蜱和甲基对硫磷 共同抗体为毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体(IgG)与辣根过氧化物酶(HRP)结合形 成的复合物；
反应终止液一瓶，30-50ml/瓶，为2mol/L硫酸；
毒死蜱和甲基对硫磷不同浓度系列(O.l、 0.5、 2、 10、 50、 100mg/L)标准液 6瓶，l-4mL/瓶，甲醇定容，使用时用PBST稀释IO倍。
本发明的同时适用于毒死蜱和甲基对硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试 剂盒，能够同时检测水样、土壤、中毒样品、蔬菜等食品中毒死蜱和甲基对硫 磷的残留。试剂盒测定原理首先将农药分子与大分子载体(如蛋白质)偶联制得的 复合物作为通用包被抗原吸附于固相载体上，然后加入待测农药和抗毒死蜱和 甲基对硫磷共同抗体(间接ELISA法)或酶标抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体(直 接ELISA法)。通用包被抗原、待测农药与抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体(或 酶标抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体)进行竟争反应，待测农药含量多，则被结 合在通用包被抗原上的共同抗体少，最终酶促反应显色浅，反之结合在通用包 被抗原的共同抗体(或酶标共同抗体)多，最终酶促反应显色深。上述通用包被抗 原、待测农药、抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体或酶标抗毒死蜱和甲基对硫磷 共同抗体竟争结合反应后，再加入底物溶液出现显色反应加以测定(间接ELISA 法，加底物溶液前不需再加入酶标2抗)。当共同抗体或酶标共同抗体量一定时， 样品中的待测农药量越多，与通用包被抗原结合的酶标共同抗体就越少，发色 反应减弱，抑制率增高；反之，则发色反应增强，抑制率减低，因而根据已知 量农药的标准线和待检样品的抑制率，再根据抑制率与农药浓度之间的半对数关系作图即得标准曲线，并推算出待测农药的浓度。 抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体的制备
将人工合成的毒死蜱和甲基对硫磷免疫原(即毒死蜱和甲基对硫辚半抗原与 牛血清白蛋白结合形成的偶联物)多次注射家兔刺激其体的免疫系统产生能对毒 死蜱和甲基对硫磷农药分子或毒死蜱和甲基对硫磷包被原(毒死蜱和甲基对硫磷
半抗原与卵清蛋白人工合成的偶联物)特异性识别结合的免疫球蛋白(IgG)。
一、 免疫原的选择和制备
1、 选择毒死蜱和甲基对硫磷半抗原与载体蛋白结合比在40-50的偶联物作 免疫原。
2、 弗氏佐剂的制备石蜡油与羊毛脂3: 1混匀湿热高压灭菌得弗氏不完 全佐剂。在弗氏不完全佐剂中按规2mg/ml加卡介苗冻干粉混匀得弗氏完全佐剂。
3、 佐剂免疫原的制备将免疫原溶液慢慢解冻，用生理盐水稀释至 3mg/ml(以载体蛋白计)按免疫剂量吸入适当容积于注射器中，且免疫原与佐剂以 1: 1(V/V)混合，后以用无菌橡胶管相连的两支5ml灭菌玻璃注射器(总体积不超 过4ml)交替推动，使佐剂与免疫原溶液充分混合乳化，形成油包水乳液，直至 滴入冰水中暂不扩散为止。
二、 免疫方案
选用健康纯白新西兰雄兔(体重约1.5kg左右)作为免疫动物。注射前耳静脉 釆血制备少时对照血清(l-2ml),低温贮藏备用。然后将上述已制备好的佐剂免 疫原用背部皮内多点注射法注射，以20-25点左右小剂量注射入兔体内，总共注 射7次，时间间隔第一次与第二次为4个周，其后每次的时间间隔为2周。四 免后7-10天，耳缘静脉釆血制备少量抗血清，以阴性血清作对照，用琼脂双扩 散法和间接ELISA法检测血清效价。待琼扩散效价达1: 16以上，以间接ELISA 法测定抗血清终点效价达大于IO万，中点效价大于2万。颈动脉全釆血(无菌) 制备抗血清于-2(TC冻存。
三、 共同抗体的纯化
1、硫酸铵盐法(1)50ml烧杯中，X毫升血清+Xml生理盐水，置于电磁搅 拌器上。(2)缓慢滴入2X毫升饱和硫酸铵(PH7.0)，使达到50%的饱和度。控制 搅拌速度不出气泡。滴加完毕，继续搅拌5分钟。(3)室温放置30分钟。(4)离心 3000转/分x20分钟。(5)弃去上清液，沉淀物溶于2X亳升生理盐水，逐滴加饱 和硫酸铵Xml使达33。/。饱和度。(6)室温放置30分钟。("弃去上清液，将沉淀 物溶于2亳升生理盐水，装透析袋，置4'C冰箱0.01MPH7.0PB缓冲液透析， 换液数次，每次换液时用纳氏试剂检查NH^;至不出现黄色沉淀为止。2、 DEAE纤维素柱层析法(l)DEAE预处理(2)装柱、加样和洗脱(3)合并、 浓缩、测蛋白。
3、 免疫球蛋白(IgG)浓度的测定将纯化后的共同抗体溶液用生理盐水稀释
适当倍数后测OD280,按下式计算兔IgG含量
OD280
IgG% - - x稀释倍数
13.5
4、 共同抗体的纯度鉴定快速染色聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶浓度为 6.5 % 。
酶标共同抗体的制备(釆用改良过碘酸钠法)
具体操作如下称5-10mgHRP溶解于lml蒸馏水中，于上液中加入0.2-0.4mL 新配的0.1mol/LNalO4溶液，室温下避光搅拌15-30分钟。将上述溶液装入透析 袋中，用lmmol/LpH4.4的醋酸盐缓冲液透析，4'C过夜。加20-40uL0.2mol/LpH9.5 碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0-9.5,然后立即加入l-2ml含 有10-20mg纯化共同抗体的0.01mol/L碳酸盐缓冲液，室温避光轻轻搅拌2~3 小时。力口 0.14).2mL新配的4mg/mLNaBH4液，混匀，再置4。C2-3小时。将反 应液装入透析袋中，用0.15mol/LpH7.4PBS透析，4。C过夜。在搅拌下逐滴加入 等体积饱和硫酸铵溶液，置4。C1 2小时。3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀 物用半饱和硫酸铵溶液洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mol/LpH7.4'C的PBS 中。将上述溶液装入透析袋中，对0.15mol/LpH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除 铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000-12,000rpm离心30分钟，上清液即为酶结合 物，用等量甘油分装后，分别于-4。C、 -201:保存。经直接ELISA法(E-Ab法)测 定，效价为64000。
毒死蜱和甲基对硫磷通用人工抗原(和通用包被原)合成与鉴定
分别称取毒死蜱和甲基对硫磷人工半抗原各60mg、 72 mg共同溶于6ml无 水DMF,开启搅拌，加入160uL三正丁胺，冰浴下缓慢滴加同2ml无水DMF 溶解的氯甲酸异酯80uL,加毕，4'C搅拌反应l小时，然后于室温反应1.5小时。
称取BSA、 OVA各100mg,分别溶于8ml0.05mol/L、 pH8.7的硼酸盐缓冲 液，将上述反应液分为二等分，分别用滴管缓慢滴加到不同蛋白质溶液中，每 种蛋白质溶液中加一份，保持反温度15。C左右。加毕，室温搅拌反应12小时。
将反应液置透析袋中，于4"C下对0.01mol/L、 pH7.4PB透析，每6小时换一 次缓冲液，直至透析液中测不出毒死蜱和甲基对硫磷人工半抗原的紫外吸收为 止。精确计量透析袋内偶联物溶液的体积。将所得偶联物溶液稀释适当倍数，使其OD加约为0.4-0.8。配制毒死蜱和甲
基对硫磷人工半抗原溶液使其浓度为20ug/ml左右。另配制相应载体蛋白溶液使 其浓度为0.5mg/ml。分别对毒死蜱和甲基对硫磷人工半抗原溶液、载体蛋白溶 液和偶联物溶液进行紫外线吸收光谱扫描，扫描波长范围240-320nm，根据扫描
图谱定性确定半抗原是否与载体蛋白发生了偶联。然后根据OD292，分别计算各 自的摩尔吸光数S292。按下式计算毒死蜱和甲基对硫磷人工半抗原与载体蛋白
的结合比。
s292 (偶联物)-e292 (载体蛋白)
结合比=-
s292 (CBRH)
毒死蜱人工半抗原的合成
称取0.32molPSCl3于100ml三口瓶中，在15 ~ 20°C滴加1.2mol无水CH3OH, 并于该温度下继续反应l小时，用15ml水洗涤反应液2次，得黄色油状物。取 该产物1.8g用6mlTHF于50ml三口瓶中溶解，滴加6ml溶解有lg3，5，6-三氯吡 啶和0.8ml三乙胺的THF溶液，加毕继续反应2小时，过滤、浓缩，用正己烷/ 二氯甲烷=20: l的淋洗液柱色谱分离，得黄色油状物a。取6-氨基己酸1.3g加 入50ml三口瓶中，用2.5mol/L的氬氧化钠溶液溶解，在0 ~ l(TC滴加产物a2g, 于0。C左右滴加2.5mol/L的氢氧化钠溶液4ml，之后在5 ~ 15。C搅拌反应4.5小 时，加入适量蒸馏水调节pH~10,用石油醚/乙醚=7: 1的有机溶剂洗涤，水 层用盐酸调节pH-2.0，得白色絮状物，用乙醚提�。�乙醚提取液Na2C03干燥 并脱溶，得浅黄色粘稠液体即为毒死蜱人工半抗原。
H，-NMR5(ppm)( TMS、 CDC13): 1.40 (t,3H，-CH3 )， 1.56 ( m,2H，-CH2-)， 1.63 ( m,4H，2-CH2-) ， 2.38 ( t,2H，-CH2COO-) ， 3.16 ( m，2H，-CH2N-) ， 3.46 (m，lH，-跳)，4.33 (q+q,2H，-CH20-), 7.85 (s，lH,Ar國H)。
甲基对硫磷人工半抗原的合成
54克PSC13 ( 0.32mol)于100ml三口瓶中，15 ~ 20°C滴加重蒸无水CH3OH, 此条件下继续反应l小时。用水洗涤反应液，得黄色油状产物a 45克。
250ml三口瓶中加入乙醚lOOml、 a0.24mo1、 0.22mol对硝基苯酚，2(TC以下 加入三正丁胺3ml，此条件下滴加20。/。NaOH (0.24mol)，继续反应l小时，乙 醚层3%NaON洗涤.3*201111，再用蒸镏水洗涤，MgS04干燥，减压蒸除乙醚。 石油醚/乙醚(~7: l)柱分离，得产物b 40克。
b溶于乙醚，0~ l(TC滴加入6-氨基己酸(c)的NaON溶液(6-氨基己 酸溶于2.5MNaOH)，(反应物比例c: b l: 0.75)。此条件下滴加缚酸剂 2.5MNaOH，然后与5 ~ 15。C反应4.5小时，反应液为中性，产物亮黄色。加入适量水，之后用2.5MNaOH调整PH-10左右，反应液透明。水层用石油醚洗 涤后用2.5MHCl调整PH-2左右，用乙醚提�。�减压蒸馏除去乙醚。纯化石油 醚/乙醚(~7: 3)柱分离。NMR鉴定结构。
H，國NMR 5 (ppm)( TMS 、 CDC13): 1.12~1.88 (m，8H,-CH2CH2CH2CH2-)， 2.24~2.50(t，2H，-CH2CO-),2.88 3.18(m,2H,-CH2N-)，3.62~3.88(d,3H,-CH3),7.24~8.2 6(m,4H,Ar邻。 包被酶标板的制备
通用包被抗原用pH9.6,0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液(含l-2g碳酸钠和2-4g 碳酸氢钠，双蒸水1L)稀释成0.5-4ug/ml,在酶标板的每孔加100uL, 4'C下包被 过夜或37'C包被2h，倾去包被液，用PBST洗涤3次，拍干，然后在每孔中加 入150uL5。/c)明胶，放入37。C温箱中0.4-1小时后用PBST洗涤3次，拍干后干 燥保存。
检测样品的前处理 '
水样过滤后即可取样进行ELISA分析。
土样取10g土壤用20-40mL丙酮提取三次，合并提取液，浓缩，然后用 PBST稀释定容至lOmL,进行ELISA分析。
蔬菜样品取蔬菜样品用粉碎机绞碎后称取10g, 20-40mL丙酮提取三次， 合并提取液，浓缩，用PBST定容至10mL,取样进行ELISA分析。
血液取人体血液，加抗凝素后直接用ELISA法进行分析。
洗胃液(2%碳酸氢钠溶液)取10mL洗胃液，用稀HC1调pH值到中性后 即可用ELISA法进行分析。
呕吐物取样品研碎，离心取上清用ELISA法进行分析。 试剂盒操作过程
1) 直接竞争ELISA法取出一块包被有毒死蜱和甲基对硫磷通用包被抗原 酶标板，恢复到室温后备用；加入50uL标样或处理好的样品到各自孔中，标样 和样品做2-4个重复；加入50uL稀释的酶标共同抗体，37。C孵育l-2小时；倒 出孔中的液体，将微板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体，用 200uL稀释好的PBST洗2-6次，拍干；然后每孔加入100uL底物液，轻微振匀， 并在37匸暗处孵育15-25分钟进行显色反应；加入50uL反应终止液，混合好后， 测定OD45。nm值或者OD49。nm值。
2) 间接竞争ELISA法取出 一块包被有毒死蜱和甲基对硫磷通用包被抗原 酶标板，恢复到室温后备用；加入50uL标样或处理好的样品到各自孔中，标样 和样品做2-4个重复；加入50uL稀释的共同抗体，37。C孵育l-2小时倒出孔中的液体，将微孔板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体，用200uL 稀释好的PBST洗2-6次；加入lOOuL稀释好酶标二抗，37。C孵育l-2小时；倒 出孔中的液体，将微孔板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体， 用200uL稀释好的PBST洗2-6次；然后每孔加入100uL底物液与显色物质的 混和液，轻微振匀，并在37。C暗处孵育15-25分钟进行显色反应；加入.50uL反
应终止液，混合好后，测定OD45。^值或者OD49。皿值。
以所获得的标样和样品吸光值的平均值计算各孔的吸光值的抑制率
(ODmax-ODmin)-(ODx-ODmin) 抑制率(％) =-- X 100%
(ODmax-ODmin)
OD皿为不加药时的吸光值，ODx为农药X时的吸光值，ODmin为空白对照
孔的吸光值。
计算的标样值绘成一个对应毒死蜱和甲基对硫磷浓度(mS几)的半对数坐标 系统曲线图，直接竟争ELISA法的校正曲线在0.01 10mg/L范围内为线性；间 接竟争ELISA法的校正曲线在0.005-10mg/L，范围内为线性，对应样品浓度可从 校正曲线读出，也可根据标样的浓度与抑制率求出线性方程，然后求出对应样 品的浓度。有益效果
本发明的优点是能同时用于水样、土壤、中毒样品、蔬菜等食品中毒死蜱 和甲基对硫磷残留的检测，样品的前处理过程简单，能同时检测批量的样品， 样品检测成本远低于传统的检测方法。试剂盒釆用强特异性、高效价的共同抗 体，提高检测的灵敏度、准确度、精密度。试剂盒的保存期超过12个月。本发 明简单快速，适用于农药残留现场监控的痕量分析方法，具有重要的现实意义。 具体实施例方式
在下面实施例中更详细地描述本发明，并非对本发明的限制，其中比例和 百分比在没有特别说明的情况下均为重量/重量比。 实施例1
本发明试剂盒产品包括盒体、盒体内的96孔/40孔酶标板和检测试剂。 试剂盒中釆用毒死蜱和甲基对硫磷人工半抗原与卵清蛋白的复合物作为通 用包被抗原，将其用pH为9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲溶液(含lg碳酸钠和4g 碳酸氢钠，双蒸水1L)稀释成4ug/mL,点于96孔/40孔酶标板上，100ug/孔，并 用5%明胶封闭。
盒内试剂包含洗涤液(稀释液)、底物稀释液、抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体(间接ELISA)、毒死蜱和甲基对硫磷标准溶液、辣根过氧化物酶标记羊抗兔 共同抗体(适用于间接竟争ELISA法)、辣根过氧化物酶标记抗毒死蜱和甲基对 硫磷兔共同抗体(适用于直接竟争ELISA法)、底物溶液和反应终止液。配制方 法如下
洗涤液(稀释液)40mL，组成比例为磷酸二氢钾O.lg、磷酸氢二钠4g、氯化 钾O.lg、吐温-203mL、双蒸水1000ml，为正常使用的15-30倍浓缩液；
底物稀释液50mL,配制如下柠檬酸3g,磷酸氢二钠lg，双蒸水，为正 常使用的5 10倍浓缩液；
酶底物为30%过氧化氢，15mL和邻苯二胺固体粉末40mg;
毒死蜱和甲基对硫磷和牛血清白蛋白合成的偶联物作为免疫源注射家兔后 产生的能与毒死蜱和甲基对硫磷分子、毒死蜱和甲基对硫磷通用包被原特异性 结合的免疫球蛋白(IgG),抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体(IgG)400ml，工作浓 度为1: IOOO(间接ELISA法)；
辣根过氧化物酶标记抗毒死蜱和甲基对硫磷兔共同抗体(直接ELISA法)或 者辣根过氧化物酶标记羊抗兔共同抗体(间接ELISA法)200uL，为正常使用时 800-1500倍浓缩液；上述辣根过氧化物酶标抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体为 毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体(IgG)与辣根过氧化物酶(HRP)结合形成的复合物；
反应终止液为2mol/L的硫酸30mL;
毒死蜱和甲基对硫磷不同浓度系列(O.l、 0.5、 2、 10、 50、 100mg/L)标准液 6瓶，l-4mL/瓶，甲醇定容，使用时用PBST稀释IO倍。 实施例2
本发明试剂盒产品包括盒体、盒体内的96孔/40孔酶标板和检测试剂。 试刑盆甲米用毒死蜱和甲基对硫磷人工半抗与卵清蛋白的复合物作为通用 包被抗原(CBRH-OVA),将其用pH为9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲溶液(含2g碳 酸钠和2g碳酸氢钠，双蒸水1L)稀释成0.5ug/mL，点于96孔/40孔酶标板上， 薩g/孔,并用5%明胶封闭。
盒内试剂包含洗涤液(稀释液)、底物稀释液、抗毒死蜱和甲基对硫磷共同 抗体(间接ELISA)、毒死蜱和甲基对硫磷标准溶液、辣根过氧化物酶标记羊抗兔 共同抗体(适用于间接竟争ELISA法)、辣根过氧化物酶标记抗毒死蜱和甲基对 硫磷兔共同抗体(适用于直接竞争ELISA法)、底物溶液和反应终止液。配制方 法如下
洗涤液(稀释液)80mL,组成比例为磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钠2g、氯化 钾0.3g、吐温-200.5mL、双蒸水500ml，为正常使用的15-30倍浓缩液；底物稀释液30mL，配制如下柠檬酸6g，磷酸氢二钠lg，双蒸水，为正 常使用的5-10倍浓缩液；
酶底物为30%过氧化氢，lOmL和邻苯二胺固体粉末120mg;
毒死蜱和甲基对硫磷和牛血清白蛋白合成的偶联物作为免疫源注射家兔后 产生的能与毒死蜱和甲基对硫磷分子、毒死蜱和甲基对硫磷通用包被原特异性 结合的免疫球蛋白(IgG),抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体(IgG)400ml，工作浓 度为1: 500(间接ELISA法)；
辣根过氧化物酶标记抗毒死蜱和甲基对硫磷兔共同抗体(直接ELISA法)或 者辣根过氧化物酶标记羊抗兔共同抗体(间接ELISA法)400uL，为正常使用时 800-1500倍浓缩液；上述辣根过氧化物酶标抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体为 毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体(IgG)与辣根过氧化物酶(HRP)结合形成的复合物；
反应终止液为2mol/L的硫酸50mL;
毒死蜱和甲基对硫磷不同浓度系列(O.l、 0.5、 2、 10、 50、 100mg/L)标准液 6瓶，l-4mL/瓶，甲醇定容，使用时用PBST稀释IO倍。 实施例3
本发明试剂盒产品包括盒体、盒体内的96孔/40孔酶标板和检测试剂。 试剂盒中釆用毒死蜱和甲基对硫磷人工半抗与卵清蛋白的复合物作为通用 包被抗原(CBRH-OVA)，将其用pH为9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲溶液(含2g碳 酸钠和2g碳酸氢钠，双蒸水1L)稀释成0.5ug/ml，点于96孔/40孔酶标板上， 100ug/孔，并用5%明胶封闭。
盒内试剂包含洗涤液(稀释液)、底物稀释液、抗毒死蜱和甲基对硫磷共同 抗体(间接ELISA)、毒死蜱和甲基对硫磷标准溶液、辣根过氧化物酶标记羊抗兔 共同抗体(适用于间接竟争ELISA法)、辣根过氧化物酶标记抗毒死蜱和甲基对 硫磷兔共同抗体(适用于直接竟争ELISA法)、底物溶液和反应终止液。配制方 法如下
洗涤液(稀释液)60mL,组成比例为磷酸二氩钾0.2g、磷酸氢二钠3g、氯化 钾0.2g、吐温-20 1.5mL、双蒸水750ml,为正常使用的15-30倍浓缩液；
底物稀释液45mL，配制如下柠檬酸4g，磷酸氢二钠2g，双蒸水，为正 常使用的5~10倍浓缩液；
酶底物为30%过氧化氢，12mL和邻苯二胺固体粉末90mg;
毒死蜱和甲基对硫磷和牛血清白蛋白合成的偶联物作为免疫源注射家兔后 产生的能与毒死蜱和甲基对硫磷分子、毒死蜱和甲基对硫磷包被原特异性结合 的免疫球蛋白(IgG)，抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体(IgG)400ml，工作浓度为1:750(间接ELISA法)；
辣根过氧化物酶标记抗毒死蜱和甲基对硫磷兔共同抗体(直接ELISA法)或 者辣根过氧化物酶标记羊抗兔共同抗体(间接ELISA法)300uL，为正常使用时 800-1500倍浓缩液；上述辣根过氧化物酶标抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体为 毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体(IgG)与辣根过氧化物酶(HRP)结合形成的复合物；
反应终止液为2mol/L的硫酸40mL;
毒死蜱和甲基对硫磷不同浓度系列(O.l、 0.5、 2、 10、 50、 100mg/L)标准液 6瓶，l-4mL/瓶，甲醇定容，使用时用PBST稀释10倍。 实施例4
本发明试剂盒产品包括盒体、盒体内的96孔/40孔酶标板和检测试剂。 试剂盒中釆用毒死蜱和甲基对硫磷人工半抗与卵清蛋白的复合物作为通用 包被抗原，将其用pH为9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲溶液(含2g碳酸钠和2g碳 酸氢钠，双蒸水1L)稀释成0.5ug/mL，点于96孔/40: -L酶标板上,隐g/孔， 并用5%明胶封闭。
盒内试剂包含洗涤液(稀释液)、底物稀释液、抗毒死蜱和甲基对硫磷共同 抗体(间接ELISA)、毒死蜱和甲基对硫磷标准溶液、辣根过氧化物酶标记羊抗兔 共同抗体(适用于间接竞争ELISA法)、辣根过氧化物酶标记抗毒死蜱和甲基对 硫磷兔共同抗体(适用于直接竞争ELISA法)、底物溶液和反应终止液。配制方 法如下
洗涤液(稀释液)70mL,组成比例为磷酸二氢钾O.lg、磷酸氢二钠4g、氯化 钾0.15g、吐温-20 5.5mL、双蒸水1000ml,为正常使用的15-30倍浓缩液；
底物稀释液45mL,配制如下柠檬酸3g，磷酸氢二钠2.5g，双蒸水，为正 常使用的5-10倍浓缩液；
酶底物为30%过氧化氢，14mL和邻苯二胺固体粉末120mg;
毒死蜱和甲基对硫磷和牛血清白蛋白合成的偶联物作为免疫源注射家兔后 产生的能与毒死蜱和甲基对硫磷分子、毒死蜱和甲基对硫磷通用包被原特异性 结合的免疫球蛋白(IgG),抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体(IgG)400ml，工作浓 度为1: 700(间接ELISA法);
辣根过氧化物酶标记抗毒死蜱和甲基对硫磷兔共同抗体(直接ELISA法)或 者辣根过氧化物酶标记羊抗兔共同抗体(间接ELISA法)200uL，为正常使用时 800-1500倍浓缩液；上述辣根过氧化物酶标抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体为 毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体(IgG)与辣根过氧化物酶(HRP)结合形成的复合物；
反应终止液为2mol/L的硫酸350mL;毒死蜱和甲基对硫磷不同浓度系列(O.l、 0.5、 2、 10、 50、 100mg/L)标准液 6瓶，l-4mL/瓶，甲醇定容，使用时用PBST稀释IO倍。 对本发明产品进行如下测试 1、保存期试验
将试验剂盒放置于4'C和-2(TC保存，分别取O， 20, 40， 60， 120, 180， 240，
300和360d的试剂盒，以最佳共同抗体抗原工作浓度为测定浓度，进行标准样
品检测以测定其检测效果。保存期测定结果如下表
表l.直接竟争ELISA法试剂盒保存期试验结果
时间(d)0204060120180240300360
OD450 ( 4匸)1.070l扁1.0671.0651.0641.0631.0631.0611.059
OD450 ( 20匸)1.071l細1.0651.0641.0641.0621.0621.061l細
表2.间接竟争EIISA法试剂盒保存期试验结果时间(d)0204060120180240300360
OD450 ( 4匸)U181.1181.1151.1151.1131.1091.1131.1131.012
OD450 ( 20°C )1.124U24U191.117U141.1131.1111.108U04
以上结果可以看出，试剂盒在4X:下至少可保存12个月以上。
2、 试剂盒灵敏度测定
将毒死蜱和甲基对硫磷标准溶液稀释成系列浓度，用直接ELISA法分析分
别得到以下曲线方程为y=4.965+16.556x ,毒死蜱和甲基对硫磷在 0.01mg/L-10mg/L范围内，Logit(B/Bo)与毒死蜱和甲基对硫磷深度的对数值呈显 著的线性关系，相关系数为r2=0.9471，检出限为0.01mg/L。用间接ELISA法分 析分别得到曲线方程为y=63.654+9.938x,毒死蜱和甲基对硫磷在 0.005mg/L-10mg/L范围内，Logit(B/BO)与毒死蜱和甲基对硫磷浓度的对数值呈 著的线性关系，相关系数为r2=0.9885,检出限为0.005mg/L。
3、 准确度试验精密度试验
取三个浓度的毒死蜱和甲基对硫磷标样，添加到样品中，每个浓度设6个 重复，进行测定。试剂盒回收率的结果如下，水为95.8%-105.5%，蔬菜为100.8 %-107.5%。水样的变异系数均低于5.5%，蔬菜的变异系数均低于11.5%。
4、 试剂盒特异性试验
选择毒死蜱和甲基对硫磷的类似物如克百威、灭多威、oc-萘酚、乙基对硫 磷，反应步骤同试剂盒搡作，得到各种农药抑制中浓度。再用下式计算农药对 毒死蜱和甲基对硫磷的交叉反应性。交叉反应率愈�。�反应的特异性愈强。交 叉反应率愈大，交叉反应率可按下式计算，抑制率为50%甲萘威的浓度
交叉反应率(％) 二 -^- X 100%
抑制率为50%其他农药的浓度
本试验测定结果见表3。从表3可以知道，间接EUSA法抑制率达50% 时，毒死蜱和甲基对硫磷所需浓度为30ug/L，其它几种有机磷类农药所需浓度 为120-1000ug/L。说明该试剂盒的特异性好，可保证对样品中毒死蜱和甲基对 硫磷残留测定结果的可靠性。
权利要求
1. 一种同时使用于毒死蜱和甲基对硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，它包括盒体、设在盒体内的酶标板和/或试管和设在盒体内的试剂，其特征在于，在酶标板的每孔内含有抗毒死蜱和甲基对硫磷通用包被抗原，盒内试剂包含抗毒死蜱和甲基对硫磷抗体、毒死蜱和甲基对硫磷标准溶液、酶标记抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体。
2. 根据权利要求l所述的试剂盒，其中，所述抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗 体为通过毒死蜱和甲基对硫磷和牛血清白蛋白合成的偶联物作为免疫源注射家 兔后产生的能与毒死蜱和甲基对硫磷分子、毒死蜱和甲基对硫磷通用包被原特 异性结合的免疫球蛋白(IgG)。
3. 根据权利要求l所述的试剂盒，其中，所迷酶标抗毒死蜱和甲基对硫磷共 同抗体为毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体(IgG)与辣根过氧化物酶(HRP)结合形成 的复合物。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其中,所述的酶标抗毒死蜱和甲基对硫磷 共同抗体是辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体和辣根过氧化物酶标记抗毒死蜱和 甲基对硫磷兔共同抗体。
全文摘要
本发明公开了一种适同时用于毒死蜱和甲基对硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，它包括盒体、设在盒体内的酶标板/试管及设在盒体内的试剂。在酶标板的每孔内，由包被液包被能与抗毒死蜱和甲基对硫磷共同抗体特异性合反应的通用包被抗原，并用明胶进行封闭，盒内试剂包含洗涤液、底物稀释液、毒死蜱和甲基对硫磷标准溶液、抗毒死蜱和甲基对硫磷抗体、酶标抗毒死蜱和甲基对硫磷抗体、底物、显色物质和反应终止液。本发明能用于水、土壤、蔬菜等食品中及中毒样品中毒死蜱和甲基对硫磷残留的同时快速检测，样品的前处理过程简单，能同时检测批量的样品，样品检测成本低于传统的检测方法。
文档编号G01N33/543GK101477120SQ200810183488
公开日2009年7月8日 申请日期2008年12月18日 优先权日2008年12月18日
发明者孙家隆 申请人:孙家隆