专利名称：检测人全血中他克莫司药物浓度的化学发光酶联免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学检测技术，特别是一种用于人全血中他克莫司药物浓度的检测试剂盒。
背景技术：
他克莫司(tacrolimus)是由Fujisawa公司1984发现的一类大环内酯类免疫抑制剂，于1989年首次应用于临床，现在已经被广泛应用于移植后的排斥治疗。其作用机理是，他克莫司与其结合蛋白FKBP12相结合后抑制了磷酸酶的活性，从而抑制核调蛋白和T 细胞活化因子(如白介素_2)、原癌基因和细胞因子相应受体(如白介素-2受体)的表达。但实际情况是，他克莫司的个体吸收率和清除率差别很大，且用药剂量与血药浓度之间缺乏紧密的相关性，在高血浓度时有一定的毒性，主要是神经毒性、肾毒性和糖代谢异常等。由于他克莫司的治疗窗范围较窄，给临床治疗增加了相当大的难度，因此需要反复测定期血中浓度以调整用药剂量。据相关数据统计，截至2008年，我国移植手术总量已经超过10万次，现在我国已经成为继美国之后的世界第二大器官移植国家，每年器官移植手术已经超过1万例，而且随着经济及医疗水平的发展，以后的器官移植患者会越来越多。他克莫司虽然较环孢霉素 A上市晚，但其药效更为明显，是环孢霉素类免疫抑制剂的50-100倍，并且具有提高移植生存率、降低急性排斥反应发生率、降低感染率、对类固醇无相对依赖性及副作用较少等特点，现在是当前居于市场前几位的免疫抑制剂，约占当前免疫抑制剂市场份额的10%左右。 现在国内市场上用于他克莫司检测的试剂盒几乎全部依赖进口，而这些进口试剂盒全部用本公司配套的分析仪器进行检测，这样就提高了医院及检测中心的准入门槛，对检测实验操作人员要求也比较高，同样附加于病人的诊疗费用也相应提高。但实际情况是，现在我国人均国民经济水平偏低，医疗卫生检测机构水平差距非常大，器官移植病人的医疗负�：苤兀芏嗟胤揭皆杭凹觳庵行拿挥心芰郝虬汗蟮囊搅萍觳馍璞�。这样，市场更需要操作方便简捷，能节约病人、医院经济成本且质量稳定可靠能达到检测要求的适合中国现有国情的检测试剂盒。为达到个体化给药方案，避免毒副反应和排斥反应的发生，只能在有条件的医院才能将监测其血药浓度作为常规工作，目前测定全血中他克莫司浓度的方法主要有两大类高效液相色谱法和免疫标记分析法。高效液相色谱法是70年代发展起来的一种测定血药浓度的物理方法，采用特殊装置的柱色谱法，利用同一种吸附剂对不同物质吸附能力的差别进行分离鉴定，其特异性高，只测定他克莫司母药的浓度而不测定其代谢物的浓度，结果准确可靠，但其样本前处理操作繁琐，且需特殊的技术和昂贵的设备以及高素质的专业技师进行操作，一定程度上妨碍其深入开展和普及。免疫标记分析法是以抗原或半抗原与抗体之间特异性亲和反应为基础的免疫标记技术目前用于测定血药浓度的免疫分析法常用的标记物有放射性核素、荧光剂和酶三大类，其测定技术分别称为放射免疫分析法(Radioimmunoassay，RIA)、荧光免疫分析法 (Fluoroimmunoassay, FPIA)禾口酶免分析法(Enzyme immunoassay, EIA)。他们共同的优点是特异性强、灵敏度和精密度高、准确性好、简便、快速，易实现自动化，适用于常规和急诊工作。放射免疫测定法虽然具有高灵敏度、高特异性的优点，但其操作步骤较多，需要特殊的检测设备，并且使操作人员受到放射性�：Γ笔约梁械氖褂闷谙抟不崾鼙昙堑姆派湫晕镏实乃ケ淦诘南拗疲式昀葱矶啾纠词褂肦IA测定的药物多已改用其他免疫分析方法。荧光偏振免疫测定法是基于待测物和联接了荧光的待测物对特定的待测物抗体上有限的受体结合位点的竞争性结合。当待测样品中存在能与抗体结合的药物时，将形成无荧光药物-抗体复合物，从而引起偏振度的下降，根据该偏振度下降的程度即可确定出样品中待测物的浓度。该法灵敏度高，选择性好，但缺点是需要特殊的检测设备，价格较为昂贵，操作也不太方便。酶免法是用酶代替荧光体标记抗原或抗体，利用该酶的底物显色的程度来确定样品中药物的浓度。化学发光免疫分析是继荧光、放射性同位素和酶免分析之后发展起来的一项新的免疫分析技术，根据大量的实验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性、灵敏性及发展前景来看，在非放射性标记分析技术中化学发光免疫分析处于领先地位，代表了当今世界发展的方向和潮流，它不仅具有免疫反应的特异性，而且具有化学发光反应的高灵敏度，成为取代放射免疫分析和酶免疫分析技术的首选。化学发光显色底物对化学发光免疫检测效果具有重要的影响，直接影响检测试剂盒的灵敏度及稳定性，好的化学发光显色底物能使检测系统的检测限达到皮克级，甚至更高，而效果一般的化学不但灵敏度低，不能满足试验要求，而且稳定性极差，使得每次检测结果差异极大，这样直接影响病人血药浓度的监测结果，导致医生不能根据每次检测结果对病人的用药做出正确的判断。而目前国内市售发光显示底物液用于板式的化学发光检测试剂盒，其发光性能常常达不到检测要求的灵敏性和稳定性。
发明内容
本发明根据上述领域的需求空白，提供一种用于检测人全血中他克莫司浓度的化学发光酶联免疫试剂盒，既可以应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，适合国内现状，成本低，但检测效果与进口试剂无显著差异可实现大批量快速检测，更易推广应用。一种用于化学发光酶联免疫检测的化学放光底物显色液，包括为底物A液和底物B液，其中A液为的组成为pH值为7. 2 8. 5，浓度为0. 01 0. 03mol/L的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(W/V)为0. 02 0. 05% Proclin300,1. 0 2. 0%吐温-20和10mM/L 过氧化脲溶液；B液为50mM/L的1Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0. 02 0. 05% Proclin300,0. 01 0. lmmol/L 的四苯硼酸盐，0. 2 0. 6mmol/L 的 4-碘苯酚，0.
的BSA，0. 1 的溴化十六烷基三甲基铵，10 50Mm/L鲁米诺溶液。一种检测人全血中他克莫司药物浓度的化学发光酶联免疫试剂盒，包括化学发光酶标板，酶标记物；所述化学发光酶标板上的包被原为抗他克莫司单克隆抗体、二抗或与载体蛋白偶联的他克莫司半抗原；其特征在于还包括上述化学发光底物显色液，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的抗体、抗原或抗抗体。所述包被原为他克莫司单克隆抗体，羊抗鼠抗抗体或兔抗鼠抗抗体，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的他克莫司半抗原。所述包被原为羊抗鼠抗抗体或兔抗鼠抗抗体，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的他克莫司半抗原或他克莫司单克隆抗体。所述包被原为与载体蛋白偶联的他克莫司半抗原，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的抗他克莫司单克隆抗体。所述载体蛋白为甲状腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、 蓝血蛋白或卵清蛋白。所述试剂盒还包括前处理液、样品稀释液、他克莫司标准品溶液、他克莫司质量控制溶液、浓缩洗涤液。所述样品前处理液为含20_100mM硫酸锌的甲醇溶液与乙二醇混合液，甲醇与乙二醇的体积比3 1。所述样品稀释液为含0. 3-0. 5M NaCL的50mM的磷酸盐缓冲液。他克莫司标准品溶液和质量控制品溶液为含有不同浓度他克莫司的人全血溶液。所述浓缩洗涤液pH值为7. 2 8. 5，含有终浓度为0. 02 0. 05% Proclin300, 1. 0 2. 0%吐温-20和0. 01 0. 03mol/L的磷酸盐缓冲液。 本发明将化学发光技术与他克莫司的免疫分析法有效的结合，采用了自制的发光信号强、持续时间长、更高信噪比的化学发光底物显色液，与进口试剂盒检测效果几乎无差别，检测效果明显优于国产试剂盒，而价格上明显低于进口试剂盒，为国内患者所能承受， 对国内器官移植患者具有重大意义。另外本发明的试剂盒采用了化学发光酶联免疫方法， 比酶免疫分析法灵敏度高，能够简便、快速、灵敏、稳定的检测血中他克莫司药物浓度。本发明的检测人全血中他克莫司药物浓度的化学发光法酶联免疫试剂盒主要采用直接竞争ELISA方法定量检测样品中他克莫司的浓度。本试剂盒中采用高特异性的他克莫司的单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性。实验结果表明，本试剂盒具有特异性高、灵敏度更高、精确度高、准确度高等特点。本试剂盒的主要试剂都采用工作液形式，使用方便， 成本低廉。用本发明试剂盒检测他克莫司的方法，操作简便，简化了传统检测方法的步骤， 缩短了检测时间，对样品的前处理要求低，能同时快速检测大批量的样品。试验结果证明， 本发明的试剂盒
图1为包被原为他克莫司的单克隆抗体的检测试剂盒的标准曲线。图2发光底物比较实验。从上往下依次为进口发光底物，本发明的发光底物，国内现有发光底物。国内现有发光底物明显低于本发明的产品，而本发明的产品与进口发光底物之间无太大差距。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、他克莫司单克隆抗体为包被原，标记物为酶标半抗原的试剂盒制备及使用—、以他克莫司单克隆抗体为包被原、酶标记他克莫司半抗原为标记物的试剂盒检测原理如下在微孔条上预包被他克莫司单克隆抗体，样本中的他克莫司与酶标记的他克莫司与微孔条上预包被的抗他克莫司抗体进行竞争性结合，这样，样本吸光值与其样本中所含他克莫司的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中他克莫司的量。二、试剂盒组成I号试剂盒1、包被有包被原的化学发光酶标板包被原为抗他克莫司的鼠源单克隆抗体，包被浓度可以为0. 1-lOng/ml。2、酶标记半抗原为辣根过氧化物酶标记的他克莫司半抗原，其工作稀释度为 1 3000。3、他克莫司标准品溶液6瓶，2ml/瓶，浓度分别为0ng/ml、3ng/ml、6ng/ml、12ng/ ml、 20ng/ml、30ng/mlo4、他克莫司质量控制液2瓶，2ml/瓶，浓度分别为5ng/ml、25ng/ml。5、样品稀释液为含0. 3M NaCL的50mM的磷酸盐缓冲液，20ml/瓶，1瓶6、化学发光底物显色液A液和B液各1瓶，其中A液为的组成为pH值为8. 0， 浓度为IOmM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(V/V)为0. 02% Proclin300,1. 0%吐温-20 和IOmM过氧化脲溶液；B液为50mM的1Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0. 02 % ft~OClin300，2mM的4-碘苯酚，0. 的BSA，0. 1 %的溴化十六烷基三甲基铵，IOMm鲁米诺溶液。7、浓缩洗涤液pH值为7. 4，含有在所述浓缩洗涤液中的终浓度为0.05% PrOclin300、在所述浓缩洗涤液中的终浓度为2. 0%吐温_20、0. 02mol/L的磷酸盐缓冲液， 40ml/瓶，1 瓶。8、样品处理液为含20_100mM硫酸锌的甲醇溶液与乙二醇混合液，IOml/瓶，1瓶。II号试剂盒其它同I号，仅化学反光底物显色液成分有改变:A液和B液各1瓶，其中A液为的组成为PH值为8.0，浓度为30mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(V/V)为0. 05 % Proclin300,0. 5%吐温-20和IOmM过氧化脲溶液；B液为50mM的Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/ν)为0. 05% Proclin300, 3mM的4-碘苯酚，1 %的BSA，1 %的溴化十六烷基三甲基铵，50mM鲁米诺溶液。III号试剂盒其它同I号，仅化学反光底物显色液成分有改变:A液和B液各1瓶，其中A液为的组成为PH值为8.0，浓度为20mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(V/V)为0. 04 % Proclin300,0. 吐温-20和IOmM过氧化脲溶液；B液为50mM的Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/ν)为0. 04% Proclin300，2mM的4-碘苯酚，0. 7%的BSA, 0. 4%的溴化十六烷基三甲基铵，30mM鲁米诺溶液。对照试剂盒其它同I号试剂盒，而化学反光底物显色液为市售显色液(A液为过氧化脲溶液，B液为鲁米诺溶液，购自湖州英创生物科技有限公司)。
三、制备方法1、包被有他克莫司单克隆抗体的化学发光酶标板的制备(1)他克莫司单克隆抗体选择Fitzgerald公司生产的他克莫司单克隆抗体mouse monoclonal anti-tacrolimus antibody, IgM0(2)包被有包被原的化学发光酶标板的制备用包被缓冲液(pH值为9. 6,0. lmol/L碳酸盐缓冲液)将以上他克莫司抗体进行 1 8000稀释，加入到化学发光酶标板孔中，每孔100μ 1，37°C反应2小时，甩掉包被液后， 拍干，每孔加入200 μ 1的封闭液(含终浓度为2%牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液)，37°C反应 2小时，甩掉封闭液，拍干，自然晾干，用铝箔袋真空包装保存。2、酶标半抗原的制备(1)半抗原的制备准确称取250mg他克莫司，18mg琥珀酸酐，6mg嘧啶溶解于6. 3ml 二氯甲烷中，边搅拌边加入42ul三乙胺，在室温下继续搅拌2小时，然后用二氯甲烷稀释至20ml，再分别用等量的0. 1当量盐酸、纯化水、饱和的氯化钠各洗涤一次后用分液漏斗静止分层，过滤收集下层液(二氯甲烷)。所得到的有机相放在无水硫酸镁进行干燥，用磁力搅拌器搅拌30 分钟后，除掉硫酸镁，用旋转蒸发仪浓缩，直至呈轻微黄色泡沫。在旋转蒸发仪上将上述溶液进行干燥，得到他克莫司半琥珠酸酯。称取35mg上述产物，5. 4mgN-羟基琥珀酰亚胺和8. 8mgN, N- 二环己基碳化二亚胺溶于5ml乙酸乙酯，在磁力搅拌器上继续搅拌M小时。 6000rpm离心5分钟，取上清备用。(2)用辣根过氧物酶对上述半抗原进行标记称取Img上述半抗原溶于aiil N, N- 二甲基甲酰胺，室温搅拌30min，逐滴加入到 IOml (含5mg)的辣根过氧化物酶溶液中，室温搅拌过夜后，用kphadex G-25进行层析纯化。实施例2.以他克莫司单克隆抗体为包被原、酶标记半抗原为标记物的试剂盒的应用本发明试剂盒用于定量检测人全血中他克莫司的药物浓度。1、人全血样品的前处理将2_8°C冰箱保存的人全血他克莫司标准品及质量控制品溶液和待检样品，在振荡器上充分振荡混勻，立即精确吸取150μ 1每个样品到相应的离心管中，加入等体积的样品前处理液后立即盖好管盖，用漩涡混合仪高速旋转，确保每个样品充分混勻，将离心管放入离心机，13000r/min，离心6分钟。取20 μ 1用于分析。2、检测向II号试剂盒的化学发光酶标板中加入样品稀释液30μ 1，然后在每孔中加入他克莫司标准品溶液、质量控制品溶液及样品溶液20 μ 1，每孔中各加入辣根过氧化物酶标记的半抗原50 μ 1，用盖板模封板，37°C恒温箱中反应1小时，甩干孔内液体，洗板5次，拍干； 每孔加入底物显色液A液过氧化脲，底物显色液B液鲁米诺，轻轻振荡混勻，在2-5min内， 用化学发光仪，测定每孔发光值(RUL值)。3、检测结果分析以标准品浓度标示值为X轴，以检测发光值为Y轴，进行四参数拟合，得到回归方程及拟合曲线图1。将待检测样品吸光度带入回归方程，即可求得样品浓度。本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专业软件，此法更便于大量样品的快速分析。4、试剂盒灵敏度、精密度、准确度和保存期检测(1)标准品精密度试验从实施例1步骤三制备的同一型号(II号)试剂盒的不同批次(01批、02批、03 批)的试剂盒中各抽取10个试剂盒，从每个试剂盒的化学发光酶标板中各抽出20个微孔， 测定20ng/ml他克莫司标准溶液的吸光值(0D值)，计算变异系数CV%。实验结果如表1所示，标准品吸光值的变异系数在5. 46% -15. 08%之间，符合精密度小于或者等于20%的规定。表1标准品重复性试验(CV % )
权利要求
1.用于化学发光酶联免疫检测的化学放光底物显色液，包括为底物A液和底物B液， 其中A液为的组成为pH值为7. 2 8. 5，浓度为10 30mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度 (V/V)为0. 02 0. Proclin300,0. 1 1. 0%吐温-20禾Π IOmM过氧化脲溶液；B液为 50mM 的 Tris-HCI 缓冲液中加入终浓度(W/V)为 0. 02 0. 1 % Proclin300,1. 0 3. OmM 的4-碘苯酚，0. 的BSA，0. 1 的溴化十六烷基三甲基铵，10 50mM鲁米诺溶液。
2.检测人全血中他克莫司药物浓度的化学发光酶联免疫试剂盒，包括化学发光酶标板，酶标记物；所述化学发光酶标板上的包被原为抗他克莫司单克隆抗体、二抗或与载体蛋白偶联的他克莫司半抗原；其特征在于还包括权利要求1所述的化学发光底物显色液，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的抗体、抗原或抗抗体。
3.根据权利要求2所述的化学发光酶联免疫试剂盒，所述包被原为他克莫司单克隆抗体，羊抗鼠抗抗体或兔抗鼠抗抗体，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的他克莫司半抗原。
4.根据权利要求2所述的化学发光酶联免疫试剂盒，所述包被原为羊抗鼠抗抗体或兔抗鼠抗抗体，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的他克莫司半抗原或他克莫司单克隆抗体。
5.根据权利要求2所述的化学发光酶联免疫试剂盒，所述包被原为与载体蛋白偶联的他克莫司半抗原，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的抗他克莫司单克隆抗体。
6.根据权利要求2 5任一所述的化学发光酶联免疫试剂盒，所述载体蛋白为甲状腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、蓝血蛋白或卵清蛋白。
7.根据权利要求6所述的化学发光酶联免疫试剂盒，所述试剂盒还包括前处理液、样品稀释液、他克莫司标准品溶液、他克莫司质量控制溶液、浓缩洗涤液。
8.根据权利要求7所述的化学发光酶联免疫试剂盒，所述样品前处理液为含20-100mM 硫酸锌的甲醇溶液与乙二醇混合液，甲醇与乙二醇的体积比3 1。
9.根据权利要求7所述的化学发光酶联免疫试剂盒，所述样品稀释液为含0.3-0. 5M NaCL的50mM的磷酸盐缓冲液。
10.根据权利要求7所述的化学发光酶联免疫试剂盒，所述浓缩洗涤液pH值为7.2 8. 5，含有终浓度为 0. 02 0. 05% Proclin300,1. 0 2. 0%吐温-20 和 0. 01 0. 03mol/ L的磷酸盐缓冲液。
全文摘要
本发明“检测人全血中他克莫司药物浓度的化学发光酶联免疫试剂盒”，属于医学检测试剂，包括化学发光酶标板，酶标记物；所述化学发光酶标板上的包被原为抗他克莫司单克隆抗体、二抗或与载体蛋白偶联的他克莫司半抗原；其特征在于还包括自制的使试剂盒具有更高信噪比，检测灵敏度的化学发光底物显色液，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的抗体、抗原或抗抗体。既可以应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，适合国内现状，成本低，但检测效果与进口试剂无显著差异可实现大批量快速检测，更易推广应用。
文档编号G01N21/76GK102368054SQ20111018327
公开日2012年3月7日 申请日期2011年6月30日 优先权日2011年6月30日
发明者李全, 焦守恕, 贾凤芹 申请人:同昕生物技术(北京)有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
