专利名称：一种高通量生物芯片及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物芯片与应用，特别是涉及一种能实现多样品对多探针并行检测的高通量生物芯片及其应用。
背景技术：
生物学研究已经进入了一个“组学研究”的时代，其中的代表有基因组研究以及蛋白质组研究。组学研究的特征是需要对一个或多个样本中的大量的目标分子进行通量高、速度快的并行分析方法，常规的一次实验一个样本一个基因或者一次实验一个样本一种蛋白的分析方式已经不能适应组学研究的要求。
作为一种革命性的分析技术，生物芯片以其所具有的集成化，微型化和自动化的潜力在生物分析技术领域发挥了越来越重要的作用。在早期，生物芯片基本上所指的就是核酸芯片和DNA微阵列，常被用于核酸的高通量并行分析(Debouck andGoodfellow，Nature Genetics，21(Suppl.)48-50(1999)；Duggan et al.，NatureGenetics，21(Suppl.)10-14(1999)；Gerhold et al.，Trends Biochem.Sci.，24168-173(1999)；and Alizadeh et al.，Nature，403503-511(2000))，可以采用核酸芯片来快速地分析特定情况下的基因表达谱，也可以采用核酸芯片在一次实验中分析长达1kb的基因区域内的单核苷酸多态性(Single nucleotidepolymorphisms，SNPs)(Guo et al.，Genome Res.，12447-57(2002))。基于生物芯片的概念、基本的生物学原理以及常规的生物技术的整合已经发展出了多种不同类型的生物芯片，其中包括用于疾病和癌症研究的蛋白质芯片(Belov et al.，CancerResearch，614483-4489(2001)；Knezevic et al.，Proteomics，11271-1278(2001)；Paweletz et al.，Oncogene，201981-1989(2001))；用于在基因组层次上研究分子病理学的组织芯片(Kononen et al.，Nat.Med.，4844-847(2001))；以及用于多糖和蛋白之间的相互作用研究的多糖芯片(Fukui et al.，Nat.Biotech.，201011-1017(2002))。
以常规的核酸检测芯片为例，根据芯片表面所固定的是样品还是探针可以将其分为两大类型如果芯片上固定的为样品则为正相杂交芯片，例如Telechem公司NGS(next generationscreening)技术；如果芯片表面上固定的为探针则为反相杂交芯片，例如固定70mer探针的表达谱芯片。按照芯片表面的杂交反应作用力产生方式，可以将生物芯片分为被动式芯片和主动式芯片。在被动式生物芯片中，探针被固定于固相载体的表面，待检目标则在杂交腔体内处于游离状态，探针和待检目标之间的反应依靠待检目标在反应体系中的被动扩散而进行，探针区域内待检目标的浓度较低。在这种方式下，反应效率相对较低，反应所需的时间相对较长。
针对传统的二维被动式芯片的被动反应、探针固定量少的缺点已经发展出几种不同类型的解决方法。第一种方式是采用其它的基质材料和固定方法。在目前常用基因芯片技术中，探针通常被固定于一种二维的平面上，因此在芯片表面固定的探针的密度通常较低。为了获得更高的杂交效率，有研究者尝试将探针固定在三维结构和三维基质上(Zlatanova et al.，Methods Mol.Biol.17017-38(2001)；Tillib et al.，Anal.Biochem.292155-160(2001)；Michael et al.，Anal.Chem.701242-1248(1998))。与常规的二维芯片相比，三维芯片具有以下两个特性在一个固定的区域内可以固定更多的探针，同时在三维结构上的探针具有更高的自由度，因此，这种类型的芯片可以提高杂交的效率。但是这种芯片的缺点也是显而易见的，芯片的制作过程比较复杂，因此导致了这种芯片很难实现高密度。另一种方式是采用特殊设计的探针，这些探针在其5’端上有一些附属的成分，包括用于提高固定探针柔韧性的5′间隔臂(Shchepinov et al.，Nucleic Acids Res.25，1155-1161(1997))，以及茎环结构或发卡结构探针(Broude et al.，Nucleic Acids Res.29E92(2001))，目标DNA与探针的杂交可以通过碱基堆积效应来加强(Riccelli et al.，NucleicAcids Res.29996-1004(2001))。第三种提高杂交效率的方式是在芯片上施加物理作用力。包括采用扰动来促进杂交时的扩散，例如Lucidea自动芯片处理器(LucideaASP)；电场力也被用来驱动核酸的快速运动并在核酸芯片表面的探针区域进行浓缩和富集(Sosnowski et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 941119-1123(1997)；Cheng et al.，Nat.Biotechnol.16541-546(1998))，电场驱动的芯片中分子结合速度可以比常规的被动式芯片快1000倍。这种芯片的缺点在于芯片本身的加工过程比较复杂或者需要复杂的配套设备。
在核酸分析中，常规的检测方法是一种点反应，例如一次检测一个特定样品中的一段特定核酸；而现有的生物芯片技术则是一种多点对单线的反应，其通量远远高于常规的分析方法，但是仍然不能在一次检测中实现多个样品对多个探针的并行分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种能实现多样品对多探针并行检测的高通量生物芯片及其应用。
本发明所提供的高通量生物芯片，它包括固相基质及附着在基质上的样品，所述样品呈若干平行的样品带排列。
其中，所述固相基质上还有若干与所述样品带相交的检测分子带，样品带与检测分子带只要相交即可达到本发明的目的，优选的是样品带与检测分子带是垂直的。常用的附着于固相基质上的样品有各种探针或生物分子等。
通�？梢允褂玫墓滔嗷视卸嘀郑绻瑁芰希ＡВ沾桑鸾海鹗簦咏荒さ龋一箍梢远云浔砻娼谢奘魏笥糜诒痉⒚鳎缃�-CHO，-NH2，-SH，-S-S-，环氧基和甲苯磺酰基等修饰；各种生物分子都可以用于制作本发明芯片，如DNA，RNA，肽核酸(PNA)，锁定核酸(LNA)，蛋白质，肽，抗体，多糖，细胞，动物组织或植物组织等；所用的探针能与所检测的生物分子特异结合，可为DNA，RNA，肽核酸(PNA)，锁定核酸(LNA)，蛋白质，肽，抗体或多糖等。
应用本发明生物芯片进行检测的方法，包括如下步骤1)沿与生物芯片上样品带相交的方向在固相基质表面制作上若干条与样品对应的检测分子线，使检测分子与固定在固相基质上的样品反应；2)清洗固相基质后检测信号点。
步骤2)所述清洗前还经过干燥，使探针或生物分子样品浓缩，可加快探针与生物分子的反应。
为了提高干燥后样品的均匀性，干燥方式可选用透气膜干燥。干燥温度可选择在0-80℃；干燥湿度为0％-80％之间。
在芯片上制作第二层检测分子线的方法可用生物芯片点样仪点制；这些分子线可以是实线也可以是虚线，虚线的每一段可以是圆形也可以是棒状或其它形状。
第二层检测分子线也可以在芯片表面采用微流体通道方法制作，该方法包括如下步骤a)沿与生物芯片上样品带相交的方向在固相基质表面粘合上微流体通道；b)使含有检测分子的反应液进入所述微流体通道中，与固定在固相基质上的样品反应。
其中，微流体通道可以采用高分子等材料制成；检测分子在微流体通道进行反应时，可以采用如US Patent5,741,647和US Patent6,020,187等所介绍的方式用微泵控制流体进行流动杂交或者导流杂交，能使杂交反应更充分、快速。在清洗时可以直接将清洗液加入到微流体通道中，也可将微流体通道去除后将芯片放置在清洗液中进行清洗。
为了便于信号检测，可以对第二层的检测分子进行标记，如放射标记、荧光标记、化学标记、酶学标记、发光标记、胶体金标记加银染放大、磁珠标记、荧光共振能量转移标记或者是分子信标标记等，常用的荧光标记有FAM，TET，HEX，FITC，Cy3，Cy5，Texas Red，ROX，Fluroscein，TAMRA以及带有稀土金属的纳米粒子等。常用的信号检测方法有光学显微镜，光学扫描仪以及荧光扫描仪等。
将样品先固定于芯片固相基质上(第一层样品线)，然后制作第二层探针线进行样品检测的流程如图1A和图1B所示，图1A是先将样品线固定于固相基质，每条线对应于一种样品；图1B在图1A基础上再制作探针线，使探针与样品进行反应构成检测矩阵，图中1、2、3分别为固相基质、样品以及探针分子。第二层探针线制作完成后进行干燥杂交的原理如图2A-图2D所示，图2A是在固定有样品2的固相基质1上加上包含有探针分子3(探针分子3上带有标记4)的反应液5；图2B是反应液5在固相基质表面干燥，探针分子3浓缩，促进了探针分子3与样品2发生有效结合；图2C为干燥过程结束，探针3与样品2结合反应完毕；图2D为清洗后固相基质上只保留与样品2结合的探针分子3，用于信号检测。图3为采用微流体通道方法制作第二层探针线的示意图，微流体通道构建完成后，将探针分子3加入到微通道6中，使探针分子3与样品2在微通道6内发生结合反应，反应结束经清洗后即可进行信号检测。
本发明巧妙地在一个生物芯片上制作出两层样品线和探针线，构成纵横交错的生物芯片矩阵，能一次实现多个样品对多个探针的并行检测分析，具有高的检测通量和检测效率；采用简单的干燥过程使第二层的探针或样品分子浓缩，加快了探针或样品分子与固定在芯片上的第一层样品或探针的杂交反应，能缩短检测时间，可以广泛应用于生物分子的检测。
图1A为固定有样品线的固相基质的示意图；图1B显示图1A的固相基质上再制作上探针线；图2A显示固定有样品的固相基质表面上加有含探针的反应液；图2B显示干燥促使探针与样品反应；图2C显示干燥结束探针与样品有效结合；图2D显示反应结束后清洗完毕结合有探针的样品用于检测；图3为采用微流体通道方法制作探针线的结构示意图；图4A为透气装置的整体示意图；图4B为透气装置的剖面图；图4C为芯片采用透气膜干燥的示意图；图5为实施例1探针1-4与样品结合后的Cy3通道扫描图；图6为实施例1通用探针与样品结合后的Cy5通道扫描图。
具体实施例方式
实施例1、采用本发明方法和干燥杂交来进行人类白细胞抗原(HLA)基因检测1、实验材料氨基玻片(AminoSlideTM，北京博奥生物芯片有限公司，北京)
探针和引物上海博亚生物技术公司合成。
HLA-A PCR引物(5′-3′)上游引物PMH-AF TCCCCAGACGCCGAGGATGGCC下游引物PMH-AR CCCGTGGCCCCTGGTACCCG探针(5′-3′)探针1 A07401a_Ta TCACAGACTCACCGAGTCG探针2 A11407_Ta TACCACCAGTACGCCTACG探针3 A06202_Ta GGGACCGGAACACACGGAA探针4 A05603a_Ta CAGGAGAGGCCTGAGTATT通用探针PBH_A991001_d9_Cy5 CCTGCGCTCTTGGACCGC所用样品及其与探针序列1-4的杂交对应关系如表1所示，表中2402，2501和2601为纯合子，分别对应于HLA国际分型组织(International HistocompatibilityWorking Group，IHWG)的标准DNA WS No.9369，9092以及9014，分别为HLA-A2402，HLA-A2501以及HLA-A2601基因；其他9份样品为已经采用Array Beads Multi-AnalyteSystemTM(One Lambda Inc.CA USA)以及A Locus High Res SSP UniTray(Pel-FreezClinical Systems，LLC WI USA)进行了中分辨率分型的实际样品，这9份样品均为杂合子，其中，表中所列的11/24代表由HLA-A11**和HLA-A24**所组成的杂合子，其余表示与此类似。涂黑区域表示探针与样品能产生预期的阳性杂交。通用探针能以较高的效率与所有的HLA样品进行杂交。
表1.样品与探针的杂交对应关系
试剂和溶液DMSO，20×SSC，10％SDS，50×Denhardt’s，ddw，2.5mM dNTP(上海博亚生物技术公司)，5U/μL LA-Taq以及10×LA buffer(宝生物技术公司，中国大连)；Manu 03010 PCR产物纯化试剂盒(Millipore Corporation.290 Concord Road Billerica，Massachusetts)。
仪器ScanArray Express荧光扫描仪(GSI Lumonics)；DU 640分光光度计(PerkinElmer)；GeneMachine(Genomic Instrumentation Services Inc.，San Carlos，CA.)；PTC-200热循环仪(MJ)；TDL-5离心机(上海安亭科学仪器厂)；数显水浴恒温振荡器SHA-C(国华仪器厂，中国江苏常州)；紫外交联仪(Bio-Rad Laboratories，Inc)。
2、实验方法1)样品制备(PCR扩增，PCR产物纯化浓缩及定量)PCR扩增1×LA buffer，200μM dNTPs，1μM上游引物PMH-AF，0.04μM下游引物PMH-AR，100μL PCR反应体系中加入5U的LA-Taq以及2μL样品DNA。热循环程序如下96℃预变性3分钟；96℃变性25秒，71℃退火45秒，72℃延伸30秒，25个循环；96℃变性25秒，65℃退火60秒，72℃延伸2分钟，15个循环；72℃延伸5分钟；4℃保持。PCR在PTC-200热循环仪上进行。
PCR产物的纯化浓缩及定量按照Millipore Manu PCR产物纯化试剂盒的操作说明纯化PCR产物，采用DU 640分光光度计对纯化的PCR产物进行定量，采用Eppendorf的真空浓缩系统浓缩PCR产物，将浓缩的PCR产物溶于50％DMSO中，使其终浓度为400ng/μL。
2)样品点样液的制备及画线操作将浓度为400ng/μL的样品1到12采用GeneMachine点样仪横向点制于氨基玻片表面。点的直径为150μm，同一样品线中相邻两点的间距设定为80μm，相邻两条样品线之间的间距设定为300μm。点样的温度为24℃，湿度为50％。
3)样品在氨基玻片上的固定将点制有样品的玻片置于烘箱中，80℃放置1小时后取出，降至室温。然后在室温下进行如下操作将玻片有样品点的面朝下置于60℃水浴表面，使水蒸气在载玻片有点阵一面呈雾状水合10s，水合完毕的玻片面朝上室温放置5min；然后进行紫外交联，交联能量250mJ；将玻片置于1％SDS中在60转/分速度下摇洗5分钟，取出玻片放入无水乙醇中清洗3遍，取出玻片在1000转/分速度下离心3分钟甩干。
4)探针点样液的制备及画线操作采用常规方法将探针1-4进行Cy3标记，将标记后的探针1到4分别溶于中6×SSC，0.1％SDS和5×Denhart’s中，探针的终浓度为1μM。将配好的探针溶液1至4采用GeneMachine点样仪点制于芯片表面，点的直径为150μm，同一样品线中相邻两点的间距设定为80μm，相邻两条样品线之间的间距设定为300μm。点样的温度为24℃，湿度为50％。
采用常规方法将通用探针进行Cy5标记，将Cy5标记的通用探针溶于中6×SSC，0.1％SDS和5×Denhart’s中，终浓度为30nM，按照上面的方法点制于芯片表面。
5)清洗及结果检测将芯片从点样仪中取出，在芯片上覆盖透气装置，在温度为25℃，湿度为50％的环境中干燥。透气装置的结构如图4所示，图4A为透气装置的整体示意图，图4B为透气装置的剖面图，7为透气膜，8为支架；透气装置位于芯片上的示意图如图4C。将已经干燥了的芯片放置于杂交清洗液I(3×SSC&0.1％SDS)中，42℃轻微振荡清洗两分钟；再在杂交清洗液II(0.06×SSC)中，42℃轻微振荡清洗两分钟。将清洗结束的芯片置于TDG-5离心机中1000rpm离心1分钟甩干。
采用Scan Array Express来检测荧光信号，Cy3和Cy5通道设置相同的扫描参数Laser power＝80％，PMT＝90％，扫描精度为10μm。扫描结果如图5，和图6所示，图5为探针1-4与样品的杂交图谱，其中1-12分别为样品1-12；A、B、C、D分别为探针1-4；图6为通用探针与样品的杂交图谱，其中1-12分别为样品1-12。结果表明，本发明提供的方法具有很好的信号强度和较高的杂交特异性，实际杂交结果与预期结果完全一致。
实施例2、采用微流体通道制作第二层探针线进行样品检测1、将实施例1中的12个样品按照实施例1中的步骤制备含有第一层样品的芯片。
2、构建微流体通道沿与芯片上样品带相交的方向在固相基质表面粘合上4条聚乙烯材料通道，其顶面封闭。
3、微流体通道中杂交反应将实施例1中的4种经Cy3标记的探针1-4分别溶于中6×SSC，0.1％SDS和5×Denhart’s中，探针的终浓度为1μM；然后将探针溶液分别加入到4条通道中，振荡进行杂交反应，反应后倒去探针溶液，在室温条件下干燥。
同样，对经Cy5标记的通用探针加入到通道中，进行杂交反应。
4、清洗、检测将杂交清洗液I(3×SSC&0.1％SDS)加入到已经干燥了的芯片中，42℃轻微振荡清洗两分钟；再加入杂交清洗液II(0.06×SSC)，42℃轻微振荡清洗两分钟；最后将清洗后的芯片在空气中晾干，除去微流体通道。
采用Scan Array Express来检测荧光信号，Cy3和Cy5通道设置相同的扫描参数Laser power＝80％，PMT＝90％，扫描精度为10μm。其扫描结果与实施例1相同。
权利要求
1.一种高通量生物芯片，它包括固相基质及附着在基质上的样品，其特征在于所述样品呈若干平行的样品带排列。
2.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于所述固相基质上还有若干与所述样品带相交的检测分子带。
3.根据权利要求2所述的生物芯片，其特征在于所述样品带与检测分子带是垂直的。
4.根据权利要求1或2或3所述的生物芯片，其特征在于所述样品为探针或生物分子；所述固相基质选材为硅，塑料，玻璃，陶瓷，橡胶，金属或杂交膜中的一种。
5.根据权利要求4所述的生物芯片，其特征在于所述生物分子为DNA，RNA，肽核酸，锁定核酸，蛋白质，肽，抗体，多糖，细胞，动物组织或植物组织中的一种或几种；所述探针为DNA，RNA，肽核酸，锁定核酸，蛋白质，肽，抗体或多糖中的一种或几种。
6.应用权利要求1所述生物芯片进行检测的方法，包括如下步骤1)沿与生物芯片上样品带相交的方向在固相基质表面制作上若干条与样品对应的检测分子线，使检测分子与固定在固相基质上的样品反应；2)清洗后检测信号点。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于步骤2)所述清洗前还经过干燥。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于所述干燥采用透气膜干燥。
9.根据权利要求7或8所述的检测方法，其特征在于所述干燥温度为0-80℃；所述干燥湿度为0％-80％。
10.根据权利要求6或7或8所述的检测方法，其特征在于步骤1)所述检测分子线是采用生物芯片点样仪点制的。
11.根据权利要求6或7或8所述的检测方法，其特征在于，步骤1)所述检测分子线可以是采用微流体通道方法制作的，包括如下步骤a)沿与生物芯片上样品带相交的方向在固相基质表面粘合上微流体通道；b)使含有检测分子的反应液进入所述微流体通道中，与固定在固相基质上的样品反应。
全文摘要
本发明公开了一种高通量生物芯片及其应用。本发明的高通量生物芯片包括固相基质及附着在基质上的样品，其特征在于所述样品呈若干平行的样品带排列。应用本发明生物芯片进行检测的方法，包括如下步骤1)沿与生物芯片上样品带相交的方向在固相基质表面制作上若干条与样品对应的检测分子线，使检测分子与固定在固相基质上的样品反应；2)清洗固相基质后检测信号点。本发明巧妙地在一个生物芯片上制作出两层样品线和探针线，可以实现多个样品对多个探针的并行检测分析，具有检测通量、检测效率高的优点；采用简单的干燥过程加快了探针与样品分子的杂交反应，检测时间短，可以广泛应用于生物分子的检测。
文档编号G01N33/543GK1635164SQ200410088889
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月8日 优先权日2004年11月8日
发明者陶生策, 高华方, 赵传赞, 王东, 安爽, 程京 申请人:北京博奥生物芯片有限责任公司, 清华大学
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