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专利名称：从混有易感种子的混合物中分选抗性种子的方法
从混有易感种子的混合物中分选抗性种子的方法
背景技术：
昆虫、线虫和相关的节肢动物毎年在美国估计破坏15%的农作物，在发展中国家破坏的比例更高。另外，与杂草及寄生植物和腐生植物的竞争也造成更多的潜在产量损失。这种损害有些是在植物病原体、昆虫和其他此类土生(soil borne)害虫在种子种植后攻击种子时在土壤中发生的。例如，在玉米的生产中，其余损害的大部分是由根虫(啃食或以别的方式损害植物的根的害虫)以及由切根虫(cutworms)、欧洲玉米螟和其他啃食或损害植物地上部分的害虫造成的。害虫对农作物攻击的类型和机制的一般描述由例如如
Γ* 又献提供Metcalf (1962)，载于 Destructive and Useful Insects :Their Habits and Control，第四版· (C. L. Metcalf 和 W. P. Flint 的旧版本)McGraw-Hi 11 Book Company ；New York，San Francisco，Toronto, London.；以及 Agrios (1988)，载于 Plant Pathology,弟 3 片反，Academic Press0鳞翅目昆虫对整个北美洲和整个世界的玉蜀黍作物造成相当大的损害。首要的害虫之ー是通常称为欧洲玉米螟(ECB)的玉米螟(Ostrinia nubilalis)。已将来自Bt 的编码晶体蛋白CrylA(b) -CrylA(C)的基因引入玉蜀黍中作为控制ECB的手段。Cryl 组包括但不限于 CryIA(a)、CryIA(b)和 CryIA(c)。參见 Hofte 等人(1989)Microbiol Rev 53 :242-255。这些转基因玉蜀黍杂交种已可有效控制ECB (美国专利No. 6，180，744、 No. 5，689，052和美国公开2002/013227)。最近，已经开发了表达CrylF的玉蜀黍杂种用于控制 ECB (Chambers 等人(1991) · J. Bact. 173 :3966-3976 和 Herman 等人(2002) · J. Agric. Food Chem. 50 :7076-7078,美国专利 No. 5，691，308、No. 5，188，960 和 WO 99/24581)。然而，对Bt毒素抗性的进化是害虫控制方面的挑战。參见McGaughey等人(1998)Nature Biotechnology 16 144-146 ;Estruch 等人(1997)Nature Biotechnology 15:137-141; Roush 等人(1997) Nature Biotechnology 15 816-817 ；和 Hofte 等人(1989)(出处同上)。Cryl毒素的主要作用位点是在易感昆虫幼虫如鳞翅目昆虫的中肠上皮細胞的刷状缘膜中。已从多种鳞翅目物种表征了 CrylA毒素结合多肽。已报道了来自烟草天蛾 (Manduca sexta)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、谷头夜蛾(Helicoverpa zea)禾ロ烟芽夜蛾 (Heliothis virescens)的与氨基肽酶N具有同源性的CrylA(c)结合多肽。參见Knight 等人(1994)Mol Micro 11 :429-436 ；Lee等人(1996)Appl Environ Micro 63 :2845-2849 ； Gill 等人(1995) J Biol. Chem 270 :27277-27282 ；和Garczynski 等人(1991) Appl Environ MicrobiollO :2816_2820。克隆自烟草天蛾的另ー种Bt毒素结合多肽(BTRl)与钙粘蛋白多肽超级族具有同源性并结合 Cry IA (a)、Cry IA (b)和 Cry IA (C)。參见 Vadlamudi 等人(1995) J Biol Chem 270(10) :5490-4、Keeton 等人(1998)Appl Environ Microbiol 64(6) :2158-2165 ；Keeton 等人(1997) Appl Environ Microbiol63 (9) :3419-3425 和美国专利 No. 5，693，491。随后克隆的BTRl的同源物表明与来自家蚕(Bombyx mori)的CrylA(a)结合，如 Thara 等人(1998)Comparative Biochemistry and Physiology, Part B120 :197-204 禾ロ Nagamatsu 等人(1998)Biosci. Biotechnol. Biochem. 62 (4) :727-734 中所描述的。
美国中西部的其他严重的玉米昆虫害虫是叶甲属(Diabrotica)甲虫的三个种的幼虫形式。这些包括西部玉米根虫(玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConteノ)、；!匕民虫(Diabrotica ba 内 eri Smith禾ロ Diabrotica barberi Lawrence) 和南部玉米根虫(黄瓜i^ 一星叶甲食根亚种(Diabrotica undecimpunctata howardi Barber;)。玉米根虫(CRW)以卵的状态在前一季种植玉米的田地里过冬。卵从五月末至六月孵化。如果玉米作物在随后一年里不种植另一玉米作物，则幼虫将会死亡。因此，玉米根虫的影响最直接处于系统性地连续种植玉米的区域，如美国中西部许多地区所常见的。有证据表明出现了新的玉米根虫亚种(race)，这种新的玉米根虫亚种将其卵产在邻近的大豆植物上过冬。美国中西部对田地的最通常做法是每年轮作，先种植玉米，然后下一年种植大豆，以便管理发展玉米根虫流行对玉米田地的压力。虽然这种策略总体上已在许多区域成功减少了玉米根虫对玉米的啃食压力，但进化出现这种新的玉米根虫亚种产生了问题，该问题是未预料的并且该问题不能轻易预见。这种新的亚种(其优先将其卵产在大豆田地里)，对前一年种植过大豆的田地中接下去一年预期种植的玉米作物产生非预期的啃食压力，并且随后还需要杀虫控制手段，这给农场主增加了非预期的费用(额外的喷洒劳カ和额外的商品费用)，进ー步减少了农场主在作物和采收方面的投资的回报。西部玉米根虫(WCRW，D. virgifera virgifera)是在北美广泛分布的玉米害虫， 在许多情况下，化学杀虫剂被任意地用于将根虫的数目保持在低于经济损害水平。为了帮助减少在控制作物田地中的根虫群体的处理中所使用的化学杀虫剂，已开发出转基因的玉米品系，该品系产生苏芸金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)中天然产生的杀虫蛋白的多种氨基酸序列变体中的ー种。一种这类蛋白(通常称为Cry3Bb)最近已被English 等人在美国专利No. 6，023，013及相关专利和申请中进行了修饰，以含有一种或多种氨基酸序列变异，当在昆虫生物測定法中针对玉米根虫进行测试时，相较于野生型氨基酸序列， 所述变异展示出约七(7)倍至约十(10)倍的杀虫活性増加。已发现可在转基因植物中有效用于控制WCRff的另ー Bt毒素是Cry34/35 (美国专利No. 6，548，291、No. 6，083，499、 No. 6，128，180、No. 6，624，145 和 No. 6，677，148)。 如上文所述，一个忧虑是将会出现抗性ECB和WCRW。对抗抗性发展的ー个策略是， 选择表达高水平杀虫蛋白的重组玉米事件，使得害虫啃食转基因玉米植株一口或几ロ就会造成该害虫至少完全停止啃食并随后发生死亡。 另ー个策略是，在同一植株中或在相邻植株中，以重组事件的形式組合第二 ECB 或WCRW特异性杀虫蛋白，例如另ー Cry蛋白或另ー杀虫蛋白如重组酰基脂质水解酶或其杀虫变体(W0 01/49834)。优选地，第二毒素或毒素复合物将具有与第一毒素不同的作用模式，且优选地，如果受体參与到昆虫对重组蛋白的毒性的话，同一植株或相邻植株中的两种或更多种杀虫蛋白中的每ー者的受体将不同，从而如果某个受体发生功能变化或某个受体发生功能丧失而造成对特定杀虫蛋白的抗性，则该功能变化或功能丧失不应且可能不会影响其余的毒素的杀虫活性，该其余的毒素将显示能结合与该造成克隆至植物中的两种杀虫蛋白之一的功能丧失的受体不同的受体。因此，ー种或多种第一转基因和ー种或多种第二转基因每ー者各自对同一目标昆虫有杀灭作用并且无竞争地结合至该目标昆虫的肠膜中的不同结合位点。
另ー个策略是将化学杀虫剂与在转基因植物中表达的杀虫蛋白組合。可以想象这可采取对重组种子进行化学种子处理的形式，这将使得杀虫控制量的化学杀虫剂分散进根周围的区域，这将会保护根组织免受目标害虫感染的影响，只要该化学物质继续存在或根组织保持在分散进土壤中的杀虫剂的区域内。由于担忧化学杀虫剂对公众健康和环境健康的影响，人们已作出了极大的努力来寻找减少化学杀虫剂使用量的方法。最近，该努力在很大程度上集中在开发经工程改造而能表达源于微生物的昆虫毒物的转基因作物上。例如，授予Estruch等人的美国专利 No. 5，877，012公开了将来自诸如芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞杆菌属(I^seudomonas)、 棒形杆菌属(Clavibacter)和根瘤菌属(lihizobium)之类的微生物的蛋白质克隆进植物中并在植物中表达，以获得对诸如小地老虎(black cutworm)、行军虫、数种钻蛀虫之类的害虫和其他昆虫害虫有抗性的转基因植物。Privalle等人的专利公布W0/EP97/07089教导了用编码过氧化物酶的重组DNA序列转化单子叶植物如玉米，以保护该植物免遭玉米螟、穗虫和切根虫的啃食。Jansens等人(1997) Crop Sci. ,37(5) 1616-16 报道了含有编码来自苏芸金芽胞杆菌(Bt)的结晶蛋白的基因的转基因玉米的产生，该结晶蛋白控制两个世代的ECB0授予Koziel等人的美国专利No. 5，625，136和No. 5，859，336报道说，用来自苏芸金芽胞杆菌的编码内毒素的基因转化玉米产生了 ECB抗性得到改善的转基因玉米。 Armstrong等人，Crop Science, 35 (2) :550-557(1995)已提供了表达苏芸金芽胞杆菌的杀虫蛋白的转基因玉米的田间试验综合报告。杀虫剂施用的常规形式的另ー备选是用杀虫剂处理植物种子。使用杀真菌剂或杀线虫剂来在种植和萌发后保护种子以及幼根和苗免受攻击，以及将低水平杀虫剂用于保护例如玉米根免受线虫影响，已经用了一段时间了。用杀虫剂处理种子具有保护种子，同时使所需的杀虫剂的量最少以及限制与杀虫剂的接触量和达到对田地中的害虫的控制所必需的不同田间施用的数目的优点。通过将杀虫剂直接施用至植物种子来控制害虫的其他实例在(例如)美国专利 No. 5，696，144中提供，该专利公开说，从用1_芳基吡唑化合物以500g/公担种子的比例处理的种子生长的玉米植株所遭受的ECB啃食损害比从未经处理的种子生长的对照植株少。 另夕卜，授予Turnblad等人的美国专利No. 5，876，739 (及其母专利美国专利No. 5，849，320) 公开了控制土传昆虫的方法，该方法涉及用含有一种或多种聚合物粘合剂和杀虫剂的涂料处理种子。该參考文献提供了确认为可用于该涂料的候选物的杀虫剂列表以及多种潜在的目标昆虫的名称。尽管植物遗传工程的最新进展已改善了不用化学杀虫剂就能保护植物免受害虫侵扰的能力，而且虽然诸如用杀虫剂处理种子之类的技术已减少了杀虫剂对环境的有害影响，但仍有很多问题限制着这些方法在实际田间条件下的成功应用。于2006年9月沈日提交的申请号为10/599，307的专利申请描述了ー种改善的用于保护植物，特别是玉米植物免受害虫啃食损害的方法。该方法降低了常规化学杀虫剂的施用率，并且还限制了作物种植和栽培所需的单独田间操作的数目。如申请号为10/599,307的专利申请所描述的，种子样品的混合提出了新的问题， 寻求通过本发明来解决这些问题。为了确保混合种子的充分施用，各种子对农场主应该是在视觉上不可区分的。然而，为了保持质量控制，对种子生产商来说有必要能够对混合种子进行充分采样来确定是否保持了正确的比例。另外，如果种子返回给生产商而没有被卖掉或种植，则对种子生产商来说有必要将相异的种子类型分开。法规(例如由USDA的种子分部(Seed Branch)执行的联邦种子法(Federal Seed Act))使这种情况进一歩复杂，该法规要求种子袋单独标示袋子中存在的每种种子类型 (以总体的百分数表示)，以及其发芽率。除非种子以某种方式可相互区分，否则不可能精确报告发芽率和重新使用种子。另外，如果ー种种子类型具有比另ー种短的储藏期限，则可能优选的是替换存活期较短的种子而回收利用存活期较长的种子。为了实现这一点，混合的种子必需是可易于分离的。因而，本发明的首要目标是提供用于在保持任何两种种子类型之间的视觉不可区分性的同吋，将种子彼此分选开来的方法。本发明的另一目标是提供用添加剂处理种子群体的一个或多个级分(fraction)， 以使得视觉上不可区分的种子级分在特定条件下可区分的方法。本发明的另一目标是提供用于鉴别和定量相异种子类型在种子样品中的百分比的方法。


图1是示出了本发明的一个实施方案的流程图。图2是示出了本发明的一个备选实施方案的流程图。

发明内容
本发明整体涉及通过如下步骤来分选种子的方法提供第一和第二组种子，将添加剂如荧光染料施用至所述组中的一者以使所述两个组在环境光条件下保持为在视觉上不可区分。然后对所述组进行采样并在发射具有对应所述荧光染料的激活波长的波长的光的灯下通过。在所述荧光染料激活吋，通过颜色分选系统对所述种子进行分选。根据本发明的一个备选实施方案，提供若干个种子群体，每ー群体具有独特的特性。利用具有各种激活和/或发射波长的荧光染料对所有的而不是其中ー个所述种子群体进行染色。然后组合所述种子群体。从组合群体分选多个种子群体通过如下步骤来完成 提供ー个或多个颜色分选装置，所述颜色分选装置配有具有对应于所述荧光染料的激活波长中的一者或多者的波长的灯。根据ー个备选的实施方案，一组经遗传修饰的种子具有荧光遗传标记，该遗传标记具有特定的激活和发射波长。将第二群体中的非经遗传修饰的种子染色以在视觉上与第一群体相一致。組合这两个群体以产生组合种子群体。通过具有对应于所述荧光标记物的激活波长的灯的颜色分选系统分离来自这两个群体任一者的种子。根据ー个备选的实施方案，不是对所述种子进行分�。�而是提供所述组合种子群体的样品。对所述样品进行计数以确定种子的数目。将颜色分选系统和对应于荧光染料或标记物的灯用于确定具有或缺少所述荧光染料或标记物的种子的数目。将该系统耦联至分析仪以确定各种子类型在所述组合群体中的相对百分数。作为另ー种选择，计算机将该信息关联至正在混合种子群体的反馈系统。
具体实施例方式为了防止发展对经遗传修饰的种子或特定杀虫剂的昆虫抗性，已提出提供装有既含有抗性种子又含有非抗性种子的种子的种子袋，參见2009年2月19日提交的编号为 61/153,689的专利申请。如本申请中所用，术语“抗性种子”和“非易感种子”意指这样的种子，其或者经遗传修饰或者用特定杀虫剂处理来杀死或预防昆虫或其他害虫侵入种子或萌发的植株中。如本申请中所用，术语“非抗性种子”、“易感种子”和“庇护种子”意指这样的种子， 其未经遗传修饰或未用特定杀虫剂处理来杀死或预防昆虫或其他害虫侵入种子或萌发的植株中。如本申请中所用，术语“在视觉上不可区分的”结合两个或更多个种子组(各具有一定范围的颜色)一起使用，其中术语“颜色”由明度(浅对暗)、饱和度(鲜艳(intense) 对无色泽(dull))和色调(例如红、绿或蓝)。术语“在视觉上不可区分的”意指在诸如阳光或室内照明之类的环境光照条件下，所述两个组不能肯定地彼此相区分。在这些条件下每个组的颜色范围在很大程度上重叠，从而外观对人的眼睛而言不可区分。对系统进行了限定，从而在特定的条件下，例如在可见光谱(VLS)中的某些波长或VLS外的光下，所述种子组呈现不同的颜色特性，但色调是优选的指示物。呈现这些不同特性的两个种子组称为“在光学上相异的”。两个种子组之间的这种“差别性”不一定是在 VLS中，因而两个组可同时是“在视觉上不可区分的”和“在光学上相异的”。ー个这种实例是ー组种子上增加种子的红外反射率的种子施用物(application)。在VLS内，所述两个组将是在视觉上不可区分的，但对于对红外线敏感的机器读出器，所述组将是“在光学上相异的”。如本申请中所用，术语“种子施用物”也具有特定的含义。种子施用物定义施用至种子的任何外部物质。该术语包括但不限于杀虫剂、生物标记物、染料、杀真菌剂、化学生长剂或有助于种子发育的任何其他物质或在两个种子组之间产生差別的可检测物质。另外， 种子施用物不必完全覆盖种子，因而与种子涂层相区別。虽然某些施用物可最好是通过完全包覆种子来施用给种子，但应该理解可将某些材料选择性地施用至不到整个种子，例如施用至种子的种冠。种子施用物还不必与种子直接接触。众所周知的是可将第一种子施用物施用至种子，随后将第二种子施用物施用至第一施用物的上面。因而，术语种子施用物旨在意指施用至种子的任何物质，但不包括由所述种子天然生产的或由于遗传工程改造而生产的蛋白质。该术语不适用于种子在其从亲本植物产生之前的遗传修饰。总体上将本发明描述为涉及具有两个种子类型(一种是抗性的而另ー种是非抗性的)的种子混合物。然而，可以理解可使用多种组合，例如可能与第三非抗性种子类型组合的各具有不同抗性特性的两种种子。根据该新分选方法的第一个步骤，选择至少两个种子群体。第一群体是抗性种子， 第二群体是易感种子。根据应用需要，还可选择超过两个种子群体，各具有不同的所需特性。选择种子群体后，对两个群体均给予种子施用物。通常这覆盖种子并由杀虫处理物組成。通常将该种子施用物均勻地施用至种子来在全部种子间产生均勻的颜色。用诸如荧光染料之类的种子添加剂处理所述群体中的一者(易感的或抗性的)。联邦种子法要求对任何用杀虫剂处理过的种子进行染色，从而指示处理。因而，应该选择荧光染料使得当暴露于环境光时其呈现与染色过的抗性种子相同的颜色。这两个种子群体在视觉上是不可区分的，但当暴露于特定光波长(激活波长)吋，该荧光染料发射不同的光波长(发射波长)， 从而引起这两个群体变得在光学上相异。这种光学上的差別性在环境条件下是不明显的， 即使环境波长可能含有激活波长的光。这是由于相对于反射光的強度，由激活的荧光染料发射的光的強度低。仅在所述染料単独暴露于激活波长时，颜色差异才是可察觉到的。尽管这样，根据颜色分选系统的要求，可能有必要包括带通滤波器来阻断反射的激活波长的光井允许发射波长的光通过。虽然优选的是激活波长处于紫外光谱内而发射波长在可见光谱内，但这不是必需的。荧光染料，除了在激活波长的光下产生不同的颜色外，可能还会改变染色的种子在正常条件下的颜色。因而，未用荧光染料处理过的种子可能需要添加另外的染料(不具有荧光性质)来确保两个种子群体之间的视觉无差別性。作为另ー种选择，可选择低水平的荧光染料添加剤，使得颜色差别实际上不可检测。如果选择超过两个种子群体，则各种子群体具有施用物并且使用不止ー种荧光染料。例如，可将针对欧洲玉米螟(ECB)的第一种子群体、针对西部玉米根虫(WCRW)的第二种子群体和由庇护种子組成的第三群体組合。然后选择两种不同的荧光染料，各具有単独的激活和/或发射波长。例如，可选择激活波长为420-450nm且发射波长为470-500nm的蓝色染料和激活波长为560-590nm且发射波长为590-620nm的发射波长。然后用该蓝色染料处理第一种子群体，用该红色染料处理第二种子群体，不用荧光染料处理第三群体，或者任何可供选择的組合。优选对染料进行选择使得激活波长或发射波长具有允许进行分选的差別，因而应该对荧光染料进行选择而使得发射波长未被添加剂的组分显著吸收。涂覆后，組合各种子群体以产生组合种子群体。根据ー个实施方案，組合种子样品包括5%的易感种子和95%的抗性种子，但可预想其他組合。为了在組合后将组合种子群体分开成其組成部分，优选进行颜色分选。可设想两个选项。第一，对种子进行采样并计数以确保正确的组合；第二，将种子分离，可进行这种分离以便在分开的步骤中对各组分进行测试。这些分开的过程称为计数(图2)和分离(图 1)。在计数过程中，如图2所示，从所述群体中移出组合种子群体的样品(例如100粒种子)。将种子置于传送带上，传送带的背景颜色与种子(或施用物)的中性色或荧光染料的发光颜色密切相符。然后使样品暴露于发射对应于所述荧光染料的激活波长的波长的灯。未对应于该激活波长的其他波长被滤除。这导致当所述种子群体中的一者的荧光染料在其发射对应于所述发射波长的光时凸显出来。不具有该荧光染料的种子根据它们的物理性质，或者反射或者吸收投射的激活波长。当继续暴露于所述光时，样品被传递到照相机的前面。该照相机将图像传输至颜色分选系统，该系统识别具有不同颜色的那些种子并提供计数。由于已预先选择了样品中的种子数目(或作为另ー种选择，在单独的早前步骤中进行了计数)，可确定具有荧光染料的种子的百分数。这种计数过程可用于在混合过程期间保持质量控制。可将颜色分选系统用于反馈系统中以不断地监测样品中的抗性或易感种子的百分比来确保该混合物符合预定的公差， 例如95%的抗性种子和5%的易感种子。除了颜色分选系统的结果外，该分选过程(图1所示)实质上与所述计数过程相同。在该过程中，该颜色分选系统不是仅提供对标记的(或未标记的)种子的计数，而是与分选机器通讯，该分选机器将种子彼此分离。关于本发明设想的分选过程的ー个实例，请參见于2008年4月23日提交的申请号为12/108，198的专利申请，将该专利以引用的方式全文并入本文。所用软件的ー个实例是Mtake kanmaster系统，其能让使用者选择强度值和所要分选的目标的所需相邻像素数目。该系统击发螺线管，根据符合或超出这些标准阈值的像素的出现所述螺线管控制喷气流来分离种子。根据优选要求和效率，将种子或者从深色分选浅色，或者从浅色分选深色。根据优选的实施方案，使用灰度照相机。不是识别种子的颜色，该灰度照相机而是识别种子反射的光的明度或色调。对种子在其上停留的背景进行选择以密切匹配不含荧光染料的种子(或施用物)的色调。在投射荧光染料的激活波长的灯下，非染色的种子或者反射该光线(显露为投射的波长)或者吸收该光线(显示为黑色)。因而根据该色调来选择传送带。在该灯下荧光染色的种子发荧光，从而显示出比环境浅的色调，或者变浅以匹配该环境。该灰度照相机识别种子相对于环境的这种较浅或较深的色调，使得能进行计数或分选。一般来讲，优选从较多者分离较少者；如果优选的组合为5%的庇护种子和95%的抗性种子，则应该用荧光染料处理庇护种子并计数或从组合群体分选出来。已总体上就具有遗传修饰来抑制某些害虫的种子对筛选方法进行了描述。还预期可将该过程用于未经遗传修饰的种子，在这种情况中所有的种子在遗传上是相同的。根据该实施方案，将单个种子群体細分成第一和第二种子群体。一个种子群体接受具有杀虫剂、 杀真菌剂或对植物生长有利的其他产品的种子施用物。另ー种子群体接受具有特性不同于第一群体的施用物的中性、惰性或其他反应性物质的种子涂层。其中一个种子群体还接受荧光染料施用物，而另ー者保留不含染料，或作为另ー种选择，接受具有不同染料的施用物。将种子群体组合以形成组合种子群体。如上所述进行对所述种子群体的分离。也已总体上将该分选方法描述为将不同染料施用给种子群体中的一者。还可能通过在种子群体中的一者中利用荧光生物标记物进行该方法。该分选方法也已描述为可用于玉米种子。虽然这是优选的实施方案，但可将本发明应用于其他需要表现为实质上在视觉上相同而同时在一定时间后可分离的种子。该方法可用于多种其中种子涂层是将产品转移至生长植物的优选方法的应用。在其他种业中，常见做法是将各种相同的或不同的物种混合进ー个袋中。所述种子可具有可被熟练分析者发觉的細微差別，但这种区分強度大并且耗时。因而，可将该过程用于区分在视觉上不相同， 但由于种子结构的相似性而分离困难的种子。例如，草籽可由若干不同的草种组成。每ー 草物种可能具有独特的特性，但这些种子足够接近一致有碍容易的区分。可将上述方法用于给ー个或多个种子类型提供更明显的区分特性。本发明的另ー备选是利用带通滤波器，该滤波器限制某些光波长通过。将带通滤波器(对应于投射至种子上的光或者发射波长)置于照相机上。从具有或缺少染料的种子反射的光通过该带宽滤波器而影响照相机。这样，该照相机仅“看见”反射通过该带通滤波器的光的种子。在一些情况下，带通滤波器可允许不止一种波长的光通过。当期望通过或排斥具有不止ー种涂层的种子时，该类型的滤波器特別可用于分选三种或更多种种子。带通滤波器优选被构造用于通过由添加剂吸收的光或对应于荧光染料的发射波长的光。如果允许被添加剂吸收的光，则处理过的种子对照相机显现为暗色，而未处理的种子显示为浅色。如果让荧光染料发射的光通过，则处理过的种子对照相机显现为浅色，而处理过的种子显示为暗色。用于种子分选的更成熟的选项是，在ニ元情形中或多元情形中，使用能够检测特定波长的从种子发射的光的RGB(红、绿、蓝)照相机。对应于多种荧光染料或荧光团的发射波长的波长子集被RGB照相机和相关软件识别。对应于这些子集的种子被分选进它们的各种组中，从而提供所需的分选。过去已使用了该方法，但与基于灰度的分选技术相比需要较高的计算方面的费用(开支)并且较慢。可将其他种子施用物用于替代荧光染料或生物标记物。这包括但不限于这样的产品，其増加紫外或红外反射率或吸收率(这种情况下光学差別性在VLS外出现)；引起磷光(当移除光源时存在光学差別性)；引起化学发光(由于在化学反应期间或化学反应后发射的光而出现的光学差別性)；在暴露于预处理过程后改变颜色；呈现可诱导的或持久的磁性(这种情况下分选方法将不基于视觉特性)；或改变ー组相对于另一組的重量。已在上文用优选的实施方案示出和描述了本发明，并且应该理解可作出许多修饰、替换和添加，这些修饰、替换和添加落于本发明的预期的精神和范围内。根据上述内容， 可以领会到本发明实现了至少全部的本发明声称的目标。
权利要求
1. 一种分选种子的方法，所述方法包括如下步骤 提供第一组种子，其具有包含添加剂的第一种子施用物； 提供第二组种子，其具有第二种子施用物； 提供由所述第一和第二组种子組成的組合种子组；使所述组合种子组的一部分通过ー个过程以产生或识别所述第一与第二组之间的基于所述添加剂的差別性；以及根据获得的基于所述添加剂的差别性从所述组合种子组分选所述第一或第二组中的- 。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得的差別性选自Α.荧光B.磷光C.化学发光D.紫外吸收率Ε.紫外反射率F.红外反射率G.红外吸收率H.诱导磁性或永久磁性特性I.预处理后的颜色。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一和第二种子组是在视觉上不可区分的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述添加剂包含具有激活和发射波长的荧光染料。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述产生差別性的过程是使所述组合种子组的所述部分暴露于发射所述激活波长的光。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在使所述种子组通过一个过程来产生差別性之前，所述第一和第二种子组是在视觉上不可区分的。
7.根据权利要求6所述的方法，其中基于光学差別性对所述第一和第二种子组进行分选。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一和第二种子施用物包含杀真菌剂。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一和第二种子处理物包含杀虫剂。
10.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括如下步骤 在所述组合种子组中提供具有第二添加剂的第三种子組；使所述组合种子组的所述部分通过第二过程以产生或识别所述第三组与所述第一和第二组之间的差別性；以及从所述組合种子组分选所述第三組。
11.一种确定混合种子的成活力的方法，所述方法包括如下步骤 提供第一种子组；提供第二种子组；将荧光染料施用至所述第一种子组； 組合所述第一和第二种子组以产生組合种子组；对所述组合种子组进行采样；使所述组合样品通过具有对应于所述荧光染料的激活波长的波长的灯以产生荧光和非荧光种子；光学识别对应于所述第一组的所述荧光种子和对应于所述第二组的所述非荧光种子；从所述第二组分离所述第一组；以及独立地确定所述第一和第二种子组的成活力。
12.一种分选种子的方法，所述方法包括如下步骤 提供第一种子組，其具有优选的遗传特性；提供第二种子組，其缺少所述优选的遗传特性；用具有可激活的颜色特性的添加剂标记所述第一或第二种子组中的一者； 組合所述第一和第二种子组以产生組合种子组； 对所述组合种子组进行采样；激活所述组合种子组样品内的所述经标记的种子组中的所述添加剂；以及通过光学识别所述激活的颜色特性从所述样品中的所述第二组种子分离所述第一组种子；其中所述第一和第二种子组是在视觉上不可区分的。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述添加剂包含荧光标记物并且所述可激活的颜色特性对应于所述荧光标记物的发射波长。
14.根据权利要求13所述的方法，其中通过使所述组合种子组样品暴露于对应于所述荧光标记物的激活波长的光来激活所述添加剤。
15.根据权利要求14所述的方法，所述方法还包括在暴露于所述光时将所述组合种子组样品置于对应于所述非荧光种子的颜色的背景上的步骤。
16.根据权利要求15所述的方法，其中将所述第一和第二种子组各用种子涂料处理， 并且仅所述第一或第二种子组中的一者用所述荧光染料处理。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述种子涂料包含杀真菌剤。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述种子涂料包含杀虫剂。
19.根据权利要求13所述的方法，其中所述荧光标记物包含遗传标记。
20.根据权利要求19所述的方法，其中除所述优选的遗传特性外所述第一和第二组实质上在遗传上相同。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述遗传标记与所述优选的遗传特性关联。
22.根据权利要求13所述的方法，其中所述荧光标记物包含化学染料。
23.根据权利要求12所述的方法，其中以接近优选比例的方式組合所述第一和第二組。
24.根据权利要求23所述的方法，所述方法还包括測定来自所述样品的所述第一和第 ニ组的种子的数量的步骤。
25.根据权利要求M所述的方法，所述方法还包括提供反馈以保持第一和第二组在所述组合组中的适当比例的步骤。
26.根据权利要求12所述的方法，其中所述种子包含玉米。
27.一种分选种子的方法，所述方法包括如下步骤 提供第一组种子，其具有包含添加剂的第一种子处理物；提供第二组种子，其具有第二种子处理物，所述第二组与所述第一组在视觉上是不可区分的；組合所述第一和第二组种子以产生組合种子组；以及基于所述添加剂产生的光学特性从所述組合种子组分选所述第一組。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述添加剂包含具有激活和发射波长的荧光染料。
29.根据权利要求观所述的方法，其中通过使所述组合种子组的部分通过对应于所述荧光染料的激活波长的光来检测所述光学特性以用于所述分选步骤。
30.一个种子群体，所述种子群体包含具有添加剂的第一种子组，所述添加剂具有可激活的颜色； 第二种子组；其中所述第一和第二组是在视觉上不可区分的。
31.根据权利要求30所述的种子群体，其中当暴露于激活所述添加剂的所述可激活颜色的过程时所述第一和第二种子组是光学上相异的。
32.根据权利要求31所述的种子群体，其中以已知的比例組合所述第一和第二种子組。
33.根据权利要求32所述的种子群体，其中所述添加剂包含具有激活和发射波长的荧光添加剤。
34.根据权利要求33所述的种子群体，其中所述激活可激活颜色的过程包括使所述种子组暴露于对应于所述荧光添加剂的激活波长的光源。
35.根据权利要求34所述的种子群体，其中所述荧光添加剂为所述第一组中的遗传标记产生的蛋白质。
36.根据权利要求34所述的种子群体，其中所述荧光添加剂为荧光染料。
37.根据权利要求34所述的种子群体，其中所述第一和第二种子组在遗传上相同并且所述第一种子组包含第一杀虫种子处理物，所述第二种子组包含第二杀虫种子处理物。
38.根据权利要求34所述的种子組，其中所述第一和第二种子组中的一者包含遗传ェ 程改造的性状。
全文摘要
本发明整体涉及一种通过提供具有荧光指示剂的第一种子群体和与所述第一种子群体在视觉上相同的第二种子群体在标准操作条件下来分选种子的新方法。将所述种子群体组合以提供组合种子群体。根据需要，配备具有对应于所述荧光指示剂的激活波长的输出的灯来对所述种子群体进行计数或分离所述种子群体。
文档编号G01N21/64GK102549410SQ201080043223
公开日2012年7月4日 申请日期2010年10月1日 优先权日2009年10月1日
发明者G·K·曼戈德, J·L·亨特 申请人:先锋国际良种公司