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专利名称：ABO、RhD血型定型检测卡的制备方法
技术领域：
本发明提供一种ABO、RhD血型定型检测卡的制备方法，是对现有制备方法的改进，属于医学检测技术领域。
背景技术：
人类红细胞血型是同种异型抗原，是人类遗传多态性标志之一。输血前血型定型和交叉配血是人类安全输血的保证，血型相容性检测是确保安全输血的最重要条件之一。Rh血型系统是仅次于ABO血型系统的重要血型系统，也是红细胞血型系统中最为复杂的一个系统，目前国际输血协会(ISBT)已确认的Mi血型抗原有48个。其中D、C、c、 Ε、e五种抗原抗原性最强，而D抗原抗原性又最强。由于MiD血型不合所引起的输血反应最为常见。微柱凝胶免疫检测技术是20世纪90年代产生的一种免疫检测技术，其基本原理是利用分子筛技术，离心技术和特异性免疫反应技术原理，把血型血清学技术与凝胶分子筛技术有机结合起来，可灵敏地检测出可能存在的微弱血型抗原抗体反应，被认为是血型血清学检验的里程碑。目前已有类似方法提出申请(申请号为200910234608. X)，但是与本发明相比，其制备工艺不同，选用凝胶不同，并且在处理凝胶过程中本发明采用生理盐水进行处理，既能够达到是凝胶充分膨胀的作用，又能够节约生产成本。此外，在特异性抗体的选择配置过程中，本发明采用比较合理的溶液配比能够达到较好的检测结果。

发明内容
本发明提供一种ABO、MiD血型定型检测卡，具有灵敏度高、特异性好、质量稳定、 易于操作、易于标准化、能同时进行正反定型的ABO、RhD血型定型。本发明还提供了上述检测卡的制备方法，适用于工业化生产。本发明提供一种ABO、RhD血型定型检测卡，具有以下结构 一种ABO、RhD血型定型检测卡，其特征在于
第一个微管中灌注抗A单克隆抗体微柱凝胶； 第二个微管中灌注抗B单克隆抗体微柱凝胶； 第三个微管中灌注抗D单克隆抗体微柱凝胶； 第四至第六个微管中灌注中性胶； 第四个微管作为阴性对照； 第五、第六微管作为反定型。本发明所述ABO、IihD血型定型检测卡的制备方法，包括以下步骤 凝胶制备
将葡聚糖凝胶干粉用3 5倍体积的生理盐水凝胶悬浮溶液浸泡M 48小时，待凝胶充分膨胀后，用凝胶悬浮溶液洗涤5次，然后再用蒸馏水洗涤5次，除去凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒以及凝胶中过多的盐离子；收集得到颗粒大小均勻的、且完整呈球形凝胶颗粒；选用生理盐水进行凝胶的制备具有如下优点
1.既能够达到是凝胶充分膨胀的作用，又能够节约生产成本；
2.浸泡M 48小时，能够使得凝胶充分溶胀，使得凝胶的膨胀率达到最佳，并减少凝胶的损失。特异性抗体配制
取甘氨酸 1.5X10—3 g/ml、氯化钠 0. 85X10—3 g/ml、磷酸二氢钠 2. 4X 10_3 g/ml、磷酸二氢钠4. 8X10—3 g/ml、牛血清白蛋白0. 5 1% (每IOOml特异性抗体溶液中含有0. 5 Ig牛血清白蛋白)，以上试剂用蒸馏水溶解后，调PH为6. 6 6. 8，然后将其与抗A单克隆抗体混合，使得抗A单克隆抗体效价> 128 ；
同样配方配制抗B单克隆抗体、抗D溶液单克隆抗体，使得抗B单克隆抗体效价> 128， 抗D单克隆抗体效价> 128；
本发明配方进行抗体配置具有如下优点
在节约生产成本的基础之上，能够使得抗体溶液达到最佳的反应条件，并且能够最大限度的保护抗体，使得抗体效价在1 2年内，仍然抗A效价> 128，抗B效价> 128，抗D 效价> 1280特异性凝胶配制
分别取抗A单克隆抗体、抗B单克隆抗体和抗D单克隆抗体与已溶胀的葡聚糖凝胶按照1 1 6:1比例混合，间断搅拌均勻25 35分钟，即为半成品特异性胶；
中性胶配制用生理氯化钠溶液与溶胀葡聚糖凝胶按照1 1 6 1混合，间断搅拌均勻 1 2小时，即得半成品的中性胶；
本发明特异性凝胶配置，抗A、抗B和抗D特异性凝胶采用间断均勻25 35分钟，中性胶采用间断搅拌均勻1 2小时，能够使得抗体溶液与凝胶充分混勻，这样更加有利于检测时抗原抗体的充分反应，使得检测结果更加准确可信。半成品检定
半成品检定主要进行特异性检测和抗体效价测定。分装
按照每管M 沈μ 1凝胶液，进行分装。采取本发明使得特异性抗体具有如下特点
1.具有较强的缓冲能力，有利于保持整个反应体系处于要求的缓冲范围，同时保证反应体系的离子强度；
2.本发明具有独特的润滑系统，采用一定浓度的牛血清白蛋白，使得红细胞通过凝胶间隙时获得合适的润滑能力，并且比例适中，恰好使得无凝集的红细胞能够更加顺利的通过凝胶间隙，而凝集的红细胞团块则不能通过；
3.本发明的另一关键在于反应介质的选择，经过反复试验最终选择颗粒大小适中的葡聚糖凝胶，而不是大多数厂家使用的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，使得检测准确性灵敏度更高。同时，应用生理盐水溶液作为凝胶悬浮介质，用于凝胶处理，在节约生产成本的同时，又达到维持凝胶稳定的效果。适当的葡聚糖凝胶浸泡时间，对于凝胶的充分膨胀非常重要。经过合理配比方式，使得凝胶能够满足制备ABO、RhD血型定型检测卡的需要，并且能够保证其产品质量。本发明的积极效果是选用葡聚糖凝胶较之使用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶灵敏度准确性更高。应用生理盐水溶液作为凝胶悬浮介质，用于凝胶处理，在节约生产成本的同时， 又达到维持凝胶稳定的效果。适当的葡聚糖凝胶浸泡时间，对于葡聚糖凝胶的充分膨胀非
常重要。


图1:阳性反应图片；
图2 可疑阳性反应图片； 图3:阴性反应图片； 图4 溶血反应图片； 图5 混合反应图片； 图6 实施例1卡式法检测结果； 图7 实施例1试管法检测结果； 图8 实施例2卡式法检测结果； 图9 实施例2试管法检测结果； 图10 实施例3卡式法检测结果； 图11 实施例3试管法检测结果。
具体实施例方式以下通过具体实施例详细说明本发明的实施和所具有的有益效果。但不限定本发明权利要求保护的内容。实施例1 凝胶悬浮溶液的配制
本发明所述凝胶悬浮溶液为生理盐水，配方如下
氯化钠8. 5g ；加入蒸馏水溶解后，用蒸馏水定容1，000ml，使其终浓度为0. 85%。凝胶的制备
选择颗粒大小适中的葡聚糖凝胶。将葡聚糖凝胶干粉，用3倍体积的步骤一中的凝胶悬浮溶液浸泡M小时，待凝胶充分膨胀后，用凝胶悬浮溶液洗涤5次，然后再用蒸馏水洗涤 5次。除去凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒以及凝胶中过多的盐离子。收集得到颗粒大小均勻的、且完整呈球形凝胶颗粒。抗体的选择
抗A单克隆抗体、抗B单克隆抗体，由长春博德生物技术有限责任公司生产，效价
^ 128 ο抗D单克隆抗体，由BiotestAG生产，由长春生物制品研究所经销，效价彡128。特异性抗体溶液配方如下
甘氨酸 1.5X10-3 g/ml、氯化钠 0.85X10-3 g/ml、磷酸二氢钠 2. 4X 10-3 g/ml、磷酸二氢钠4. 8X 10-3 g/ml、牛血清白蛋白0. 8% (每IOOml特异性抗体溶液中含有
0. 8g牛血清白蛋白);
5以上试剂用蒸馏水溶解后，调PH为6. 6。然后将其与抗A单克隆抗体混合，使得抗A效价彡128ο同样配方配制抗B单克隆抗体、抗D单克隆抗体溶液，使得抗B效价》128，抗D 效价> 1280特异性胶及中性胶的配制
特异性胶配制分别取抗A单克隆抗体、抗B单克隆抗体和抗D单克隆抗体与已溶胀的葡聚糖凝胶按照1 1比例混合，间断搅拌均勻25分钟，即为半成品特异性胶。中性胶配制用生理氯化钠溶液与溶胀葡聚糖凝胶按照2: 1比例混合，间断搅拌均勻1小时，即为半成品的中性胶。半成品检定 1.特异性检定 1. 1材料
(1)试剂AB0、I hD血型定型检测卡。(2)红细胞标本健康人 A” A1BJ2J2BaCK B、ODCe/Dce^R^hOdcE/DcE (OR2R2)； Odce/dce (R0r) ODCe/dce (^r) Odce/dce (Or，r) Odce/dce (Orr)分别用生理盐水溶液配制成0. 5%红细胞悬液。(3)已知A型和B型血清用于反定型。1. 2 试验
每型0. 5%红细胞悬液加入一个卡的第一至第四支微管中各50 μ 1 ；向第五、六支微管中加入已知A型和B型血清各50 μ 1，再向第五支微管中加入A型0.5%红细胞悬液50 μ 1， 第六支微管中加入B型0. 5%红细胞悬液50 μ 1。用专用离心机离心5分钟，900 rpm 2分钟，1，500 rpm 3分钟，肉眼观察结果。1. 3结果判定
(1)阳性结果和阴性结果判定
阳性结果红细胞抗原与相应抗体在微柱凝胶中形成的特异性抗原抗体复合物浮在凝胶表面或胶中，为阳性反应。阴性结果被检红细胞抗原无相应的抗体结合，不出现特异性抗原抗体复合物，红细胞沉于微柱凝胶的尖底部。溶血结果凝胶上清呈透明红色。(2)特异性结果判定，见表1。阳性结果的卡间差异不超1A+ ；阴性结果不应出现凝集或溶血。表1 ABO、RhD血型检定微柱凝胶试剂特异性检测
权利要求
1.一种ABO、RhD血型定型检测卡，其特征在于 第一个微管中灌注抗A单克隆抗体微柱凝胶； 第二个微管中灌注抗B单克隆抗体微柱凝胶； 第三个微管中灌注抗D单克隆抗体微柱凝胶； 第四至第六个微管中灌注中性胶；第四个微管作为阴性对照； 第五、第六微管作为反定型。
2.根据权利要求1所述ABO、RhD血型定型检测卡的制备方法，包括以下步骤 凝胶制备将葡聚糖凝胶干粉用3 5倍体积的生理盐水凝胶悬浮溶液浸泡M 48小时，待凝胶充分膨胀后，用凝胶悬浮溶液洗涤5次，然后再用蒸馏水洗涤5次，除去凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒以及凝胶中过多的盐离子；收集得到颗粒大小均勻的、且完整呈球形凝胶颗粒；特异性抗体配制取甘氨酸 1.5X10—3 g/ml、氯化钠 0. 85X10—3 g/ml、磷酸二氢钠 2. 4X 10_3 g/ml、磷酸二氢钠4. 8X 10_3 g/ml、牛血清白蛋白0. 5 1% (每IOOml特异性抗体溶液中含有0. 5 Ig牛血清白蛋白)，以上试剂用蒸馏水溶解后，调PH为6. 6 6. 8，然后将其与抗A单克隆抗体混合，使得抗A单克隆抗体效价> 128 ；同样配方配制抗B单克隆抗体、抗D溶液单克隆抗体，使得抗B单克隆抗体效价>128， 抗D单克隆抗体效价> 128； 特异性凝胶配制分别取抗A单克隆抗体、抗B单克隆抗体和抗D单克隆抗体与已溶胀的葡聚糖凝胶按照1 1 6:1比例混合，间断搅拌均勻25 35分钟，即为半成品特异性胶；中性胶配制用生理氯化钠溶液与溶胀葡聚糖凝胶按照1 1 6 1混合，间断搅拌均勻 1 2小时，即得半成品的中性胶； 半成品检定半成品检定主要进行特异性检测和抗体效价测定； 按照每管M 沈μ 1凝胶液，进行分装。
全文摘要
本发明提供ABO、RhD血型定型检测卡的制备方法，选用葡聚糖凝胶较之使用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶灵敏度准确性更高。应用生理盐水溶液作为凝胶悬浮介质，用于凝胶处理，在节约生产成本的同时，又达到维持凝胶稳定的效果。
文档编号G01N33/80GK102435756SQ201110281800
公开日2012年5月2日 申请日期2011年9月21日 优先权日2011年9月21日
发明者万俊波, 冯立岗, 刘春光, 孙启和, 庄贾明, 李凌波, 李秋生, 杨明, 杨洪存, 王冬倩, 贾天冰, 赵继岩, 郭广英, 陈云声, 陈维佳 申请人:长春博迅生物技术有限责任公司