专利名称：Angptl4作为血清学检测肝癌转移的标志物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤学和诊断领域。更具体地，本发明涉及一种可用于检测肝癌转移的血清标记物及其用途。
背景技术：
ANGPTL4基因(最初该基因被发明人的实验室命名为ppll58)[朱洪新等，中华肿瘤杂志(2002)24(2) =123-125]就是利用此功能筛选技术平台从人胎盘cDNA文库中克隆到的新基因，该基因cDNA全长为1943bp，开放阅读框含1218bp，编码406个氨基酸，预计分子量为45.2kDa。N端有一疏水信号肽和卷曲(Coiled-Coil)结构域，C端有一纤维蛋白原样 (Fibrinogen-like)结构域。并于2000年首先将该基因(原基因名为ppll58)的cDNA序列在GenBank上登录(登录号为AF202636)。现已同Yoon等克隆的PGAR[Mol. Cell. Biol.， Jul 2000 ；20 :5343-5349]和 Kim 等克隆的 HFARP [Biochem. J，2000，346 :603-610]由 HUGO 统一正式命名为 ANGPTL4 (angiopoietin-like 4)。
ANGPTL4在肿瘤转移中的作用越来越引起人们的关注。目前的研究表明ANGPTL4 对肿瘤转移的影响是非常复杂的，在不同的肿瘤中有不同的作用对Lewis肺癌细胞和黑色素瘤细胞B16R)的研究表明ANGPTL4能够通过对血管和肿瘤细胞的双重影响，即改变血管的渗透及肿瘤细胞的运动和侵润能力，来抑制肿瘤细胞的转移。与此相反，在乳腺癌的最新研究表明，TGFii I在乳腺癌中诱导ANGPTL4的上调，乳腺癌细胞分泌的ANGPTL4能够破坏内皮细胞之间的连接，增加肺毛细管的渗透性，促进肿瘤细胞的跨血管内皮细胞的迁移， 与TGFii I共同启动了乳腺癌的肺转移。原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国最常见恶性肿瘤之一，占居民肿瘤死亡第二位。肝癌出现症状时多属中晚期，切除后复发、转移率高。因此，肝癌(包括癌症转移)的早期诊断对延长患者的生存时间和降低肝癌死亡率具有重要意义。目前肝癌的诊断主要依靠影像学检查、肝穿刺组织学检查等方法，然而这些检测方法均具有一定的局限性。例如即使是很好的细针穿刺仍因取材有限而有较高的假阴性率，并且有使肿瘤扩散和针道种植的危险。癌症的血清学检测技术一直是研究的重点。然而，目前现有的针对癌症(如HCC)检测尚缺乏令人满意的血清标志物，更缺乏可用于检测或判断肝癌转移的血清标志物。因此，本领域迫切需要开发可用于检测或判断肝癌转移的血清特异标志物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种可用于检测或判断肝癌转移的血清特异标志物。在本发明的第一方面，提供了血管生成素样蛋白4(ANGPTL4蛋白)或其特异性抗体的用途，它们被(a)用于制备检测肝癌转移的诊断试剂或试剂盒；和/或(b)用于制备血清检测肝癌的诊断试剂或试剂盒。在另一优选例中，所述的ANGPTL4蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。在另一优选例中，所述可检测标记选自下组生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。在另一优选例中，所述诊断试剂是单克隆抗体。在另一优选例中，所述的特异性抗体是单克隆抗体。在另一优选例中，所述的检测肝癌转移是血清检测。在另一优选例中，所述的血清检测是ELISA法、或双抗夹心时间分辨免疫荧光法 (TRFIA 法)。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测肝癌转移的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有ANGPTL4蛋白或其特异性抗体；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断肝癌转移。在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容⑴如果检测对象的血清ANGPTL4浓度高于93. 5ng/ml，则该对象发生肝癌的几率大于正常人群；和/或(ii)如果检测对象的血清ANGPTL4浓度高于130ng/ml，则该对象发生肝癌转移的几率大于正常人群(或一般肝癌患者)。在另一优选例中，所述肝癌包括肝细胞肝癌，尤其是原发性肝细胞肝癌。在另一优选例中，所述的ANGPTL4蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。在另一优选例中，所述可检测标记选自下组生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。在另一优选例中，所述的抗体是单克隆抗体。在本发明的第三方面，提供了一种血管生成素样蛋白4(ANGPTL4蛋白)的用途，它被用作血清检测肝癌转移的标志物。在本发明的第四方面，提供了一种血管生成素样蛋白4(ANGPTL4蛋白)的拮抗剂的用途，它被用于制备抑制肝癌细胞转移的药物或用于制备抑制肝癌细胞转移的抑制剂。在另一优选例中，所述的拮抗剂包括针对ANGPTL4的siRNA、反义RNA、抗体、或其组合。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
图I显示了 ANGPTL4在高转移潜能的肝癌细胞系中高表达。其中，采用定量 PCR(a)和Western blot (c)分别检测ANGPTL4在各肝癌细胞系中mRNA和蛋白的表达；采用ELISA (b)的方法检测细胞培养基上清中分泌性ANGPTL4蛋白的表达。结果表明ANGPTL4 在高转移潜能的肝癌细胞系(MHCC-LM3，MHCC-97，MHCC-97L，MHCC-97H)中高表达。图2显示了外源性表达ANGPTL4促进Huh7和SMMC-7721肝癌细胞的跨血管内皮细胞迁移。各图如下
a. Western blot 检测 ANGPTL4 及分泌性 ANGPTL4 蛋白(sANGPTL4)在稳定过表达细胞系Huh7-lenti-ANGPTL4和SMMC-7721-lenti_ANGPTL4及相应对照细胞中的表达水平。b.采用定量PCR检测ANGPTL4在稳定过表达细胞系Huh7-lenti_ANGPTL4和 SMMC-7721-lenti-ANGPTL4及相应对照细胞中ANGPTL4 mRNA的表达水平。c.采用ELISA方法检测细胞培养基上清中分泌性ANGPTL4蛋白的表达。d. Huh7-1 enti-ANGPTL4细胞和对照组Huh7-lenti_control细胞跨血管内皮细胞迁移实验代表性图片(标尺为100 μ m)及迁移细胞数统计图(*指P < O. 001)。e. SMMC-7721-lenti-ANGPTL4 细胞和对照组 SMMC-7721-lenti-control 细胞跨血管内皮细胞迁移实验代表性图片(标尺为100 μ m)及迁移细胞数统计图(*指P<0. 001)。
图3显示了 ANGPTL4促进SMMC-7721细胞在裸鼠体内的肝内转移及肺转移。肝原位接种SMMC-7721-lenti-ANGPTL4细胞及其相应对照组细胞的肝内转移和肺转移(左图， 标尺为100 μ m);右图为统计图(*指P <0.05)。图4显示了裸鼠血清中人SANGPTL4的水平。其中，肝原位接种 SMMC-7721-lenti-ANGPTL4细胞及其相应对照组细胞，6周后检测其血清中人sANGPTL4水平。*P < O. 01图5显示了干扰ANGPTL4和ANGPTL4抗体均能抑制MHCC-97L细胞的跨血管内皮细胞迁移。各图如下a.在MHCC-97L细胞中干扰ANGPTL4后跨血管内皮细胞迁移实验代表性图片 (200 X)及迁移细胞数统计图(*指P < O. 05)。b. ANGPTL4抗体处理MHCC-97L细胞后，跨血管内皮细胞迁移实验代表性图片 (200X)及迁移细胞数统计图，*指P < O. 05。图6显示了分泌性ANGPTL4蛋白促进Huh7和SMMC-7721的跨血管内皮细胞迁移。 各图如下a.蛋白印迹检测C0S7-lenti_ANGPTL4和C0S7-lenti_control细胞裂解液中和条件性培养基上清中ANGPTL4的表达。b.含人SANGPTL4蛋白的条件性培养基上清(CM-ANGPTL4)和对照组 (CM-control)处理Huh7后跨血管内皮细胞迁移实验代表性图片(200X)(左图)；右图为细胞迁移数统计图。c. CM-ANGPTL4处理SMMC-7721和对照组后跨血管内皮细胞迁移实验代表性图片 (200X)(左图);右图为细胞迁移数统计图；*指？ < 0.05。图7显示了分泌性ANGPTL4蛋白促进MHCC-97L细胞在体内的肺转移。其中，条件性培养基上清处理实验中，尾静脉接种MHCC-97L细胞导致肝转移和肺转移。图8显示了 HCC患者血清和健康对照组血清中ANGPTL4的浓度。各图如下a HCC患者血清和健康对照组血清中ANGPTL4的浓度的统计分析图；b HCC患者伴发肝内转移和未伴发肝内转移患者血清中ANGPTL4的浓度的统计分析图。*指P < O. 05。图9显示了血清ANGPTL4的ROC曲线。其中，ROC曲线下面积为O. 709±0. 026(95% 可信区间为O. 659和O. 759). cut-off值设定在93. 5ng/ml以区分健康对照组和肝癌患者，其敏感性和特异性为44. 7%和87. 4% .箭头指示血清ANGPTL4的阈值(cut-off)为93.5ng/ml。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，在肝癌细胞中分泌性ANGPTL4 能够促进肝癌细胞的体外跨血管内皮细胞迁移和在动物体内的肝转移和肺转移；此外，肝癌患者血清中ANGPTL4浓度与肝癌患者是否发生肝内转移密切相关。因此，血清ANGPTL4 可以作为检测肝癌转移和/或肝癌的标志物。在此基础上完成了本发明。ANGPTL4蛋白和基因在本发明中，术语“本发明蛋白”、“ ANGPTL4蛋白”、“ ANGPTL4多肽”或“血管生成素样蛋白ANGPTL4”可互换使用，都指具有人血管生成素样蛋白ANGPTL4氨基酸序列 AAG22490(gi =10732648)的蛋白或多肽。它们 包括含 有或不含起始甲硫氨酸的血管生成素样蛋白ANGPTL4。此外，该术语还包括全长的ANGPTL4及其片段。本发明所指的ANGPTL4蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。在本发明中，术语“ANGPTL4基因”、“ANGPTL4多核苷酸”或“血管生成素样蛋白基因ANGPTL4”可互换使用，都指具有人ANGPTL4核苷酸序列(AF202636)的核酸序列。需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。在得到了 ANGPTL4的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列， 并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通�？梢杂肞CR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的ANGPTL4核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的 DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的ANGPTL4多肽。一般来说有以下步骤(I).用本发明的编码人ANGPTL4多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本发明中，ANGPTL4多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质�：驮靥宥伎梢杂�。表达载体的一个重要特征是通�：懈粗破鸬�、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含ANGPTL4编码DNA序列和合适的转录 /翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收D NA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导) 诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、 吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结
口 ο特异性抗体在本发明中，术语“本发明抗体”和“抗ANGPTL4的特异性抗体”可互换使用。本发明还包括对人ANGPTL4多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人ANGPTL4基因产物或片段。较佳地，指那些能与人ANGPTL4基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。 本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人ANGPTL4蛋白的分子，也包括那些并不影响人 ANGPTL4蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人ANGPTL4基因产物结合的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4，946，778);或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人ANGPTL4基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人ANGPTL4蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见 Kohler 等人，Nature 256 ；495,1975 ；Kohler 等人，Rur. T. Tmmunol. 6 511,1976 ；Kohler 等人，F.ur. T. Tmmunol. 6 :292,1976 ； Hammer I ing 等人，In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y. , 1981)。本发明的抗体包括能阻断人 ANGPTL4蛋白功能的抗体以及不影响人ANGPTL4蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人ANGPTL4基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人ANGPTL4基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E. Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗人ANGPTL4蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本(尤其是血清样本)中的人ANGPTL4蛋白。检测方法利用ANGPTL4存在于血清中，且与肝癌转移密切相关这一特点，本发明还提供了检测或判断肝癌转移的方法，尤其是血清学检测方法。
在本发明的一个优选例中，本发明提供一种检测血清ANGPTL4的ELISA法以及时间分辨免疫荧光法(TRFIA)。检测试剂盒本发明还提供了一种检测肝癌转移的试剂盒，它含有本发明的抗ANGPTL4的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段。本发明的人肝癌血清学诊断试剂盒，已完成实验上百例，阳性率为约55%。用本发明的人肝癌转移的血清学诊断试剂盒检测为阳性的对象，其肝癌转移的几率明显高于正常人群或一般肝癌患者。药物组合物本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的ANGPTL4的拮抗剂，以及药学上可接受的载体。所述的药物组合物可用于抑制肝癌细胞的转移。在本发明中，所述的拮抗剂包括针对ANGPTL4的siRNA、反义RNA、抗体、或其组合。 此外，所述的拮抗剂还包括可以降低ANGPTL4表达或活性的小分子化合物。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)腹膜内、静脉内、或局部给药。本发明的药物组合物可直接用于抑制肝癌细胞的转移。此外，还可与其他肿瘤治疗剂联用。本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的ANGPTL4拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约I微克 /千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的ANGPTL4拮抗剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约I毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。抑制或促进肝癌细胞的迁移的方法和组合物
本发明还提供了 ANGPTL4激动剂及其在促进肝癌细胞迁移中的用途，尤其是在制备促进肝癌细胞迁移的促进剂或组合物的用途。在本发明中，用ANGPTL4激动剂或含该激动剂的组合物，可以促进肝癌细胞在体外或体内迁移。在一优选例中，提供了一种体外促进肝癌细胞迁移的方法，包括步骤在ANGPTL4 蛋白或其激动剂存在下，培养肝癌细胞。本发明还提供了 ANGPTL4拮抗剂及其在抑制肝癌细胞迁移中的用途，尤其是在制备抑制肝癌细胞迁移的抑制剂或组合物的用途。在本发明中，用ANGPTL4拮抗剂或含该拮抗剂的组合物，可以抑制肝癌细胞在体外或体内迁移。在一优选例中，提供了一种体外抑制肝癌细胞迁移的方法，包括步骤在ANGPTL4 拮抗剂存在下，培养肝癌细胞。本发明的主要优点包括(I)首次提供了通过血清标志物检测和判断肝癌转移的方法，有助于早期检测或辅助检测肝癌转移，从而有助于尽早确诊并采取相应治疗措施。(2)血清检测方法更方便快速，更容易为病人接受。(3)便于动态监察HCC患者的病情进展。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。实验方法SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹分析细胞裂解和蛋白电泳用冰预冷的PBS洗涤培养细胞，收集后将其悬在含有蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)的RIPA缓冲液(购自Pierce公司)中裂解，裂解过程在冰上进行30分钟。4°C条件下12，000r/min离心10分钟后收集上清，然后采用常规BCA法蛋白定量。定量后的样品与5X上样缓冲液混合并在95-100°C水浴中变性5分钟。蛋白电泳在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)及缓冲体系中进行，样品按30-60 μ g/孔上样，80/120V恒压电泳。免疫印迹电泳结束后，采用湿转法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。转膜条件 220mA恒流作用30分钟。结束后将膜在PBST (0. I % Tween 20)中漂洗一次，浸入5%脱脂奶粉封闭液中，室温封闭I小时。然后将膜浸入用封闭液稀释的适当浓度的一抗，4°c孵育过夜。次日以PBST洗膜三次，每次10分钟。之后与封闭液稀释的过氧化物酶偶联二抗进行反应，室温孵育I小时后，再以PBST洗膜三次。目标蛋白条带的发光显影利用SuperSignal 化学发光试剂(购自Pierce公司)进行。所有Western免疫印迹实验均以β-actin作为内参。实时定量PCR检测逆转录用PrimeScript RT reagent Kit (Takara 公司)，在 200 μ I 微量离心管中配置混合液5XPrimeScript Buffer (for Real Time) 2 μ I ；PrimeScript RT Enzyme Mix I 0. 5 μ I ；01igo dT Primer (50 μ M) 0. 5 μ I ；Random 6 mers (100 μ M) 0. 5 μ I ;总 RNA 500ng ;DEPC水补足10μ I。37 V反应15分钟，85°C处理5秒钟，然后冰浴冷却。其中，总 RNA用常规方法抽提。定量PCR:将逆转录得到的cDNA反应液I : 50稀释备用。PCR反应在20 μ I体系中进行2μ1 cDNA稀释液(相当于50ng起始RNA量)；上下游引物各O. 4 μ I ;2 X SYBR Premix Ex Taq Solutions (Takara 公司)10 μ I ;灭菌蒸懼水 7. 2 μ LPCR反应在ABI 7300 定量PCR仪上进行，反应条件为两步法PCR扩增标准程序第一步95°C，30秒，I个循环；第二步95°C，5秒，60°C，31秒，40个循环。反应测得的基因表达水平使用内源性甘油醛_3_磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为参照标化。 条件性培养基上清的收取将生长状态良好的细胞消化计数，每种细胞均以相同细胞数接至IOcm的细胞培养皿中。到第二天约达到90%左右的融合度，换含O. 02% FBS的DMEM。在37°C，5% CO2 和饱和湿度条件下培养24小时，收取培养基上清，4°C条件下3000r/min离心备用。若用于 Western blot实验的样品，与5X上样缓冲液混合并在95_100°C水浴中变性5分钟。分泌性ANGPTL4蛋白的ELISA检测细胞培养基上清以及裸鼠血清中SANGPTL4的浓度测定均按照R&D公司DuoSet ELISA Development System说明书进行，方法如下I)在不含任何蛋白的PBS中稀释捕获抗体(浓度为0. 8yg/ml)，将该稀释后的捕获抗体100 μ I/孔加入到酶标板内。2)将酶标板封好防止蒸发，在室温孵育过夜。3)吸干每一孔的液体并加400 μ I洗液洗涤，重复3次。最后一步，将板中液体移出并将酶标板在干净的纸巾上吸附。4)加300 μ I/孔封闭液封板,室温孵育I小时。5)重复步骤3。6)每孔加100μ I适当稀释的标准品和标本，轻轻敲打酶标板I分钟。贴上封板膜，室温孵育2小时。本研究中样本的稀释度为I : 10或I : 50。7)重复步骤3。8)每孔加100μ1检测抗体(浓度为400ng/ml)，贴上新的封板膜，室温孵育2小时。9)重复步骤3。10)每孔加 100 μ I 链亲和素(Streptavidin)-HRP。
11)重复步骤3。12)每孔加100 μ I底物(TMB液体底物系统，Sigma Aldrich公司)，避光，室温孵育5-30分钟进行显色反应。13)每孔加50 μ I终止液(2Ν H2SO4)，轻轻振荡酶标板确保充分混匀。14)在30分钟内在酶标仪上采用450nm波长对结果进行判读。15)数据分析和计算。重组表达载体pWPXL-ANGPTL4的构建用肝细胞eDNA为模板，设计和合成引物扩增人ANGPTL4的完整的全长序列，并在 5’端和3’端分别引入Pmel/Ndel酶切位点。通过常规PCR法扩增ANGPTL4开放阅读框。 将扩增的PCR扩增片段纯化后用Pmel/Ndel酶切，与同样经过Pmel/Ndel酶切的pWPXL载体(可购自Addgene公司)连接，16°C连接过夜，获得pWPXL_ANGPTL4，并经酶切检验和测序验证。
pLVTHM-shANGPTL4的构建(用于在体内产生siRNA干扰片段)使用siRNA的方法筛选有效干扰ANGPTL4表达的片段。根据筛选出的有效序列， 合成核苷酸序列如下的单链DNA 5，-cgcgtccccgaggcagagtggactatttttcaagagaaaatagtccactctgcctctttttggaaa t_3，(SEQ ID NO. :I,其中第 6-28 位为干扰 ANGPTL4 的有效序列)，5’_cgatttccaaaaagagg cagagtggactattttctcttgaaaaatagtccactctgcctcgggga-3> (SEQ ID NO. :2)构建克隆方法如下I)退火将上述寡核苷酸单链分别溶于去离子水，至浓度为ΙΟρΜ。互补的寡核苷酸各取2 μ 1，加48 μ I退火缓冲液(IOOmM乙酸钾，30mM pH7. 4的HEPES，2mM乙酸镁)。95°C 孵育4分钟，70°C孵育10分钟，4°C冷却。2)磷酸化取5 μ I已退火的寡核苷酸，加12 μ I水，2 μ I Τ4连接酶缓冲液(含ImM ATP)，I μ I小牛肠碱性磷酸酶(CIP)，37°C孵育30分钟，然后70°C孵育10分钟灭火CIP。3)连接与经过Mlul/Clal酶切的pLVTHM载体(可购自Addgene公司)连接， 16 °C连接过夜。感受态细菌的转化按常规方法，用常规的大肠杆菌HBlOl感受态细菌进行转化。所得克隆用质粒小抽试剂盒抽提，酶切鉴定是否插入外源性片段。对于有插入外源性片段的克隆进行测序。包装病毒本发明中使用的慢病毒包装体系是购自Addgene公司的三质粒系统，包括pWPXL/ pLVTHM(携带目的基因或干扰片段)，psPAX2和pMD2. G。将生长状态良好的HEK-293T细胞(ATCC =CRL-11268)接至IOcm的细胞培养皿中，到第二天约达到95%以上的融合度，进行转染。转染试剂用Lipofectamine 2000，三质粒的用量的摩尔比为I : I : 1，总量为 24. 6 μ g。操作过程参照Lipofectamine 2000的操作说明将12 μ g的pffPXL/pLVTHM或相应的 pWPXL-ANGPTL4/pLVTHM-shRNA，9 μ g psPAX2 和 3· 6 μ gpMD2. G 与 I. 5ml 的 Opti-ΜΕΜ 混合，60 μ I的Lipofectamine 2000与I. 5ml的Opti-MEM混合，室温放置5分钟；将以上两种混合液轻柔混合,室温孵育20分钟，形成转染复合物；将混合液加入到已接好的HEK-293T 细胞中，再加DMEM至总体积IOml ;转染6小时后换IOml含10% FBS的DMEM，终止转染；24小时后观察荧光，转染效率要达到90%以上；60小时收取培养液，4°C条件下3000r/min离心，O. 4 μ m的滤膜过滤，滤液分装，_70°C冻存备用。肿瘤细胞的病毒感染将生长状态良好的肿瘤细胞，接至6孔板，第二天约达到60-70%的融合度，进行感染。用含10% FBS的DMEM将病毒液I : 4稀释，在稀释液中加polybrene至终浓度为
10μ g/ml ;将稀释液加到细胞中，培养6小时后换10% FBS的DMEM。24小时可观察荧光。
跨血管内皮细胞迁移实验所用肿瘤细胞均由质粒pLGS标记,该质粒是Iuciferase和GFP双标的质粒,是将含Iuciferase和GFP两个基因的DNA片段通过BamHI/XhoI酶切位点装入pWPXL载体而形成)。取对数期生长的常规的人内皮HUVEC细胞(ATCC CRL-1730)接入Trans-well小室 (3 X IO4细胞，100 μ I DMEM培养基)，培养至细胞融合(约24h);接种悬于100 μ I DMEM的 IXlO5肿瘤细胞，下室加含10% FBS的DMEM，三孔重复；20小时后，小室用4%的福尔马林固定；将小室外侧的细胞刮掉，在倒置荧光显微镜下观察，随机选拍6个视野，进行计数并分析。ANGPTL4抗体处理实验HUVEV细胞的接种同前。接种肿瘤细胞时，在肿瘤细胞的悬液中加兔抗ANGPTL4抗体(可购自Santa Cruz, M-200, sc-66807),至终浓度为40 μ g/ml ;对照组加相同浓度的不针对ANGPTL4的兔IgG对照抗体；其余步骤同上。条件性培养基处理实验HUVEV细胞的接种同前。接种肿瘤细胞时，用100 μ I条件性培养基重悬I X IO5肿瘤细胞，其余步骤同上。细胞免疫化学分析细胞接种在包被有多聚赖氨酸的灭菌载玻片上，培养24小时；培养结束后去除培养基，在PBS中轻柔浸洗载玻片；用4%中性多聚甲醛在室温下固定20分钟，然后用 SuperBlocking封闭液(可购自Pierce公司)封闭细胞30分钟。切片在4°C条件下与一抗反应过夜；次日在PBS中洗涤三次共15分钟；加二抗，室温孵育I小时，然后DAB显色； 然后采用苏木素复染，漂洗风干后中性树胶封片，染色结果在正置光学显微镜下观察。小鼠肝原位接种试验取生长状态良好的细胞，每份IX IO6细胞，用无血清DMEM和Matrigel等比配成混合液40 μ I悬浮细胞，置于冰上；28只裸鼠分为实验组和对照组，每组14只，30. 5% (wt)戊巴比妥钠腹腔麻醉，剑状突下横行切开小鼠腹腔，用两支医用棉签轻轻拖出，显露肝脏；在左肝叶实质内注入细胞，拔针后用干棉签压迫止血；缝合腹腔，3天观察一次，接种细胞后 6周无痛苦牺牲裸鼠，采集血清、肝和肺，血清用于ELISA检测，肝、肺组织做常规病理学检查，常规石蜡切片、苏木素/伊红(HE)染色，显微镜下统计小鼠肝内转移和肺转移结节数。小鼠尾静脉接种试验每周三次裸鼠腹腔内注射所收取含ANGPTL4条件性培养基或相应对照。一周后， 取生长状态良好的MHCC-97L细胞，每份4X IO6细胞，用无血清DMEM 300ul悬浮细胞，尾静脉接种细胞，之后持续每周三次裸鼠腹腔内注射条件性培养基，维持8周。无痛苦牺牲实验动物，采集肝和肺组织。
数据处理实验获得数据按常规方法进行整理和统计分析。计量数据以平均值土标准差的形式表示，采用Student’s t_test分析其统计学意义；分类数据采用Chi-square检验。统计检验得到的概率P < O. 05认为具有统计学意义。实施例II. ANGPTL4在高转移潜能的肝癌细胞系中高表达采用定量PCR方法和Western blot检测了多种常用的肝癌细胞系中ANGPTL4 mRNA和蛋白 的表达水平。结果如图Ia和Ic所示。ANGPTL4在人高转移潜能肝细胞系MHCC-LM3，MHCC-97， MHCC-97L和MHCC-97H的表达相对较高，而在其他非高转移性的肝癌细胞系中HepG2， H印3B，Huh-7, SMMC-7721, FOCUS 和 PLC/PRF/5 低表达。鉴于ANGPTL4是分泌性蛋白，还利用ELISA方法检测了分泌性ANGPTL4蛋白水平是否与细胞本身表达水平相一致。结果表明，分泌性SANGPTL4在细胞培养基上清中的分泌水平与Western印迹检测结果的趋势是一致的(图lb)。上述结果表明，ANGPTL4在人转移潜能肝细胞系MHCC-LM3，MHCC-97，MHCC-97L和 MHCC-97H的胞内和分泌的表达水平相对较高，提示ANGPTL4的表达与肝癌细胞的转移潜能密切相关。实施例2外源性表达ANGPTL4促进肝癌细胞的跨血管内皮细胞迁移(trans-endothelial migration)本实施例中，根据ANGPTL4在各个肝癌细胞系的表达情况，选取ANGPTL4低表达的肝癌细胞Huh7和SMMC-7721，利用慢病毒载体构建了 ANGPTL4稳定过表达细胞系，分别命名为Huh7-lenti-ANGPTL4和SMMC-7721-lenti_ANGPTL4，相应的对照命名为 Huh7-lenti_control 和 SMMC-7721-lenti-control。分别采用定量PCR和Western blot检测了在ANGPTL4稳定过表达细胞系中 ANGPTL4的表达水平(图2a，b)，证实过表达ANGPTL4成功。为验证分泌性ANGPTL4蛋白的表达，同时采用ELISA和Western blot方法检测了在ANGPTL4稳定过表达细胞系的细胞培养基上清中SANGPTL4蛋白的水平(图2a，c)。结果表明 Huh7-lenti-ANGPTL4 和 SMMC-7721-lenti_ANGPTL4 中 sANGPTL4 的表达水平显著高于相应的对照组。对Huh7-lenti-ANGPTL4 和 SMMC-7721-lenti_ANGPTL4 细胞进行了跨血管内皮细胞迁移实验，检测各组细胞跨过血管内皮细胞层的数量。结果表明Huh7-lenti-ANGPTL4和 SMMC-7721-lenti-ANGPTL4与各自的对照组相比具有更强的迁移能力，具有显著性差异(P < 0.001)(图2d，e)。这表明，在低迁移能力的两种肝癌细胞Huh7和SMMC-7721中，过表达ANGPTL4都显著增强了肝癌细胞的迁移能力。实施例3外源性表达ANGPTL4促进SMMC-7721细胞在裸鼠体内的肝内转移和肺转移体外实验证实了 ANGPTL4能够促进肝癌细胞的跨血管内皮细胞迁移，本实施例进一步研究了 ANGPTL4在体内对肝癌细胞转移的影响。方法如下在裸鼠体内原位接种SMMC-7721-lenti-ANGPTL4细胞和相应对照组 SMMC-7721-lenti-control细胞，术后6周无痛苦牺牲实验动物，采集血清、肝和肺组织。对肝和肺组织进行常规病理组织学检查，统计实验组和对照组裸鼠发生肝内转移和肺转移的结节数。结果表明，虽然实验组和对照组所有裸鼠均发生肝内转移，实验组有6只裸鼠可以检测到肺转移，甚至有多个转移灶，而对照组均未观察到肺转移(表1，图3)。进一步统计分析实验组和对照组发生肝内转移和肺转移的差异，发现实验组肝内转移灶个数(59)明显高于对照组(33) (P = O. 016);实验组发生肺转移的例数以及肺转移灶个数(17)与对照组(O)相比有明显差异(P = O. 038)(图3)。这些结果表明，ANGPTL4在裸鼠体内能明显促进SMMC-7721细胞的肝内转移和肺转移。表I.裸鼠肝内转移和肺转移归纳表
、。 ^ — 肝_转夢*4个？— — — — —啤转f多电个？——— 裸鼠
S丽C-7721- S丽C-7721- S丽C-7721- S丽C-7721-
Ι
lenti-control lenti_ANGPTL4 lenti-control lenti_ANGPTL4
15800
22702
3170I
4I500
51502
62406
72400
84400
92300
102305
11230I
122 2 0 0
13I200
146200 小·^ 33 59 0 17采用ELISA方法检测了裸鼠血清中sANGPTL4水平，发现实验组裸鼠血清中的 SANGPTL4水平明显高于对照组(P < 0.01)，实验组的平均值为181 ±81ng/ml (平均数土 SD)，范围从 87-325ng/ml ;对照组为 30±5ng/ml (平均数土 SD)，范围从 25_36ng/ml (图 4)。表明在裸鼠体内SMMC-7721-lenti-ANGPTL4细胞能够有效分泌ANGPTL4到血液中，从而影响裸鼠血清中人SANGPTL4水平。该结果提示，血清中ANGPTL4水平与肝癌转移存在一定相关性。实施例4干扰ANGPTL4的表达可抑制MHCC-97L细胞的跨血管内皮细胞迁移在已证明外源性表达ANGPTL4能够促进肝癌细胞系的跨血管内皮细胞迁移和裸鼠体内转移的基础上，本实施例进一步验证内源性表达的ANGPTL4在跨血管内皮细胞迁移中的作用。在相对高表达ANGPTL4且具有高转移潜能的肝癌细胞系的MHCC-97L细胞中，采用 shRNA的方法干扰和降低了 ANGPTL4的表达。与对照组相比，干扰ANGPTL4表达后MHCC-97L 跨血管内皮细胞迁移能力明显降低，具有显著差异(P < O. 01)(图5a)。分泌性蛋白的抗体能够拮抗该蛋白诱导的功能。因此，在进行跨血管内皮细胞迁移实验中，将市售的ANGPTL4抗体加入到MHCC-97L细胞的培养液中，检测其对MHCC-97L细胞跨血管内皮细胞迁移能力的影响。 结果表明，与在MHCC-97L细胞中干扰ANGPTL4的效果是一致的，ANGPTL4抗体处理后能显著降低MHCC-97L细胞跨血管内皮细胞迁移能力(P < O. 001)(图5b)。以上实验结果表明，无论是降低内源性ANGPTL4表达或添加外源性的抗ANGPTL4 抗体，均降低了肝癌细胞的迁移能力。实施例5分泌性ANGPTL4蛋白促进肝癌细胞的跨血管内皮细胞迁移ANGPTL4是分泌性蛋白，前述实验结果表明肝癌细胞自身表达的ANGPTL4能有效的分泌到培养基上清中，而且ANGPTL4抗体处理后能显著降低MHCC-97L细胞跨血管内皮细胞迁移能力。因此，在本实施例中，收集条件性培养基(Condition medium, CM)上清处理ANGPTL4低表达的肝癌细胞，检测分泌性ANGPTL4蛋白对肝癌细胞跨血管内皮细胞迁移的影响。本实验中所用培养基上清来源于稳定过表达ANGPTL4的细胞系C0S7，简写为 C0S7-lenti-ANGPTL4，选择C0S7细胞可以排除肿瘤细胞其他分泌性因子的影响。首先验证了 ANGPTL4在C0S7-lenti_ANGPTL4及其对照组细胞中的表达水平，与对照组相比，ANGPTL4不管是在细胞裂解液中还是培养基上清液中，C0S7-lenti-ANGPTL4中的表达水平显著增高(图6a)。在进行跨血管内皮细胞迁移实验时，用条件性培养基上清分别处理Huh7和 SMMC-7721细胞，结果发现，与对照组相比，含ANGPTL4的条件性培养基上清能明显促进 Huh7和SMMC-7721细胞的跨血管内皮细胞迁移(图6b，c)。这提示即使肝癌细胞本身不表达或低表达ANGPTL4，当其处于含有较高浓度ANGPTL4的环境中，肝癌细胞的跨血管内皮细胞迁移的能力也会增强。实施例6分泌性ANGPTL4蛋白促进肝癌细胞在裸鼠体内的肺转移体外实验证实了分泌性ANGPTL4蛋白能够促进肝癌细胞的跨血管内皮细胞迁移， 本实施例采用尾静脉接种法，进一步研究了分泌性ANGPTL4蛋白在裸鼠体内对肝癌细胞转移的影响。每周三次裸鼠腹腔内注射条件性培养基，一周后尾静脉接种MHCC-97L细胞，之后持续每周三次裸鼠腹腔内注射条件性培养基，维持8周。无痛苦牺牲实验动物，采集肝和肺组织。对肝和肺组织进行常规病理组织学检查，统计实验组和对照组裸鼠发生肝内转移和肺转移的结节数。结果表明，实验组I只裸鼠发生肝转移，对照组未检测到肝转移；实验组有7只裸鼠可以检测到肺转移，而对照组只观察到一例肺转移(表2，图7)。这说明，分泌性ANGPTL4 蛋白在裸鼠体内明显促进MHCC-97L细胞的肺转移。表2.裸鼠肝转移和肺转移归纳表
肝转移肺转移CM-control 0/8*1/8
CM-ANGPTL4 1/87/8
发生转移的小鼠数目/小鼠总数目。实施例7血清中ANGPTL4浓度与肝癌患者发生肝内转移密切相关本实施例采用抗ANGPTL4的特异性单抗，通过ELISA方法(双抗夹心法)检测了 463例肝癌患者和90例健康对照组血清中ANGPTL4的浓度。结果表明在HCC血清中ANGPTL4的浓度为115. 0±117. Ong/ml (平均数土SD)； 健康对照组血清中ANGPTL4的浓度为55. 6 ±30. 9ng/ml (平均数土 SD)。肝癌患者血清中 ANGPTL4浓度明显高于对照组血清(P < O. 05)(图8a)。对于检测的HCC患者进一步分析表明，伴有肝内转移的肝癌患者血清ANGPTL4浓度(145. 8±16. 3ng/ml)明显高于未发生肝内转移的患者(106. 5±6· 8ng/ml) (P < O. 05) (图 8b)。这提示，血清ANGPTL4浓度高于130ng/ml，这提示该对象发生肝癌转移的几率显
著上升。实施例8血清ANGPTL4浓度与各项临床指标的关系为进一步探索血清ANGPTL4浓度与各项临床指标的关系，根据ROC曲线(图9)设定了 ANGPTL4的cut-off值为93. 5ng/ml，其敏感性和特异性分别为44. 7%和87. 4%，阳性率约为55% (80/144)。纳入统计分析的临床病理指标主要有患者性别、年龄、血清甲胎蛋白、乙肝病毒表面抗原、肿瘤大小、Edmondson组织学分级、肝内转移和伴发肝硬化。统计分析结果显示，血清ANGPTL4浓度与肝癌患者伴发肝内转移，Edmondson组织学分级以及伴发肝硬化等指标密切相关(表3)。结合上述体内外实验研究，可以得出结论，分泌性ANGPTL4在肝癌转移过程中起到了重要的作用，可以作为肝癌转移的标志物。表3血清ANGPTL4浓度与肝癌患者临床病理指标的相关性分析
权利要求
1.血管生成素样蛋白4(ANGPTL4蛋白)或其特异性抗体的用途，其特征在干，(a)用于制备检测肝癌转移的诊断试剂或试剂盒；(b)用于制备血清检测肝癌的诊断试剂或试剂盒。
2.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的ANGPTL4蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。
3.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述可检测标记选自下组生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
4.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂是单克隆抗体。
5.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的检测肝癌转移是血清检测。
6.一种用于检测肝癌转移的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有ANGPTL4蛋白或其特异性抗体；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断肝癌转移。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的ANGPTL4蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。
8.—种血管生成素样蛋白4(ANGPTL4蛋白)的用途，其特征在于，它被用作血清检测肝癌转移的标志物。
9.ー种血管生成素样蛋白4(ANGPTL4蛋白)的拮抗剂的用途，其特征在于，用于制备抑制肝癌细胞转移的药物。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的拮抗剂包括针对ANGPTL4的siRNA、反义RNA、抗体、或其组合。
全文摘要
本发明涉及一种ANGPTL4作为血清学检测肝癌转移的标志物及其应用。具体地，本发明提供了血管生成素样蛋白4(ANGPTL4蛋白)在(a)制备检测肝癌转移的诊断试剂或试剂盒以及(b)制备血清检测肝癌的诊断试剂或试剂盒中的用途。本发明还提供了相应检测试剂盒。本发明还提供了用ANGPTL4蛋白的拮抗剂抑制肝癌细胞转移的方法。
文档编号G01N33/574GK102692500SQ20111006804
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月21日 优先权日2011年3月21日
发明者姚明, 李红, 李锦军, 田华, 葛超, 赵方瑜, 郝向芳, 闫明霞, 顾健人 申请人:上海市肿瘤研究所
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