专利名称：一种检测Cry1Ab/Cry1Ac杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，涉及一种检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒及其制备方法。
背景技术：
Bt蛋白是由苏云金芽孢杆菌在芽孢形成过程中产生的伴孢晶体蛋白，其分子结构复杂，在伴孢晶体内是以毒素蛋白原的形式存在，在昆虫肠道内可被蛋白酶水解而被活化; 活化的Bt毒蛋白可与昆虫肠道上皮细胞表面的特异受体相互作用，诱导并引起细胞膨胀甚至裂解，导致昆虫停止进食而最终死亡。通过转基因技术，将Bt毒蛋白基因引入农作物中，为控制害虫危害农业提供了新的思路。目前应用最广的主要是Cry类Bt毒蛋白，转Cry类Bt抗虫基因棉花、玉米和马铃薯等都已经进入了商业化生产。对于转基因植物，在实际大田生产过程中，抗虫性的强弱与植物体内的杀虫蛋白含量直接相关，亦即与基因在植物体内的表达水平直接相关，因此准确地定量出植物器官、组织中毒蛋白的含量，对于指导抗虫作物生产具有特别重要的意义。杀虫蛋白在转基因植物中的含量极低，仅占植物组织中可溶性蛋白含量的 0. 001% -0. 3%，但迄今对于转基因植物中Bt杀虫蛋白的检测方法不多，且检测灵敏度、检测限和抗干扰能力等亟待提高。目前，有关CrylAb/CrylAc杀虫蛋白免疫检测技术的研究报告和相关专利技术国内外报道很少，迫切需要开发高效、准确、快速的新型免疫检测技术禾口广品。
发明内容
本发明的目的在于进一步填补CrylAb/CrylAc杀虫蛋白免疫检测技术的研发空白，提供一种检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒。本发明的另一目的是提高该免疫纳米磁颗粒的制备方法。本发明的目的是这样实现的一种检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒，该免疫纳米磁颗粒由抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白多克隆抗体包被，磁颗粒大小150 200nm,具体通过如下步骤制备(1)将 0. 85 1. 5g 无水 FeCl3 和 0. 6 1. 2g FeCl2 · 4H20 溶解于 IOOml 超纯水中，加热搅拌至完全溶解；(2)在温度80-85°C时，加入15 20ml 2 5M NaOH溶液于步骤(1)所得混合液中，反应2 5min，加入15 20ml 0. 05 1. OM的PAA溶液，继续加热搅拌30min，得到水
溶性羧基纳米磁颗粒；(3)将所述的水溶性羧基纳米磁颗粒在外加磁场作用下用无水乙醇洗涤3 5次， 以超纯水分散保存；(4)将鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白抗体，通过羧基-氨基化学偶联法偶联所述的
4水溶性羧基纳米磁颗粒，得到检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒。其中，步骤O)中所述的PAA溶液是分子量为1800 2000的短链聚丙烯酸溶液。 短链聚丙烯酸可以作为表面修饰剂和活性剂，其链上的羧基团结合于狗304纳米磁颗粒表面，具有疏水性质的羧基使纳米磁颗粒稳定分散于水性溶剂。步骤(3)中所述的外加磁场为恒流电磁�。鸥杏η慷任�30mT。步骤中所述的羧基-氨基化学偶联法是采用碳化二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺活化法偶联抗体首先用30mM、pH = 5的2-(N-吗啉)-乙烷磺酸缓冲液在外加磁场作用下清洗所述的水溶性羧基纳米磁颗粒，使所述的水溶性羧基纳米磁颗粒分散于2-(N-吗啉)-乙烷磺酸缓冲液中，终浓度为40 60mg/ml ；取所述的含水溶性羧基纳米磁颗粒的 2-(N-吗啉)-乙烷磺酸缓冲液100 μ 1，依次加入50mM碳化二亚胺、50mM N-羟基丁二酰亚胺溶液各50 100 μ 1，室温震荡30 40min，在磁场作用下弃上清，用2-(N-吗啉)-乙烷磺酸溶液清洗3次，得已活化的纳米磁颗粒；取1. 09mg/ml所述的鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白多克隆抗体100 200 μ 1，加入所述的已活化的纳米磁颗粒，室温震荡30 40min，磁性分离，收集收集上清，用0. 02M、pH = 7. 4磷酸缓冲液多次洗涤，得到所述的检测CrylAb/ CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒。步骤(4)所述的鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白抗体优选鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白多克隆抗体。所述的鼠抗Cry lAb/Cry IAc杀虫蛋白多克隆抗体是将Cry lAb/Cry IAc杀虫蛋白与弗氏佐剂混合后免疫小鼠，经分离纯化得到鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白多克隆抗体。一种检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒的制备方法，包含如下步骤(1)将 0. 85 1. 5g 无水 FeCl3 和 0. 6 1. 2g FeCl2 · 4H20 溶解于 IOOml 超纯水中，加热搅拌至完全溶解；(2)在温度80-85°C时，加入15 20ml 2 5M NaOH溶液于步骤(1)所得混合液中，反应2 5min，加入15 20ml 0. 05 1. OM的PAA溶液，继续加热搅拌30min，得到水
溶性羧基纳米磁颗粒；(3)将所述的水溶性羧基纳米磁颗粒在外加磁场作用下用无水乙醇洗涤3 5次， 以超纯水分散保存；(4)将鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白抗体，通过羧基-氨基化学偶联法偶联所述的水溶性羧基纳米磁颗粒，得到检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒。其中，步骤O)中所述的PAA溶液是分子量为1800 2000的短链聚丙烯酸溶液。 短链聚丙烯酸可以作为表面修饰剂和活性剂，其链上的羧基团结合于狗304纳米磁颗粒表面，具有疏水性质的羧基使纳米磁颗粒稳定分散于水性溶剂。步骤(3)中所述的外加磁场为恒流电磁�。鸥杏η慷任�30mT。步骤中所述的羧基-氨基化学偶联法是采用碳化二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺活化法偶联抗体首先用30mM、pH = 5的2-(N-吗啉)-乙烷磺酸缓冲液在外加磁场作用下清洗所述的水溶性羧基纳米磁颗粒，使所述的水溶性羧基纳米磁颗粒分散于2-(N-吗啉)-乙烷磺酸缓冲液中，终浓度为40 60mg/ml ；取所述的含水溶性羧基纳米磁颗粒的 2-(N-吗啉)-乙烷磺酸缓冲液100μ 1，依次加入50mM碳化二亚胺、50mM N-羟基丁二酰亚胺溶液各50 100 μ 1，室温震荡30 40min，在磁场作用下弃上清，用2-(N-吗啉)-乙烷磺酸溶液清洗3次，得已活化的纳米磁颗粒；取1. 09mg/ml所述的鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白多克隆抗体100 200 μ 1，加入所述的已活化的纳米磁颗粒，室温震荡30 40min，磁性分离，收集收集上清，用0. 02M、pH = 7. 4磷酸缓冲液多次洗涤，得到所述的检测CrylAb/ CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒。步骤(4)所述的鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白抗体为鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白多克隆抗体。所述的鼠抗Cry lAb/Cry IAc杀虫蛋白多克隆抗体是将Cry lAb/Cry IAc杀虫蛋白与弗氏佐剂混合后免疫小鼠，经分离纯化得到鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白多克隆抗体。本发明的有益效果本发明采用水溶性羧基化纳米!^e3O4磁颗粒为基质材料，用化学偶联方法偶联抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白多克隆抗体，首次制备成功了检测CrylAb/ CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒。该制备方法取材简单、操作方便、重复性高；所制备的免疫纳米磁颗粒粒径�。废嗑鶆颍褂酶妹庖吣擅状趴帕ＭüХ⒐釫IA法检测 CrylAb/CrylAc杀虫蛋白样品，灵敏度较高，最大检测到的蛋白浓度是lOOOng/ml，最小检测浓度是lng/ml ；而且易于磁富集而排除杂质分子干扰。
图1水溶性羧基纳米磁颗粒JEOL扫描电镜照片。图2水溶性羧基纳米磁颗粒的FIlR光谱分析(红色示对照)。图3水溶性羧基纳米磁颗粒的磁滞回线(红色示对照)。图4水溶性羧基纳米磁颗粒的X射线衍射分析(红色示对照)。图 5CrylAb/CryIAc 杀虫蛋白抗体 1Western Blotting 检测分析。图6抗血清效价测定。图7免疫纳米磁颗粒化学发光EIA法检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白。
具体实施例方式实施例1水溶性羧基纳米磁颗粒的制备1、将0. 85g无水FeCl3和0. 6g FeCl2 · 4H20溶解于IOOml超纯水中，加热搅拌至
完全溶解，此时溶液呈透明黄色；2、以乙二醇为溶剂配制0. 05M的PAA溶液并配制5M的NaOH水溶液。当温度维持在80 85°C时，加入15ml 5M的NaOH溶液于步骤1所得混合液中，溶液颜色变黑，待反应 2min后，加入20ml 0. 05M的PAA溶液，继续加热搅拌30min，得到水溶性羧基纳米磁颗粒。 整个实验过程在恒温水浴和氮气保护下进行；3、将上述水溶性羧基纳米磁颗粒在外加磁场作用下(恒流电磁�。鸥杏η慷任� 30mT)用无水乙醇洗涤3次，以超纯水分散保存；4、制备完成的水溶性羧基纳米磁颗粒形态和大�。峁缤�1所示。通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)对制备完成的水溶性羧基纳米磁颗粒进行表征，具体的操作步骤如下1)将制备好的水溶性羧基纳米磁颗粒冷冻干燥后，加入KBr压片；
2)以相同方法处理作为对照的Fe53O4粉末；3)通过傅里叶红外变换光谱仪(FTIR-8400型)，记录波数在OIOOOcnT1范围内的傅里叶变换红外光谱(FTIR)，结果如图2所示。通过振动样品磁强计(Model 4HF型)检测制备完成的水溶性羧基纳米磁颗粒的磁性(磁滞回线)，磁场强度范围为-6000 60000e，结果如图3所示。通过R-AXIS SPIDER衍射仪记录制备完成的水溶性羧基纳米磁颗粒衍射图谱，具体的操作步骤如下1)采用 R-AXIS SPIDER 衍射仪，靶面为 Mo 和 Cu，λ = 1. 79025 X l(Tlclm，入射狭缝 1°，接受狭缝为0.6°，防散射狭缝1°，管压为32. 5kV，管流30mA;2)将纳米磁颗粒取适量装到特制玻璃样品板上，压实后放入衍射仪中；3)启动衍射仪，开始自动扫描记录样品衍射图谱，结果如图4所示。由图1所示，制备的水溶性羧基纳米磁颗粒直径约150nm，分散性良好；由图2磁滞回线显示，样品的矫顽力较�。胖筒幻飨裕硐殖隽己玫某炒判裕挥赏�3X射线衍射分析所示，样品以I^e3O4为主，衍射峰比较尖锐，说明颗粒结晶性能良好；由图4傅里叶变换红外光谱检测所示，PAA的FIlR中HlOcnT1处显示出特征吸收峰，表明PAA已成功修饰于纳米磁颗粒表面。综合上述检测结果显示，制备的水溶性羧基纳米磁颗粒性能良好，满足目的需要。实施例2抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白多克隆抗体的制备1、根据 CrylAb/CrylAc 杀虫蛋白(SEQ ID NO. 1)和基因(SEQ ID N0. 2)的一致序列，采用全基因合成技术构建CrylAb/CrylAc杀虫蛋白基因，共660对碱基，克隆至融合表达载体pGEX-4T-2 (插入位点BamH I和Ml I)并转化大肠杆菌BL21 (DE3)细胞中，通过细菌体外表达、Glutathione Sepharose 4B亲合层析和融合蛋白凝血酶在柱切割等操作步骤，得到CrylAb/CrylAc杀虫蛋白；2、将CrylAb/CrylAc杀虫蛋白5ml (浓度1. lmg/ml)与弗氏佐剂5ml混合后，充分乳化。采用背部多点注射法免疫BALB/c小鼠。每次免疫的抗原量约10 μ g，免疫三次。每次免疫两周后经尾动脉取血检测抗体效价。收集抗体效价在1 51200以上的血清进行后续操作。3、以4μ g/ml浓度的抗原(CrylAb/CrylAc杀虫蛋白)包被酶标板，100 μ 1/孔， 4°C过夜；4、洗涤后，加入待检的血清样品，100 μ 1/孔，37°C 1小时；设阴性对照孔；5、洗涤后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG的抗体试剂，100 μ 1/孔，37°C避光显色15 分钟；用2M H2SO4终止反应后，阅读各孔的A490值。对制备的CrylAb/CrylAc杀虫蛋白抗体做^festern Blotting分析，结果如图5所示。由图5可见，CrylAb/CrylAc杀虫蛋白抗体检测目标蛋白分子大小正确，印迹清晰，对于不同浓度的目标蛋白检测效果良好。经ELISA法检测，抗体能与CrylAb/CrylAc蛋白特异性结合，其相关系数达到显著水平，效价> 1 6000，结果如图6所示。实施例3免疫纳米磁颗粒的制备1、用30mM、pH = 5的MES缓冲液在外加磁场作用下清洗实施例1制备的水溶性羧基纳米磁颗粒，使水溶性羧基纳米磁颗粒分散于MES缓冲液中，终浓度为40mg/ml ；
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2、取水溶性羧基纳米磁颗粒悬浮液100 μ 1，依次加入EDC(50mM)、NHS(50mM)溶液各50 μ 1，室温震荡30min ；3、在磁场作用下弃上清，用MES溶液清洗3次；4、取实施例2制备的抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的多克隆抗体(1. 09mg/ ml) 100 μ 1，加入已活化的水溶性羧基纳米磁颗粒，室温震荡30min ；5、磁性分离，收集上清，用0. 02M磷酸缓冲液多次洗涤，得到免疫纳米磁颗粒。实施例4用本发明所述的制备方法制备完成的用于检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒，利用化学发光EIA进行检测，具体的操作步骤如下1、以5 μ g/ml的抗原(CrylAb/CrylAc杀虫蛋白)包被96孔酶标板，100 μ 1/孔， 4°C过夜；2、洗涤后，加入实施例3制备的免疫纳米磁颗粒样品，100 μ 1/孔，37°C 1小时；设阴性对照孔；3、洗涤后，加入ALP(碱性磷酸酶)标记的羊抗鼠IgG抗体(美国ftOgteintech 公司),100 μ 1/ 孔，37 0C 20 分钟；4、加入化学发光底物AMPPD(3-(2-螺旋金刚烷)_4_甲氧基_4_(3_磷氧酰)_苯基-1，2-二氧环乙烷)100 μ 1，放置30分钟，用0.2Μ NaOH终止反应后，阅读各孔的Α470值。通过化学发光EIA检测，CrylAb/CrylAc抗体蛋白包裹的纳米磁颗粒其发光单位为67. 5kCOimts/y g磁颗粒；发光强度和CrylAb/CrylAc蛋白浓度相关性表明，随着蛋白浓度的不断增加，发光强度不断下降，范围在l-103ng/ml ；最大检测到的蛋白浓度是IOOOng/ ml，最小检测浓度是lng/ml，结果如图7所示。由此可见，本发明所制备的用于检测CrylAb/ CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒灵敏度较高，易于磁富集，操作简单、重复性强，显示了良好的应用前景。
权利要求
1.一种检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒，其特征在于，该免疫纳米磁颗粒由抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白多克隆抗体包被，磁颗粒大小150 200nm，具体通过如下步骤制备(1)将0.85 1. 5g无水!^eCl3和0. 6 1. 2g FeCl2 ·4Η20溶解于IOOml超纯水中，加热搅拌至完全溶解；(2)在温度80-85°C时，加入15 20ml2 5M NaOH溶液于步骤(1)所得混合液中， 反应2 5min，加入15 20ml 0. 05 1. OM的PAA溶液，继续加热搅拌30min，得到水溶性羧基纳米磁颗粒；(3)将所述的水溶性羧基纳米磁颗粒在外加磁场作用下用无水乙醇洗涤3 5次，以超纯水分散保存；(4)将鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白抗体，通过羧基-氨基化学偶联法偶联所述的水溶性羧基纳米磁颗粒，得到检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒。
2.根据权利要求1所述的检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒，其特征在于步骤O)中所述的PAA溶液是分子量为1800 2000的短链聚丙烯酸溶液；步骤(3)中所述的外加磁场为恒流电磁�。鸥杏η慷任�30mT。
3.根据权利要求1所述的检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒，其特征在于步骤(4)中所述的羧基-氨基化学偶联法是采用碳化二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺活化法偶联抗体首先用30mM、pH = 5的2_(N_吗啉)-乙烷磺酸缓冲液在外加磁场作用下清洗所述的水溶性羧基纳米磁颗粒，使所述的水溶性羧基纳米磁颗粒分散于2-(N-吗啉)-乙烷磺酸缓冲液中，终浓度为40 60mg/ml ；取所述的含水溶性羧基纳米磁颗粒的2_(N_吗啉)-乙烷磺酸缓冲液100 μ 1，依次加入50mM碳化二亚胺、50mM N-羟基丁二酰亚胺溶液各 50 100 μ 1，室温震荡30 40min，在磁场作用下弃上清，用2-(N-吗啉)-乙烷磺酸溶液清洗3次，得已活化的纳米磁颗粒；取1.09mg/ml所述的鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白多克隆抗体100 200 μ 1，加入所述的已活化的纳米磁颗粒，室温震荡30 40min，磁性分离， 收集收集上清，用0. 02M、pH = 7. 4磷酸缓冲液多次洗涤，得到所述的检测CrylAb/CrylAc 杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒。
4.根据权利要求1所述的检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒，其特征在于步骤(4)所述的鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白抗体为鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白多克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒，其特征在于所述的鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白多克隆抗体是将CrylAb/CrylAc杀虫蛋白与弗氏佐剂混合后免疫小鼠，经分离纯化得到鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白多克隆抗体。
6.一种权利要求1所述的检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒的制备方法，其特征在于，该方法包含如下步骤(1)将0.85 1. 5g无水!^eCl3和0. 6 1. 2g FeCl2 ·4Η20溶解于IOOml超纯水中，加热搅拌至完全溶解；(2)在温度80-85°C时，加入15 20ml2 5M NaOH溶液于步骤(1)所得混合液中， 反应2 5min，加入15 20ml 0. 05 1. OM的PAA溶液，继续加热搅拌30min，得到水溶性羧基纳米磁颗粒；(3)将所述的水溶性羧基纳米磁颗粒在外加磁场作用下用无水乙醇洗涤3 5次，以超纯水分散保存；(4)将所述的鼠抗CrylAb/CryIAc杀虫蛋白抗体，通过羧基-氨基化学偶联法偶联所述的水溶性羧基纳米磁颗粒，得到检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒。
7.按权利要求5所述的检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒的制备方法， 其特征还在于，所述步骤( 中的PAA溶液是分子量为1800 2000的短链聚丙烯酸溶液； 所述步骤(3)中的外加磁场为恒流电磁�。鸥杏η慷任�30mT。
8.按权利要求6所述的检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒的制备方法， 其特征还在于步骤(4)中所述的羧基-氨基化学偶联法是采用碳化二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺活化法偶联抗体首先用30mM、pH = 5的2-(N-吗啉)_乙烷磺酸缓冲液在外加磁场作用下清洗所述的水溶性羧基纳米磁颗粒，使所述的水溶性羧基纳米磁颗粒分散于2-(N-吗啉)-乙烷磺酸缓冲液中，终浓度为40 60mg/ml ；取所述的含水溶性羧基纳米磁颗粒的 2-(N-吗啉)-乙烷磺酸缓冲液100 μ 1，依次加入50mM碳化二亚胺、50mM N-羟基丁二酰亚胺溶液各50 100 μ 1，室温震荡30 40min，在磁场作用下弃上清，用2-(N-吗啉)-乙烷磺酸溶液清洗3次，得已活化的纳米磁颗粒；取1.09mg/ml所述的鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白多克隆抗体100 200 μ 1，加入所述的已活化的纳米磁颗粒，室温震荡30 40min，磁性分离，收集收集上清，用0. 02M、pH = 7. 4磷酸缓冲液多次洗涤，得到所述的检测CrylAb/ CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒。
9.根据权利要求6所述的检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒，其特征在于步骤(4)所述的鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白抗体为鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白多克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的检测CrylAb/CrylAc杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒，其特征在于所述的鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白多克隆抗体是将CrylAb/CrylAc杀虫蛋白与弗氏佐剂混合后免疫小鼠，经分离纯化得到鼠抗CrylAb/CrylAc杀虫蛋白多克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种检测Cry1Ab/Cry1Ac杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒及其制备方法。本发明检测Cry1Ab/Cry1Ac杀虫蛋白的免疫纳米磁颗粒，由抗Cry1Ab/Cry1Ac杀虫蛋白多克隆抗体包被，磁颗粒大小150～200nm。该免疫纳米磁颗粒是通过改进的化学沉淀法制备具有高度水溶性的羧基纳米磁颗粒，再将抗Cry1Ab/Cry1Ac杀虫蛋白抗体通过化学偶联法偶联活化后的纳米磁颗粒而得到。使用该免疫纳米磁颗粒通过化学发光EIA法检测Cry1Ab/Cry1Ac杀虫蛋白样品，灵敏度较高，最大检测到的蛋白浓度是1000ng/ml，最小检测浓度是1ng/ml；而且易于磁富集而排除杂质分子干扰。
文档编号G01N33/531GK102175876SQ20111003624
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月11日 优先权日2011年2月11日
发明者潘卫东, 陈法军 申请人:南京农业大学
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