专利名称：一种检测新霉素残留的胶体金试纸条及其使用方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种检测新霉素残留的胶体金试纸条及其使用方法和应用。
背景技术：
新霉素(Neomycin，ΝΕΟ)是属于氨基糖苷类药物中的一种碱性抗生素。新霉素对第珊对脑神经具有损害作用，会造成不可逆性耳聋，并且有较强的肾脏毒性，亦可引起机体对维生素A及B12吸收不良，导致维生素的缺乏而引起相关病症。新霉素在兽医临床和畜禽养殖上仍被广泛应用，尤其是不规范用药引起畜产品中的新霉素药物的残留，会对食品卫生、公共健康产生严重威胁。因此各国对动物性产品中新霉素的残留制定了严格的限量标准。 动物组织中新霉素残留的检测方法有微生物法，高效液相色谱法，薄层层析法，电泳法和酶联免疫分析法、免疫层析方法等。在动物性组织基于抗原抗体特异性反应建立起来的免疫层析方法具有样品预处理简单，分析时间短，使用方便等特点，在大规模筛选检测中有广阔的应用前景。目前，尚未见有新霉素免疫层析试纸条的文献和专利报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测新霉素残留的胶体金试纸条及其使用方法和应用。本发明是基于一种能同时识别新霉素、阿米卡星和巴龙霉素的单克隆抗体(该单克隆抗体是由杂交瘤细胞EDC/5G04分泌的，杂交瘤细胞EDC/5G04由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC N0:C201144)，通过制备胶体金，标记纯化后的抗体，优化各项层析条件等，制备了胶体金试纸条。针对新霉素具有溶于水，微溶或不溶于常见有机溶剂的特点，采用碱性缓冲液作为提取试剂，加热使蛋白质变性以减少基质的干扰等手段，建立了组织样品中新霉素的提取方法，进而完成本发明。上述目的是通过以下技术方案实现的一种胶体金试纸条，包括吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次粘贴在塑料衬板上，其特征在于所述金标垫包被有胶体金标记的能识别新霉素、阿米卡星和巴龙霉素的单克隆抗体，所述检测线包被有新霉素包被原，所述质控线包被有羊或兔抗鼠IgG。所述的能识别新霉素、阿米卡星和巴龙霉素的单克隆抗体是由杂交瘤细胞EDC/5G04所分泌的，所述杂交瘤细胞EDC/5G04于2011年6月29日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC N0:C201144。所述的新霉素包被原是由新霉素(NEO)与卵清蛋白(OVA)形成的偶联物(NEO-OVA)0所述的胶体金试纸条的使用方法，包括用样品提取液对组织样品前处理和用胶体金试纸条进行检测的步骤，所述样品提取液为PHlO 11的磷酸盐缓冲液，其配制方法为准确称取 KH2PO4 O. 40g, NaCl 20. 00g, Na2HPO4 · Iffi2O 13. 40g, KCl O. 50，NaOH O. 32g,少量超纯水溶解，定容至500mL，所述前处理的方法为称取组织匀浆样品lg，加入IOml样品提取液，涡旋混匀，60°C孵育30分钟，冷却至室温并摇匀，以4000转/分钟的转速，室温离心10分钟，取上清液。所述组织样品为牛奶、鸡肉，猪肉、虾肉、牛肉、羊肉、猪肝中的一种或多种。所述的胶体金试纸条在新霉素残留检测中的应用。具体步骤如下(I)复苏杂交瘤细胞EDC/5G04，免疫小鼠，制备单克隆抗体，并利用辛酸硫酸铵进行纯化。
(2)利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，优化标记条件，制备胶体金标记的能识别新霉素、阿米卡星和巴龙霉素的单克隆抗体；(3)将包被原NEO-OVA和羊或兔抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上；(4)将待测样品用缓冲液提�。檬灾教跫觳�。检测时，若样品中有新霉素，则新霉素先和胶体金标记的单克隆抗体结合，到达检测线时，已结合了新霉素的胶体金标记的单克隆抗体就不会与包被在硝酸纤维素膜上的包被原(NEO-OVA)发生结合，就不会在检测线处形成肉眼可见的红色沉淀线，胶体金标记的抗体继续向前泳动，富集在质控线上，形成红色沉淀线，判为阳性结果。若样品中不含有新霉素，检测时，胶体金标记的单克隆抗体就会与包被在硝酸纤维素膜上的包被原(NEO-OVA)发生结合，在检测线处形成肉眼可见的红色沉淀线，未反应完的胶体金标记的抗体继续向前泳动，富集在质控线上，形成红色沉淀线，判为阴性结果。本发明的有益效果本发明胶体金试纸条能快速检测包括动物肌肉和肝脏，以及牛奶等样品中的新霉素，最低检测限为500 μ g/L，，特异性高，准确性好。本发明涉及的组织样品处理方法简单，易操作，样品处理所用的主要试剂为碱性条件的磷酸盐缓冲液，样品处理完全没有涉及有机试剂，对操作者身体健康和环境的�：闲�。
图I是本发明的技术路线图。图2是本发明胶体金试纸条的结构示意图，图中1 一吸收垫；2 —硝酸纤维素膜；3 一金标垫；4 一样品垫；5 —检测线；6 —质控线；7 —塑料衬板。图3是本发明胶体金试纸条的显色示意图，图中a —阴性、b —阳性、c 一无效，其中T为检测线，C为质控线。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。实施例I胶体金试纸条的制备I. I单克隆抗体的制备及纯化I. I. I腹水的制备在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射O. 5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用RPMI 1640基础培养基悬浮由保藏号为CCTCC N0:C201144的杂交瘤细胞EDC/5G04扩大培养的细胞，并将细胞数调至I X IO6个/mL，每只小鼠腹腔接种O. 5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神变差，濒死不动时采集腹水。I. I. 2单克隆抗体的纯化参照朱立平等《免疫学常用实验方法》人民军医出版社2000版中的方法取所得的小鼠腹水5ml与适量的二氧化硅混合，加入等体积的巴比妥缓冲液，室温振荡Ih后，室温静置30min，取上清于洁净离心管中，4°C，3000r/m离心IOmin ；取上清液8ml，加入16ml O. 06mol醋酸钠缓冲液，用HCL调pH值至4. 5，充分搅拌下缓缓加入辛酸132μ1后，室温搅拌30min，然后转入4°C冰箱充分沉淀2h，4°C，15000 r/m离心30min，得上清液22ml，加入2. 2ml O. IM的磷酸缓冲液，用NaOH调pH值至7. 6，搅拌下缓缓加入硫酸铵至终浓度为O. 277g/ml，4°C冰箱充分沉淀2h后，4°C，12000r/m离心30min，弃上清，沉淀用5ml O. IM的磷酸缓冲液重悬，装入透析袋，对5000ml O. OlM pH7. 2磷酸盐缓冲液(PBS)充分透析后，再对2000ml蒸馏水透析，最后对3000ml三蒸去离子水透析，将充分透析好的蛋白溶液用聚乙二醇一 20000 (PEG - 20000)浓缩至3ml，然后4°C，12000r/m离心30min，弃沉淀，收集上清液，测得蛋白浓度为3. 3mg/ml。经SDS-PAGE电泳鉴定为纯化的单克隆抗体，纯度为98%。该单克隆抗体可用于制备检测新霉素残留的试剂。 I. 2胶体金、胶体金标记的单克隆抗体的制备I. 2. I溶液的配制(I)氯金酸的配制用双蒸去离子水溶解氯金酸，配成1%溶液，置4°C备用，有效期四个月。IOOOml 1%氯金酸溶液配方IOg氯金酸；双蒸去离子水定容至1000ml。(2)柠檬酸三钠的配制用双蒸去离子水溶解柠檬酸三钠，配成1%溶液，O. 22ΜΠ1膜滤过，置4°C备用,有效期四个月，双蒸去离子水定容至1000ml。(3) O. IM碳酸钾的配制用双蒸去离子水配制，O. 22ΜΠ1膜滤过，置4°C备用，有效期四个月。IOOOml O. IM碳酸钾溶液配方13. 8g碳酸钾；双蒸去离子水定容至1000ml。(4) 2% PEG-20000的配制用双蒸去离子水配制，O. 22Mm膜滤过，置4°C备用，有效期四个月。1000ml2% PEG-20000溶液配方20g PEG-20000 ;双蒸去离子水定容至1000ml。(5)标记洗涤保存液的配制2%牛血清白蛋白(BSA)，0. 05%叠氮钠(NaN3)，O. OlMpH 7.2 PBS溶液，0.22Mm膜滤过，置4°C备用，有效期四个月。1000 ml标记洗涤保存液配方20g BSA, O. 5g NaN3, O. OlM pH 7. 2 PBS 溶液定容至 1000ml。I. 2. 2胶体金的制备用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成O. 01%，置电炉煮沸，按每IOOml O. 01%氯金酸加入2ml 1%柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期一周。I. 2. 3胶体金标记的单克隆抗体的制备将20ml胶体金加入50ml小烧杯中，用电磁搅拌器250rpm搅拌,加入O. IM的K2CO3调节至最佳pH处。缓慢逐滴加入杂交瘤细胞EDC/5G04所分泌的单克隆抗体，搅拌反应30min。加入10%的BSA溶液，使BSA终浓度达到1%，持续搅拌lOmin。4°C条件下静置lh。将标记好的单克隆抗体复合物以10000r/min,4°C离心30min,弃去上清；沉淀用含1%BSA的IOmM磷酸盐缓冲液(PB，pH值约为7. O)缓冲液重悬于原体积，重复离心两次；沉淀用配好的含1%BSA的IOmM的PB (含O. 02%NaN3)缓冲液重悬于原体积1/10中，4°C保存备用。I. 3金标垫3的制备
封闭液的配制2% BSA, O. 1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton Χ_100)、0· 05%NaN3, O. OlM pH 7.2 PBS溶液，O. 22Mm微孔滤膜滤过，置4°C备用，有效期四个月。IOOOml封闭液配方20g BSA, O. 5g NaN3iIml Triton X_100、0. OlM pH7. 2PBS 溶液定容至 1000ml。金标垫3的制备将金标垫3浸泡于封闭液中30min后，于37°C烘干。然后将制备好的胶体金标记单克隆抗体均匀的铺在金标垫上，每毫升溶液铺20平方厘米，冷冻干燥，封装，置4°C备用。I. 4试纸条样品垫4的制备封闭液的配制2%BSA, O. 1% Triton Χ_100、0· 05% NaN3, O. OlM pH 7.2 PBS 溶液，O. 22Mm微孔滤膜滤过，置4°C备用，有效期四个月。IOOOml封闭液配方20g BSA,O. 5gNaN3'Iml Triton X_100、0. OlM ρΗ7· 2PBS 溶液定容至 1000ml。样品垫4的制备将样品垫4浸泡于封闭液中30min后，于37°C烘干，封装，置4°C备用。·I. 5试纸条的组装将吸收垫I、硝酸纤维素膜2、金标垫3、样品垫4按图2所示依次层叠粘贴在塑料衬板7上，切成3mm宽的小条。每十小条一包，加入干燥剂，真空封装。4 8°C保存，有效期一年；常温保存，有效期6个月。实施例2胶体金试纸条的使用方法和应用2. I胶体金试纸条检测方法的优化当包被浓度为O. 005mg/ml时，阴性空白检测线显色不明显，说明包被原浓度太低，拦截胶体金标记抗体量太少，需要增加包被原的浓度，当包被浓度为大于O. 01mg/ml时，检测灵敏度达不到要求，当包被浓度为0. 01mg/ml时，阴性空白显色清晰，并且能够检测出50 μ g/L的标准品,最终确定新霉素包被原的包被浓度为0. Olmg/mlo确定包被原浓度后，包被不同浓度的羊或兔抗鼠IgG，使质控线显色情况与检测线显色情况基本一致，羊或兔抗鼠IgG浓度为0. 2mg/ml时,质控线显色较浅,0. lmg/ml时,相比较检测线显色情况，质控线显色仅隐约可见，当羊或兔抗鼠IgG浓度为0. 3mg/ml时，质控线与检测线显色基本一致，并且显色清晰，所以最终选择了 0. 3mg/ml作为胶体金试纸条羊或兔抗鼠IgG包被的浓度。2.2样品前处理方法2. 2. I试剂的配制新霉素样品提取液(0. IM磷酸盐缓冲液，pHIO 11):准确称取KH2PO4 0. 40g，NaCl20. 00g, Na2HPO4 · Iffi2O 13. 40g, KCl O. 50，NaOH 0. 32g 少量超纯水溶解，定容至 500mL。2. 2. 2组织样品前处理称取肌肉匀浆样品I. 00±0· Olg于50ml离心管中，加入IOml 0. IM的PBS(pH10 11)缓冲液中，充分涡旋混匀，60 V孵育30min，冷却至室温并摇匀，4000r/min,室温离心lOmin，取上清液检测。2. 3胶体金试纸条检测步骤每次使用试纸条检测时均需要设置对照用移液器或者滴管滴加100 μ L水或者阴性的样品于样品口中。样品检测方法将待测样品处理后，取IOOyL加入加样孔中，通过样品检测试纸条和对照试纸条检测线的显色情况比较来判断待测样品的阴阳性。阴阳性判断标准如样品检测试纸条和对照的检测试纸条颜色深浅一致或者略浅，结果判断为阴性；如果样品检测试纸条检测线没有出现或者检测线明显浅于对照试纸条检测线，结果判断为阳性。2. 4胶体金试纸条性能参数的确定2. 4. I 检测限 在经检测不含氨基糖苷类药物的鸡肌肉组织添加新霉素浓度为0μ g/L、100y g/L、200 μ g/L、300 μ g/L、400 μ g/L、500 μ g/L、600 μ g/L 和 1000 μ g/L，样品处理后，用试纸条检测，检测结果表明当浓度等于或大于500μ g/kg时，检测线完全不显色，结果显示为阳性，当浓度低于500 μ g/kg时结果为阴性。所以该试纸条检测鸡肉组织的检测限为500 μ g/L02. 4. 2 特异性检测氨基糖苷类药物(庆大霉素、阿米卡星、巴龙霉素、卡那霉素、链霉素、妥布霉素)和其他药物(莱克多巴胺、沙丁胺醇、泰乐菌素和氯霉素)的标准品，用PBS配成不同浓度，分别为50μ g/L、500y g/L，并设置阴性对照，用试纸条进行检测，设置三次重复，观察显色结果。结果显示，当药物浓度大于50 μ g/L时,试纸条对新霉素、阿米卡星，巴龙霉药物检测结果为阳性，当药物浓度为500 μ g/L时，试纸条检测氨基糖苷类其他药物，庆大霉素、卡那霉素、链霉素、妥布霉素和其他药物，如莱克多巴胺、沙丁胺醇、泰乐菌素和氯霉素，检测结果均为阴性，结果表明，该试纸条具有较好的特异性。2. 4. 3假阴性率与假阳性率测定在鸡、猪肌肉组织添中加新霉素药物，浓度为O μ g/L、250 μ g/L、500 μ g/L和1000 μ g/L各25份，分别用试纸进行检测。用O μ g/L及250 μ g/L浓度的添加样品计算假阳性率，假阳性率=假阳性样品数Λ00Χ 100% ;用500 μ g/L浓度的添加样品计算假阴性率，假阴性率=假阴性样品数Λ00Χ 100%。试纸条检测结果如下(表I)所示，其中50份空白对照样品和添加新霉素药物浓度为250 μ g/kg检测结果全部为阴性，药物浓度500 μ g/kg、1000 μ g/kg，检测结果全部为阳性，试纸条阳性符合率为100% (100/100)，阴性符合率为100%(100/100)，说明试纸条的准
确性比较高。表I胶体金试纸条的假阴性率与假阳性率测定结果
新霉素O μ g/kg 250 μ g/kg 500 μ g/kg 1000 μ g/kg
鸡肉样品数~25252525
猪肉样品数~25252525
￥1全部阴性全部阴性全部阳性全部阳性~
权利要求
1.一种胶体金试纸条，包括吸收垫(I)、硝酸纤维素膜(2)、金标垫(3)、样品垫(4)，所述硝酸纤维素膜(2)上设有检测线(5)和质控线(6)，所述吸收垫(I)、硝酸纤维素膜(2)、金标垫(3)、样品垫(4)依次粘贴在塑料衬板(7)上，其特征在于所述金标垫(3)包被有胶体金标记的能识别新霉素、阿米卡星和巴龙霉素的单克隆抗体，所述检测线(4)包被有新霉素包被原，所述质控线(5)包被有羊或兔抗鼠IgG。
2.如权利要求I所述的胶体金试纸条，其特征在于所述的能识别新霉素、阿米卡星和巴龙霉素的单克隆抗体是由保藏号为CCTCC N0:C201144杂交瘤细胞EDC/5G04所分泌的。
3.如权利要求I所述的胶体金试纸条，其特征在于所述的新霉素包被原是由新霉素与卵清蛋白形成的偶联物。
4.如权利要求I一 3任何一项所述的胶体金试纸条的使用方法，其特征在于包括用样品提取液对组织样品前处理和用胶体金试纸条进行检测的步骤，所述样品提取液为pHIO 11的磷酸盐缓冲液，其配制方法为准确称取KH2PO4 O. 40g, NaCl 20. OOg,Na2HPO4 · 12H20 13. 40g, KCl O. 50，NaOH O. 32g，少量超纯水溶解，定容至 500mL，所述前处理的方法为称取组织匀浆样品lg，加入IOml样品提取液，涡旋混匀，60°C孵育30分钟，冷却至室温并摇匀，以4000转/分钟的转速，室温离心10分钟，取上清液。
5.如权利要求4所述的胶体金试纸条的使用方法，其特征在于所述组织样品为牛奶、鸡肉，猪肉、虾肉、牛肉、羊肉、猪肝中的一种或多种。
6.权利要求I一 3任何一项所述的胶体金试纸条在新霉素残留检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种胶体金试纸条，该试纸条由吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次层叠粘贴在塑料衬板上构成，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述金标垫包被有胶体金标记的能识别新霉素、阿米卡星和巴龙霉素的单克隆抗体，所述检测线包被有新霉素包被原，所述质控线包被有羊或兔抗鼠IgG。本发明还公开了一种胶体金试纸条的使用方法及其在新霉素残留检测中的应用。本发明可用于对牛奶、鸡肉，猪肉、虾肉、牛肉、羊肉、猪肝等组织样品进行新霉素残留快速检测，最低检测限为500μg/L，特异性高，准确性好。
文档编号G01N33/577GK102778563SQ20121017642
公开日2012年11月14日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者刘振利, 彭大鹏, 彭庆娟, 王玉莲, 袁宗辉, 陈冬梅, 陶燕飞 申请人:华中农业大学
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