专利名称：一种汞离子的等离子手性适配体传感器的制备方法
技术领域：
一种汞离子的等离子手性适配体传感器的制备方法，属于分析化学技术领域和食品安全技术领域。
背景技术：
纳米材料是指三维空间尺度至少有一维处于纳米量级的材料。纳米材料是介于原子簇和宏观材料之间的新一代材料。由于纳米材料的尺寸已经接近电子的德布罗意波长、超导相干波长以及激子的波尔半径，电子被局限于一个体积十分微小的空间，电子波函数受到限制,加上其具有大表面的特殊效应,从而具有量子尺寸效应、表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等，因此纳米材料显示出与常规体相材料不同的新奇的光学、电学、磁学及化学方面的性质。纳米材料的组装将会在单个纳米材料性质的基础上出现新的光学、电学、磁学和催化性质，在许多领域(如传感器、催化剂、磁化材料和光学材料等)有着潜在 的应用价值，因此，纳米粒子组装体系的研究变得日益活跃。众所周知，圆二色性是指当平面偏振光通过具有旋光活性的介质时，由于介质中同一种旋光活性分子存在手性不同的两种构型，因此它们对平面偏振光所分解成的右旋和左旋圆偏振光吸收不同，而吸收系数的差值即定义为圆二色性。圆二色光谱仪通过测量生物大分子的圆二色光谱从而得到生物大分子的二级结构，是简便和快捷的获得生物大分子结构的手段之一。因此，其可用于蛋白质折叠、蛋白质构象研究，DNA/RNA反应，酶动力学，光学活性物质纯度测量，药物定量分析。近年来,手性纳米材料成为人们关注的研究热点问题,特别是自从2009年成功构建等离子纳米粒子手性四面体以来，此种手性组装体促使科学界和工业界对于等离子纳米材料构成手性离散组装体给予极大的关注。等离子手性组装体的手性信号不同于生物分子的手性信号，其不仅仅在紫外区域(传统的生物分子在该区域有且仅有圆二色谱信号)具有较强的信号，其还在可见光区域产生了极强的手性信号。通过研究发现，该组装体在可见光区域的信号的强度和等离子纳米材料的组装结构的产率息息相关并且其可见光区域的信号要强于紫外区域的信号，通过上述描述可以充分说明等离子组装体可以成功应用于生物传感检测领域。利用核酸适配体进行等离子纳米材料组装产生可见光区域的圆二色谱信号进而用于重金属离子的检测这一领域尚属空白。本发明利用碱基胸腺嘧啶(T)可以和汞离子进行特异性的结合形成T-Hg2+-T结构，使得金纳米棒分别偶联含有多重胸腺嘧啶碱基(其余序列完全互补)的单链DNA形成等离子适配体探针形成具有手性信号的金纳米棒侧面组装体，由于加入的Hg2+的浓度不同使得金纳米棒形成的侧面组装体中所含棒的个数不同，进而导致金纳米棒侧面组装体的摩尔椭圆度的数值不同(即随着Hg2+浓度的增加，金纳米棒侧面组装体中含有的金纳米棒的个数增加，组装体的摩尔椭圆度越大)，建立摩尔椭圆度和汞离子浓度的线性关系，构建简单、灵敏和高特异性的等离子手性适配体传感器。
发明内容
本发明的目的是提供一种汞离子的等离子手性适配体传感器的制备方法，构建了利用圆二色谱信号检测的简单、灵敏和高特异性的新型等离子手性适配体传感器。本发明的技术方案一种汞离子的等离子手性适配体传感器的制备方法，本发明的主要实施步骤为(I)金纳米棒的合成；(2)金纳米棒表面定向核酸功能化；(3)利用定向核酸功能化的金纳米棒构建等离子手性适配体传感器；(4)等离子手性适配体传感器的表征；(5)等离子手性适配体传感器的特异性测定；(6)等离子手性适配体传感器的实际样本测定。具体步骤为
(I)金纳米棒的合成
按照专利《一种具有表面增强拉曼活性的自组装材料的制备方法》(专利号ZL 201010605799. 9)的方法合成长径比约为3. O的金纳米棒。简单的步骤如下
①晶种合成28°C下取O. I mL的预先配置的2 g/L的三水合四氯金酸加入到I mL的0.2 M的十六烷基三甲基溴化铵溶液中，此时，溶液颜色由无色变成黄褐色。然后向上述混合体系中加入O. 12 mL的新配制的O. 01 M硼氢化钠溶液快速搅拌2分钟。溶液颜色即由黄褐色变为浅棕色。将上述合成的晶种放入28°C的水浴锅中静置反应30分钟，使未完全参与晶种合成的硼氢化钠消耗殆�。�(一是硼氢化钠进一步还原体系中未完全反应的金离子而被消耗，二是在静置反应过程中硼氢化钠由于水解导致其含量进一步降低)，制备的晶种要在合成后4小时内进行下一步反应。②金纳米棒生长过程晶种合成完成以后，进行金纳米棒的生长。5 mL的2 g/L的三水合四氯金酸加入到5 mL 0.2 M的十六烷基三甲基溴化铵中后加入4 mL的超纯水，混匀。0.125 mL的0.01 M硝酸银溶液加入到上述混合体系中，混匀，随后将65 μ 的0.1M抗坏血酸溶液加入上述体系溶液，28°C下剧烈搅拌反应2分钟，溶液由褐色变成无色。最后,加入O. 05 mL的晶种溶液轻柔搅拌混匀20秒。28°C反应2小时后溶液的颜色为土褐色。合成的金纳米棒溶液经过10000转每分钟离心10分钟，弃上清，采用O. 005 M的十六烷基三甲基溴化铵溶液将沉淀进行重分散，清洗一次，最终将金纳米棒溶液分散在与初始等体积的溶液中，室温静置保存，以便进行下一步的表征及实验需求。(2)金纳米棒表面定向核酸功能化
①金纳米棒端面封闭取上述制备好的10 nM的金纳米棒1000 μ ，加入5 PL的I mM的巯基修饰的聚乙二醇溶液(分子量为5000)振摇反应8小时，7500转每分钟离心15分钟，弃上清，水洗一次，用1000 PL的水分散金纳米棒-聚乙二醇复合物，4°C保藏、待用。②金纳米棒侧面定向修饰APTa :取上述处理过的金纳米棒-聚乙二醇溶液500μ 加入10 μ 的100 μΜ的巯基修饰的APTa，混匀，室温振摇反应12小时，7500转每分钟离心15分钟，弃上清，用500 PL的5 mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液分散金纳米棒-聚乙二醇-APTa复合物，5 mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液洗一次，再次用500 μ 的5 mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液分散金纳米棒-聚乙二醇-APTa复合物，4°C保藏、待用。③金纳米棒侧面定向修饰APTb :取上述处理过的金纳米棒-聚乙二醇溶液500 μ 加入10 μ 的100 μΜ的巯基修饰的APTb，混匀，室温振摇反应12小时，7500转每分钟离心15分钟，弃上清，用500 PL的5 mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液分散金纳米棒-聚乙二醇-APTb复合物，5 mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液洗一次，再次用500 μ 的5 mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液分散金纳米棒-聚乙二醇-APTb复合物，4°C保藏、待用。APTa :5’ -SH-AAAAAAGTGACCATTTTTGCAGTG- 3’，
APTb :5’ -SH-CACTGCTTTTTTGGTCACAAAAAA-3’。(3)利用定向核酸功能化的金纳米棒构建等离子手性适配体传感器
圆二色谱检测，绘制摩尔椭圆度 汞离子浓度标准曲线取50 μ L上述制备的APTa侧面定向修饰的金纳米棒和50 μ L上述制 备的APTb侧面定向修饰的金纳米棒进行混勻，轻柔振摇反应5分钟，加入50yL不同浓度的汞离子标准品，40 °C孵育I小时后，借助T-Hg2+-T特异性识别APTa和APTb分别修饰的金纳米棒形成金纳米棒侧面组装结构。由于加入的汞离子的标准品浓度的不同导致金纳米棒形成的链状结构的长度不同进而照成等离子手性传感器的手性信号产生差异。汞离子的标准品浓度分别为O ng/mL、0.05 ng/mL、O. I ng/mL、0. 5 ng/mL、l ng/mL>5 ng/mL、10ng/mL。利用圆二色谱仪器测定不同萊离子浓度下的组装结构的摩尔椭圆度，根据730nm波长下测定的不同浓度的摩尔椭圆度，绘制汞离子浓度的标准曲线。本传感器的线性范围为O. 05到10ng/mL，检测限为O. 03ng/mL，标准曲线的线性方程为Y=O. 5X-19. 75 (Y为不同浓度下730nm下的摩尔椭圆度，X为相应汞离子的浓度)，线性相关性为>0. 99。(4)等离子手性适配体传感器的表征
在汞离子不同浓度条件下，采用透射电镜(加速电压为200 keV)、X射线能谱仪、激光动态光散射仪等仪器对金纳米棒自组装构建的手性适配体传感器进行表征。通过上述表征手段可知该种手性适配体传感器成功构建。(5)等离子手性适配体传感器的特异性测定
按照利用定向核酸功能化的金纳米棒构建等离子手性适配体传感器步骤中对汞离子测定的相同步骤测定其它的实际样本中有可能存在的4种重金属离子(Cu2+、Cr6+、Fe2+和Zn2+),浓度均为10 ng/mL,通过测定上述4中其它的重金属离子的摩尔椭圆度,与10 ng/mL的Hg2+所照成的等离子手性适配体传感器的摩尔椭圆度比较可知，该种等离子手性适配体传感器针对汞离子检测特异性强。(6)等离子手性适配体传感器的实际样本测定
将自来水作为实际样本进行验证该种方法针对汞离子的添加回收率。预先向所用的自来水样品中添加O. I ng/mL、O. 5 ng/mL、l ng/mL和5 ng/mL的萊离子,采用等离子手性适配体传感器测定实际样本中的汞离子的添加回收率在94. 81-103. 10%之间，标准差为3. 5%，能够完全满足实际样品中对汞离子的检测需求。本发明的有益效果随着Hg2+浓度的增加，金纳米棒侧面组装体中含有的金纳米棒的个数增加，组装体的摩尔椭圆度越大，本发明建立了摩尔椭圆度和汞离子浓度的线性关系，构建简单、灵敏和高特异性的汞离子的等离子手性适配体传感器，用于检测汞离子的浓度。
图I金纳米棒偶联适配体探针APTa和APTb前后的紫外/可见光谱图
图2典型的不同汞离子浓度条件下等离子手性适配体传感器的透射电镜图，(a-g)汞离子的浓度分别为0、0· 05、0· 1、0· 5、1、5和10 ng/mL和(h) 5ng/mL浓度下的低倍透射电镜图。图3等离子手性适配体传感器的X射线能谱图
图4等离子手性适配体传感器在加入10ng/mL汞离子反应前(a)、后(b)的粒径分布图5等离子手性适配体传感器在不同汞离子浓度条件下的圆二色谱图，随着箭头指的方向，汞离子的浓度按照O、O. 05、O. 1、0. 5、1、5和10 ng/mL梯度逐渐增大。图6在733nm下，汞离子等离子手性适配体传感器的标准曲线 图7等离子手性适配体传感器的特异性结果。
具体实施例方式(I)金纳米棒的合成
按照专利《一种具有表面增强拉曼活性的自组装材料的制备方法》(专利号ZL201010605799. 9)的方法合成长径比约为3. O的金纳米棒。简单的步骤如下
①晶种合成28°C下取O. I mL的预先配置的2 g/L的三水合四氯金酸加入到I mL的
0.2 M的十六烷基三甲基溴化铵溶液中，此时，溶液颜色由无色变成黄褐色。然后向上述混合体系中加入O. 12 mL的新配制的O. 01 M硼氢化钠溶液快速搅拌2min。溶液颜色即由黄褐色变为浅棕色。将上述合成的晶种放入28°C的水浴锅中静置反应30 min，使未完全参与晶种合成的硼氢化钠消耗殆�。�(一是硼氢化钠进一步还原体系中未完全反应的金离子而被消耗，二是在静置反应过程中硼氢化钠由于水解导致其含量进一步降低)，制备的晶种要在合成后4h内进行下一步反应。②金纳米棒生长过程晶种合成完成以后，进行金纳米棒的生长。5 mL的2 g/L的三水合四氯金酸加入到5 mL 0.2 M的十六烷基三甲基溴化铵中后加入4 mL的超纯水，混匀。0.125 mL的0.01 M硝酸银溶液加入到上述混合体系中，混匀，随后将65 μ 的0.1M抗坏血酸溶液加入上述体系溶液，28°C下剧烈搅拌反应2 min，溶液由褐色变成无色。最后,加入O. 05 mL的晶种溶液轻柔搅拌混匀20s。28°C反应2 h后溶液的颜色为土褐色。合成的金纳米棒溶液经过10000转每分钟离心10 min，弃上清，采用O. 005 M的十六烷基三甲基溴化铵溶液将沉淀进行重分散，清洗一次，最终将金纳米棒溶液分散在与初始等体积的溶液中，室温静置保存，以便进行下一步的表征及实验需求。(2)金纳米棒表面定向核酸功能化
①金纳米棒端面封闭取上述制备好的10 nM的金纳米棒1000 μ ，加入5 PL的I mM的巯基修饰的聚乙二醇溶液(分子量为5000)振摇反应8h，7500 r/min离心15 min，弃上清，用1000 PL的水分散金纳米棒-聚乙二醇复合物，水洗一次，4°C保藏、待用。②金纳米棒侧面定向修饰APTa :取上述处理过的金纳米棒-聚乙二醇溶液500μ 加入10 μ 的100 μΜ的巯基修饰的APTa，混匀，室温振摇反应12h，7500 r/min离心15min，弃上清，用500 μ 的5 mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液分散金纳米棒-聚乙二醇-APTa复合物，5 mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液洗一次，再次用500 μ 的5 mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液分散金纳米棒-聚乙二醇-APTa复合物，4°C保藏、待用。③金纳米棒侧面定向修饰APTb :取上述处理过的金纳米棒-聚乙二醇溶液500 μ 加入10 μ 的100 μΜ的巯基修饰的APTb，混匀，室温振摇反应12h，7500 r/min离心15分钟，弃上清，用500 PL的5 mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液分散金纳米棒-聚乙二醇-APTb复合物，5 mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液洗一次，再次用500 PL的5 mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液分散金纳米棒-聚乙二醇-APTb复合物，4°C保藏、待用。APTa :5’ -SH-AAAAAAGTGACCATTTTTGCAGTG- 3’，
APTb :5’ -SH-CACTGCTTTTTTGGTCACAAAAAA-3’。(3)利用定向核酸功能化的金纳米棒构建等离子手性适配体传感器
圆二色谱检测，绘制摩尔椭圆度 汞离子浓度标准曲线取50 μ L上述制备的APTa侧面定向修饰的金纳米棒和50 μ L上述制备的APTb侧面定向修饰的金纳米棒进行混勻，轻柔振摇反应5min，加入50 μ L不同浓度的汞离子标准品，40 °C孵育Ih后，借助T-Hg2+-T特异性识别APTa和APTb分别修饰的金纳米棒形成金纳米棒侧面组装结构。由于加入的汞离子的标准品浓度的不同导致金纳米棒形成的链状结构的长度不同进而照成等离子手性 传感器的手性信号产生差异。萊离子的标准品浓度分别为0、0. 05、0. 1、0. 5、l、5、10ng/mL。利用圆二色谱仪器测定不同汞离子浓度下的组装结构的摩尔椭圆度，根据730nm波长下测定的不同浓度的摩尔椭圆度，绘制汞离子浓度的标准曲线。本传感器的线性范围为0.05到10ng/mL，检测限为O. 03ng/mL，标准曲线的线性方程为Y=O. 5X-19. 75 (Y为不同浓度下730nm下的摩尔椭圆度，X为相应汞离子的浓度)，线性相关性为>0. 99。(4)等离子手性适配体传感器的表征
在汞离子不同浓度条件下，采用透射电镜(加速电压为200 keV)、X射线能谱仪、激光动态光散射仪等仪器对金纳米棒自组装构建的手性适配体传感器进行表征。通过上述表征手 段可知该种手性适配体传感器成功构建。(5)等离子手性适配体传感器的特异性测定
按照利用定向核酸功能化的金纳米棒构建等离子手性适配体传感器步骤中对汞离子测定的相同步骤测定其它的实际样本中有可能存在的4种重金属离子(Cu2+、Cr6+、Fe2+和Zn2+),浓度均为10 ng/mL,通过测定上述4中其它的重金属离子的摩尔椭圆度,与10 ng/mL的Hg2+所照成的等离子手性适配体传感器的摩尔椭圆度可知，该种等离子手性适配体传感器针对汞离子检测特异性强。(6)等离子手性适配体传感器的实际样本测定
将自来水作为实际样本进行验证该种方法针对汞离子的添加回收率。预先向所用的自来水样品中添加O. I ng/mL、O. 5 ng/mL、l ng/mL和5 ng/mL的萊离子,采用等离子手性适配体传感器测定实际样本中的汞离子的添加回收率在94. 81-103. 10%之间，标准差为3. 5%，能够完全满足实际样品中对汞离子的检测需求。表I等离子手性适配体传感器的添加回收率试验结果
权利要求
1.一种汞离子的等离子手性适配体传感器的制备方法，其特征在于金纳米棒表面定向核酸功能化、利用定向核酸功能化的金纳米棒构建等离子手性适配体传感器、等离子手性适配体传感器的表征、等离子手性适配体传感器的特异性测定和等离子手性适配体传感器的实际样本测定；工艺为 (1)金纳米棒表面定向核酸功能化 ①金纳米棒端面封闭取制备好的10nM的金纳米棒1000 μ ，加入5 PL的I mM的巯基修饰的分子量为5000的聚乙二醇溶液，振摇反应8h，7500r/min离心15min，弃上清，水洗一次，用1000 PL的水分散金纳米棒-聚乙二醇复合物，4°C保藏、待用； ②金纳米棒侧面定向修饰APTa:取步骤①所得的金纳米棒-聚乙二醇溶液500 μ ，力口入10 μ 的100 μΜ的巯基修饰的APTa，混匀，室温振摇反应12h，7500r/min离心15min，弃上清，用500 PL的5 mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液分散金纳米棒-聚乙二醇-APTa复合物，5 mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液洗一次，再次用500 PL的5 mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液分散金纳米棒-聚乙二醇-APTa复合物，4°C保藏、待用； ③金纳米棒侧面定向修饰APTb:取步骤①所得的金纳米棒-聚乙二醇溶液500 μ ,加入10 μ 的100 μΜ的巯基修饰的APTb，混匀，室温振摇反应12h，7500r/min离心15min，弃上清，用500 PL的5 mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液分散金纳米棒-聚乙二醇-APTb复合物，5 mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液洗一次，再次用500 PL的5 mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液分散金纳米棒-聚乙二醇-APTa复合物，4°C保藏、待用；APTa :5’ -SH-AAAAAAGTGACCATTTTTGCAGTG- 3’，APTb :5’ -SH-CACTGCTTTTTTGGTCACAAAAAA-3’， (2)利用定向核酸功能化的金纳米棒构建等离子手性适配体传感器 圆二色谱检测，绘制摩尔椭圆度 汞离子浓度标准曲线取50 μ L上述制备的APTa侧面定向修饰的金纳米棒和50 μ L上述制备的APTb侧面定向修饰的金纳米棒进行混勻，轻柔振摇反应5min，加入50 μ L不同浓度的汞离子标准品，40°C孵育Ih后，借助T-Hg2+-T特异性识别APTa和APTb分别修饰的金纳米棒形成金纳米棒侧面组装结构；由于加入的汞离子的标准品浓度的不同导致金纳米棒形成的链状结构的长度不同进而造成等离子手性传感器的手性信号产生差异；萊离子的标准品浓度分别为O ng/mL、0. 05 ng/mL、0. I ng/mL、0. 5ng/mL、l ng/mL、5 ng/mL、lOng/mL ;利用圆二色谱仪器测定不同萊离子浓度下的组装结构的摩尔椭圆度，根据7 3 O nm波长下测定的不同浓度的摩尔椭圆度，绘制汞离子浓度的标准曲线；本传感器的线性范围为O. 05-10ng/mL，检测限为O. 03ng/mL，标准曲线的线性方程为Y=O. 5X-19. 75，Y为不同浓度下730nm下的摩尔椭圆度，X为相应汞离子的浓度，线性相关性为 >0. 99 ； (3)等离子手性适配体传感器的表征 在汞离子不同浓度条件下，采用加速电压为200 keV的透射电镜、X射线能谱仪、激光动态光散射仪对金纳米棒自组装构建的手性适配体传感器进行表征，通过上述表征手段可知该种手性适配体传感器成功构建； (4)等离子手性适配体传感器的特异性测定 按照利用定向核酸功能化的金纳米棒构建等离子手性适配体传感器步骤中对汞离子测定的相同步骤测定其它的实际样本中有可能存在的4种重金属离子Cu2+、Cr6+、Fe2+和/或Zn2+，浓度均为10 ng/mL，通过测定上述4种重金属离子的摩尔椭圆度，与10 ng/mL的Hg2+所造成的等离子手性适配体传感器的摩尔椭圆度比较可知，该种等离子手性适配体传感器针对汞离子检测特异性强； (5)等离子手性适配体传感器的实际样本测定 将自来水作为实际样本进行验证该种方法针对汞离子的添加回收率，预先向所用的自来水样品中分别添加O. I ng/mL、0. 5 ng/mL、l ng/mL及5 ng/mL的萊离子,采用等离子手性适配体传感器测定实际样本中的汞离子的添加回收率在94.81%-103. 10%之间，标准差为3. 5%，能够完全满足实际样品中对汞离子的检测需求。
全文摘要
一种汞离子的等离子手性适配体传感器的制备方法，属于分析化学技术领域和食品安全技术领域。本发明的主要实施步骤为(1)金纳米棒的合成；(2)金纳米棒表面定向核酸功能化；(3)利用定向核酸功能化的金纳米棒构建等离子手性适配体传感器；(4)等离子手性适配体传感器的表征；(5)等离子手性适配体传感器的特异性测定；(6)等离子手性适配体传感器的实际样本测定。随着Hg2+浓度的增加，金纳米棒侧面组装体中含有的金纳米棒的个数增加，组装体的摩尔椭圆度越大，本发明建立了摩尔椭圆度和汞离子浓度的线性关系，构建简单、灵敏和高特异性的等离子手性适配体传感器，用于检测汞离子的浓度。
文档编号G01N21/19GK102879336SQ20121036028
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者胥传来, 徐丽广, 匡华, 刘丽强, 朱颖越, 赵媛, 胡拥明 申请人:江南大学
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