专利名称：精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂、试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫酶细胞化学染色检测试剂。
背景技术：
精子膜表面麦芽凝集素受体在精子发生、成熟、获能和受精过程中有重要功能。精子膜上的特异决定簇一旦与卵细胞透明带表面精子受体相识别，将会激发顶体反应等一系列连锁过程，最终完成受精。研究表明，精子膜麦芽凝集素(WGA)受体与精子受精功能密切相关，射出精子WGA受体缺失是不育原因之一，WGA受体位置改变及数量减少可引起不育或习惯性流产。因此可以将此作为临床诊断不明原因不育症的一种手段。但现有技术中，检测精子膜表面麦芽凝集素受体的主要方法是散射比浊法，由于受实验条件的限制及技术的原因仅限于实验室研究，无法真正推广应用于临床诊断当中。
发明内容本发明的目的就是为了解决以上问题，提供一种可供临床快速便捷检测精子膜表面麦芽凝集素受体的位置及数量的试剂、试剂盒及其检测方法。
为实现上述目的，本发明提出一种精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂，包括缓冲液用于洗去精子外蛋白；固定液用于沉淀精子蛋白，固定细胞膜蛋白；洗涤液用于在进行下一检测步骤前，将上一检测步骤的未结合物洗去；酶结合物含麦芽凝集素(WGA)与酶交联后复物，用于与精子膜表面麦芽凝集素受体结合；显色底物被精子膜表面麦芽凝集素受体—麦芽凝集素—酶的复合物催化显色，显色后产物沉淀于所述复合物上，从而指示精子膜表面麦芽凝集素受体的存在。
一种精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂制作的试剂盒，包括缓冲液用于洗去精浆；固定液用于沉淀精子蛋白，固定细胞膜蛋白；洗涤液用于在进行下一检测步骤前，将上一检测步骤的未结合物洗去；酶结合物含麦芽凝集素(WGA)与酶交联后的复物，用于与精子膜表面麦芽凝集素受体结合；显色剂A为含HRP催化反应的供氢体、二甲基甲酰胺的醋酸盐缓冲液；显色剂B为30％过氧化氢体积含量为9～11％的水溶液；特制玻片所述玻片上印有含耐酸、疏水性涂料的染色窗。
同时本发明提出了一种精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂或试剂盒的检测方法，包括如下步骤1)待检标本进行精子计数；2)用缓冲液对待检标本进行多次洗涤、离心，以洗去精浆；3)以缓冲液将精子密度调整至(10～20)×106/ml；4)取此精子悬液适量，于特制玻片染色窗内，空气自然干燥；5)将经空气干燥的组织用固定液沉淀精子蛋白，固定细胞膜内蛋白；以洗涤液洗净玻片上的固定液，使非组织区域干燥；6)每份固定组织上覆以适量酶结合物，室温孵育；以洗涤液洗去未结合物，使非组织区域干燥；7)每样本加入显色底物适量，室温避光孵育；以洗涤液洗去未结合物，使之干燥；8)每样本滴加封固液，覆盖以玻片，显微镜油镜下判读结果。
上述的精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂或检测方法中，所述酶优选辣根过氧化物酶(HRP)，所述酶结合物为含麦芽凝集素(WGA)与辣根过氧化物酶(HRP)交联后复物的碳酸盐缓冲液。
所述显色底物包括显色剂A，为含HRP催化反应的供氢体、二甲基甲酰胺的醋酸盐缓冲液；优选3-氨基-9-乙基卡巴唑(AEC)质量含量为3.5～4.5％、二甲基甲酰胺体积含量为2～3％的醋酸盐缓冲液；显色剂B，为30％过氧化氢体积含量为9～11％的水溶液。
上述的精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂、试剂盒或检测方法中，所述缓冲液为含二水氯化钙(CaCl2·2H2O)含量为0.01～0.02％、氯化钾(KCl)含量为0.01～0.02％、磷酸二氢钾(KH2PO4)含量为0.02～0.03％、磷酸氢二钠(Na2HPO4)含量为0.1～0.15％、氯化钠(NaCl)含量为0.7～0.8％、硫柳汞含量为0.02～0.03％、六水氯化镁(MgCl2·6H2O)含量为0.01～0.02％的水溶液。
所述洗涤液含NaCl含量为1.5～1.7％、KH2PO4含量为0.4～0.5％、十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)含量为5.7～5.9％、KCl含量为0.4～0.45％、聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酯(Tween-20)含量为0.8～1.0％、硫柳汞含量为0.08～0.14％的水溶液；所述固定液为含戊二醛体积含量为2.5～3.5％的磷酸盐缓冲液。
所述固定液为含戊二醛体积含量为2.5～3.5％的磷酸盐缓冲液。
由于采用了以上的方案，带来了如下的有益效果1、本发明的试剂及其检测方法，利用酶结合物，与精子膜表面麦芽凝集素受体结合；形成精子膜表面麦芽凝集素受体—麦芽凝集素—酶的复合物，对显色底物催化显色，凝聚于所述复合物上，从而指示精子膜表面麦芽凝集素受体的存在；使精子膜表面麦芽凝集素受体数量、位置可以被直观显示出来，有利于进行结果判读。
2、利用显色底物对受检麦芽凝集素受体进行显色，根据说明书附图所示，色彩新艳，结果直观，利于判读。
3、通过本发明的试剂及其检测方法，定量检测人精子膜表面麦芽凝集素受体，提供精子膜WGA受体位置及数量信息，可直接应用于不肓症的临床诊断。
4、检测过程无须用到特殊的设备、条件和检测手段，只需要生物显微镜在常规实验室即可开展，检测方法操作简便；配有特制的玻片，可以同时对不同的受检标本进行批量化检测，大大缩短检测时间。
附图是在显微镜下精子膜表面麦芽凝集素受体染色情况示意图染暗红色为麦芽凝集素受体阳性精子。
具体实施方式下面通过具体的实施例对本发明作进一步详细的描述。
一种精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂盒，包括下列成分(1)缓冲液、(2)固定液(3)洗涤液(4)酶结合物(5)显色剂A(6)显色剂B(7)特制玻片(4孔/块)各检测试剂的制备工艺方法，如下所述(1)、缓冲液的制备工艺方法1)、用分析天平准确称量二水氯化钙(CaCl2·2H2O)0.132g、氯化钾(KCl)0.2g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.15g、氯化钠(NaCl)8.0g、硫柳汞0.2g、六水氯化镁(MgCl2·6H2O)0.1g，置于烧杯中，加入800毫升蒸馏水搅拌溶解；2)、用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至7.2～7.4，加蒸馏水定容至1000毫升；2～8℃保存。
(2)、固定液的制备工艺方法1)、取戊二醛30毫升，30％过氧化氢100毫升，溶入适量磷酸盐缓冲液(PB)中；2)、调节pH至7.3；移入1升装容量瓶内，用PB定容至1000毫升；2～8℃保存。
(3)、洗涤液的制备工艺方法1)、称取NaCl 16g、KH2PO44g、十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)58g、KCl 4g、聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酯(Tween-20)10ml、硫柳汞1g，溶入800毫升蒸馏水内搅拌溶解；2)、调节pH至7.4，用蒸馏水定容至1000毫升；2～8℃保存。
(4)、酶结合物的制备工艺方法1)、取5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于1ml 0.3mol/L，pH8.1碳酸氢钠(NaHCO3)，加入1％二硝基氟苯(DNFB)无水乙醇溶0.1ml，室温下轻微搅拌1小时，以利于稳定、充分反应。
2)、加1ml 0.06mol/L过碘酸钠(NaIO4)，室温下避光轻搅30分钟。
3)、加1ml 0.16mol/L乙二醇，室温下搅拌1小时，以利于稳定、充分反应；以终止氧化反应。
4)、装入透析袋，对0.01mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液1000ml，2～8℃透析过液，换液三次。
5)、于3ml醛化HRP溶液中加入含5mg麦芽凝集素(WGA)的碳酸盐缓冲液1ml，室温避光轻搅拌2～3小时，以便WGA与HRP有较高的交联率。
6)、加入5mg硼氢化钠(NaHB4)，放入2～8℃过夜。
7)、装入透析袋，对0.01mol/L pH7.2含氯化钠的磷酸盐缓冲液(PBS)，2～8℃透析24小时，换液三次，以利小分子物质完全透出，而WGA与HRP交联复物留在透析袋内。
8)、3000r/分钟离心30分钟，除去沉淀物。上清液通过Sephadex G-200凝胶柱层析，由于凝胶柱的亲合性质，WGA与HRP交联复物被留在凝胶层中，用含氯化钠的磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱。最后在结合物中加入牛血清白蛋白(BSA)至蛋白浓度为10mg/ml。2～8℃保存。
本例中所选取的酶还可以是碱性磷酸酶及葡萄糖氧化酶。
(5)、显色剂A的制备工艺方法1)、配制0.05M醋酸盐缓冲液(pH5.0)200毫升，在此液中溶入1.700克氯化钠。
2)、称取3-氨基-9-乙基卡巴唑(AEC)40毫克，溶入二甲基甲酰胺2500ul。用含氯化钠的醋酸盐缓冲液将上液定容至100毫升。待其完全溶解后过滤。2～8℃保存。
本例中的AEC还可用二氨基联苯胺、邻联甲苯胺、甲奈酚等其他HRP催化反应的供氢体替代。
(6)、显色剂B的制备工艺方法取30％过氧化氢10毫升，用蒸馏水定容至100毫升。2～8℃保存。
(7)、特制玻片的制备工艺方法玻片上用耐酸、疏水性涂料印有直径为0.8mm的染色窗。
上述精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂或试剂盒检测人精子膜表面麦芽凝集素受体，其具体步骤为一、试剂准备1、以蒸馏水将洗涤液作20倍稀释。
2、临用前按显色剂A∶显色剂B＝100∶1体积比配制显色底物二、操作方法1、待检标本进行精子计数。
2、1份液化的精液(约0.2ml)与5倍于精液体积的缓冲液混合，室温500g离心5分钟，去上清液。再加一定体积的缓冲液使精子重新均匀悬�。�500g离心5分钟，如此共洗涤3次，以洗去精浆。
3、最后一次洗涤完毕，弃上清液。以缓冲液将精子团重新均匀悬�。剖用芏�。然后以缓冲液将精子密度调整至(10～20)×106/ml左右。
4、取此精子悬液5ul，于特制玻片染色窗内，空气自然干燥。
5、将经空气干燥的组织用固定液固定10分钟，以沉淀精子蛋白，固定细胞膜内蛋白。以洗涤液轻轻冲洗，玻片5次，以洗净玻片上的组织用固定液，玻片置洗涤液中浸泡5分钟，甩去玻片表面水份，以吸水纸擦干非组织区域液体。
6、每份固定组织上覆以10ul酶结合物，室温(18～28℃)孵育40分钟。以洗涤液轻轻冲洗玻片5次，洗去未结合物，玻片置洗涤液中浸泡5分钟，换新洗涤液，再浸泡5分钟，甩去玻片表面水份，以吸水纸擦干非组织区域液体(注意勿触及组织区域)。
7、每样本加入显色底物15ul，室温(18～28℃)避光孵育20分钟。以洗涤液轻轻冲洗玻片5次，玻片置洗涤液中浸泡5分钟，换新洗涤液，再浸泡5分钟。甩去玻片表面水份，晾干或吹干。
8、每样本滴加封固液1滴，覆盖以玻片，显微镜油镜下观察结果。
三、结果判读如附图所示，在显微镜下精子膜表面麦芽凝集素受体染色情况，中间为阴性精子，指示不存在精子膜表面麦芽麦芽凝集素受体，上下两个精子头部呈现棕红色，指示精子膜表面麦芽凝集素受体的存在，为阳性精子。
至少计数200个精子，记录阳性精子(精子头部、颈部或体尾部染棕红色)占精子总数的百分率(％)四、正常参考值精子阳性率＞95％五、临床适用性WGA受体位置改变及数量减少可引起不育或习惯性流产，可将此作为临床诊断不明原因不育症的一种手段。
在进行上述对受检患者精子的检测步骤之前，还可以先确定酶结合物的最佳稀释度，以保证对受检精子的染色效果达到尽可能明显、鲜艳，以利于对结果的判读对经过前述制备工艺制备的酶结合物，取系列稀释度，按上述检测步骤分别对正常精子进行检测，对比在酶结合物的不同稀释度条件下，正常精子染色情况，选择最佳、最鲜艳的染色结果所对应的稀释度，将酶结合物原液稀释至该最佳稀释度，2-8℃贮存备用。
权利要求
1.一种精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂，包括缓冲液用于洗去精浆；固定液用于沉淀精子蛋白，固定细胞膜蛋白；洗涤液用于在进行下一检测步骤前，将上一检测步骤的未结合物和非特异性结合物洗去；酶结合物含麦芽凝集素(WGA)与酶交联后的复物，用于与精子膜表面麦芽凝集素受体结合；显色底物被精子膜表面麦芽凝集素受体—麦芽凝集素—酶的复合物催化显色，显色后产物沉淀于所述复合物上，从而指示精子膜表面麦芽凝集素受体的存在。
2.如权利要求1所述的精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂，其特征是所述酶为辣根过氧化物酶(HRP)，所述酶结合物为含麦芽凝集素(WGA)与辣根过氧化物酶(HRP)交联后复物的碳酸盐缓冲液。
3.如权利要求2所述的精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂，其特征是，所述显色底物包括显色剂A，为3-氨基-9-乙基卡巴唑(AEC)质量含量为3.5～4.5％、二甲基甲酰胺体积含量为2～3％的醋酸盐缓冲液；显色剂B，为30％过氧化氢体积含量为9～11％的水溶液。
4.如权利要求3所述的精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂，其特征是所述缓冲液为含二水氯化钙(CaCl2·2H2O)含量为0.01～0.02％、氯化钾(KCl)含量为0.01～0.02％、磷酸二氢钾(KH2PO4)含量为0.02～0.03％、磷酸氢二钠(Na2HPO4)含量为0.1～0.15％、氯化钠(NaCl)含量为0.7～0.8％、硫柳汞含量为0.02～0.03％、六水氯化镁(MgCl2·6H2O)含量为0.01～0.02％的水溶液。
5.如权利要求4所述的精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂，其特征是，所述洗涤液含NaCl含量为1.5～1.7％、KH2PO4含量为0.4～0.5％、十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)含量为5.7～5.9％、KCl含量为0.4～0.45％、聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酯(Tween-20)含量为0.8～1.0％、硫柳汞含量为0.08～0.14％的水溶液；所述固定液为含戊二醛体积含量为2.5～3.5％的磷酸盐缓冲液。
6.一种精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂制作的试剂盒，包括缓冲液用于洗去精浆；固定液用于沉淀精子蛋白，固定细胞膜蛋白；洗涤液用于在进行下一检测步骤前，将上一检测步骤的未结合物和非特异性结合物洗去；酶结合物含麦芽凝集素(WGA)与酶交联后的复物，用于与精子膜表面麦芽凝集素受体结合；显色剂A，为含HRP催化反应的供氢体、二甲基甲酰胺的醋酸盐缓冲液；显色剂B，为30％过氧化氢体积含量为9～11％的水溶液。
7.如权利要求6所述的精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂制作的试剂盒，其特征是所述酶为辣根过氧化物酶(HRP)。
8.如权利要求7所述的精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂制作的试剂盒，其特征是所述显色剂A，为3-氨基-9-乙基卡巴唑(AEC)质量含量为3.5～4.5％、二甲基甲酰胺体积含量为2～3％的醋酸盐缓冲液；
9.如权利要求6-8任意一项所述的精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂盒，其特征是还包括特制玻片，所述玻片上印有含耐酸、疏水性涂料的染色窗。
10.如权利要求1-5任意一项所述精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂的检测方法，包括如下步骤1)对待检标本进行精子计数；2)用缓冲液对待检标本进行多次洗涤、离心，以洗去精浆；3)以缓冲液将精子密度调整至(10～20)×106/ml；4)取此精子悬液适量，于特制玻片染色窗内，空气自然干燥；5)将经空气干燥的组织用固定液沉淀精子蛋白，固定细胞膜蛋白；以洗涤液洗净玻片上的固定液，使非组织区域干燥；6)每份固定组织上覆以适量酶结合物，室温孵育；以洗涤液洗去未结合物，使非组织区域干燥；7)每样本加入显色底物适量，室温避光孵育；以洗涤液洗去未结合物，使之干燥；8)每样本滴加封固液，覆盖以玻片，显微镜油镜下判读结果。
11.如权利要求6-8任意一项所述精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂盒的检测方法，其特征是包括如下步骤1)对待检标本进行精子计数；2)用缓冲液对待检标本进行多次洗涤、离心，以洗去精浆；3)以缓冲液将精子密度调整至(10～20)×106/ml；4)取此精子悬液适量，于特制玻片染色窗内，空气自然干燥；5)将经空气干燥的组织用固定液沉淀精子蛋白，固定细胞膜蛋白；以洗涤液洗净玻片上的固定液，使非组织区域干燥；6)每份固定组织上覆以适量酶结合物，室温孵育；以洗涤液洗去未结合物，使非组织区域干燥；7)每样本加入显色底物适量，室温避光孵育；以洗涤液洗去未结合物，使之干燥；8)每样本滴加封固液，覆盖以玻片，显微镜油镜下判读结果。
全文摘要
本发明公开了一种精子膜表面麦芽凝集素受体定量检测试剂及试剂盒，同时提出了相应检测方法，定量检测人精子膜表面麦芽凝集素受体，提供精子膜WGA受体位置及数量信息，直接应用于不肓症的临床诊断，检测方法操作简便，可进行批量化检测，大大缩短检测时间。
文档编号G01N33/535GK1755368SQ20041004081
公开日2006年4月5日 申请日期2004年10月1日 优先权日2004年10月1日
发明者傅剑华, 刘瑜, 胡家纯, 何林, 何小红 申请人:深圳华康生物医学工程有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
