专利名称：具固定相位的c-反应蛋白所拓印的薄膜及其应用于感测晶片系统的制作方法
技术领域：
本发明关于一种制备拓印蛋白质分子拓印薄膜及其应用，尤其关于一种具固定相位的C-反应蛋白拓印薄膜及其应用于感测晶片系统。
背景技术：
现今医学技术已达到一定水准，但仍面临了一些医治率低或难以检测的疾病，这些疾病往往不是单一原因造成的，因此诊断也较为不易。而各种疾病都会造成一个共同的现象一发炎。以往认为是后天生活习惯所造成的文明病，如心血管疾病、糖尿病、阿兹海默氏症、过敏症、癌症及自体免疫疾病等，经研究发现同样与发炎反应有着密切的关系，此发现更刊登在2004年时代杂志封面。由发炎反应所引起的这些疾病有两个共通点:一、并非单一病因所造成，使得主要病因检验十分不便；二、疾病初期较容易控制与治疗，拖到中后期往往难以治愈，甚至成为不治之症，使得初期诊断很重要，越早精确地预测出疾病发生的可能性，越能够避免这些疾病的威胁。C-反应蛋白(c-reactive protein, CRP)是由肝脏分泌,在外伤、局部缺血、烧伤、各种发炎与感染时数量会迅速上升1，000倍以上，状况缓解后也会很快下降，所以C-反应蛋白被当作主要发炎的指标。临床上用途主要在于组织损伤的筛检和监测，判断病人是否发炎及诊断发炎性疾病复发的可能性，借以评估抗发炎药物治疗的成效。另外，早产也被认为是一种感染造成的炎性反应，故对于待产的孕妇，C-反应蛋白亦为一个重要的检测项目。早产常造成新生儿很高的死亡率及罹病率，目前仍是产科学无法克服的主要问题之一。自发性早产是指不明原因或早期破水导致在妊娠37周以前生产者。早产是一个多发性病因的疾�。蝗菀子闪俅仓⒆椿虻ヒ患觳槔丛づ�。当孕妇因临床病症被诊断为早产时，常已面临即将分娩而无法安胎，因此发展临床诊断工具提早来预测早产可能性有其重要和必要性。而因早产也被认为可能是一种发炎反应，故C-反应蛋白为即将生产的指标蛋白质之一，可观察孕妇体内的C-反应蛋白浓度是否在非预产期时有不正常升高的现象，而提早准备孕妇早产处理，减少早产儿因时间拖延不及照顾而导致的并发症。蛋白质感测于生物医学发展上一直是个受到重视的研究领域，但现今蛋白质感测的感测层多半使用生物性分子。这个问题于2010年的μ TAS会议中被提出讨论，使用生物性分子作为感测层的研究无法离开实验室，因此蛋白质检测始终停留在检验所的阶段，需要长时间的检测时间、专业的检测人员、昂贵的实验仪器或药剂。分子拓印技术(Molecular imprinted technology, MIT)是结合有机高分子与无机网络结构材料，并将模板分子拓印于此材料上，使得拓印孔拥有互补的几何形状以及键结，具有选择性的吸附目标分析物。换言之，此技术所制成的辨识层类似于人工抗体，且制程快速、简易廉价，对于发展生医感测层有极大的潜能。以小分子为模板分子的拓印技术经过几十年的发展已相当成熟，但从小分子模板要实施至巨大蛋白质分子模板所遇到的瓶颈大致可分为下面四点:1.蛋白质具有多功能基团，无法针对少数几种而达到专一性吸附，亦容易造成非特异性吸附的产生；2.蛋白质为巨大分子(分子量6，OOODa-几百万Da)难以接近拓印孔洞，亦难脱离；3.蛋白质难溶于普遍使用的拓印溶剂中；4.弹性结构的蛋白质易在太过刺激的环境中因变性而产生形变；故虽发展大分子拓印薄膜至今已超过35年的时间，但进展有限，离有效吸附目标分子仍有一段距离。
发明内容
为了改进上述缺点，本发明以分子拓印技术的概念发展人工抗体感测层，有别于现今使用的生物分子感测层。本发明提供一种具固定相位的C-反应蛋白所拓印的薄膜，包含复数个固定相位的拓印孔洞，这些拓印孔洞借由移除复数个C-反应蛋白而产生，其中这些C-反应蛋白连结于改质的第一基板表面的复数个抗体，其中该改质的第一基板表面，借由半胱胺及戊二醛与该第一基板表面的金层反应所获得。在本发明的实施例中，进一步于该反应中使用甘氨酸阻隔未连接这些抗体的戊二醛醛基基团，且这些C-反应蛋白进一步与0-4-硝基苯基磷胆碱接触形成复数个预聚合复合物，该复数个预聚合复合物与第二基板的组合物进行微接触，且该组合物由交联剂与起始剂所组成，该交联剂与该起始剂的摩尔比例范围为600:1飞40:1 ;该交联剂为二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯或三羟甲基丙烷三丙烯酸酯；该起始剂为2，2’- 二甲基-2-苯基苯乙酮、1-羟基-环己基-苯酮、对-苯基二苯酮或苯甲基二甲基缩酮。本发明另提供一种C-反应蛋白的感测晶片系统，包含晶片本体，包含第一腔体，该第一腔体内设有如前两段所述的薄膜，且该第一腔体分别连通设置第一流通口与第二流通口，借以使含有C-反应蛋白的待测溶液由该第一流通口注入后流经该薄膜，而由该第二流通口流出；第二腔体，该第二腔体内设有感测电极，且该第二腔体分别连通设置第三流通口与第四流通口，借由萃取溶液使该拓印薄膜上的C-反应蛋白经由该第三流通口流至该第二腔体；以及侦测器，侦测该感测电极的电位变化，并根据该电位变化产生侦测结果。于本发明C-反应蛋白的感测晶片系统中的实施例中，该感测电极为指叉状电极，且由镀金玻璃材料经微影制程所制成，该感测电极表面经硫化改质或以抗体修饰；该电位变化由该感测电极与该第二腔体内的萃取溶液所形成的等效电路，与该侦测器的感测电路的电位能动态平衡所造成，且该侦测结果由该电位变化的时间常数判定。本发明的目的为将蛋白分子拓印薄膜结合微流体晶片，制成蛋白质辨识薄膜整合实验室晶片(lab-on-a-chip，L0C)取代传统的大型仪器，以达到降低样本量、能源消耗与产品成本，并简化样本处理步骤，提升反应时间与检测精度，以及系统微小化等诉求，完成新一代可携带式、可产品化的生医感测器。于临床上为各种原因(例如早产)监控发炎反应，可借着侦测C-反应蛋白的浓度得知，而现今针对蛋白质的感测方式除了传统以质谱仪等大型仪器分析的外，检验所及实验室的蛋白质感测方式主流为酵素免疫分析法(ELISA)，但这些方法必须待在实验室检测，且所需时间达数天，较难即时得知病患情况，故发展专门且微小化的生医诊断平台已成为现今的趋势。本发明为可携式临床诊断工具能够方便诊断，一方面掌控病患的身体状况，一方面协助医师调整诊断方式，较现有的大型仪器便宜、迅速、更贴近病患与医师的需求。本发明将利用微机电晶片的技术，结合微流道晶片与分子拓印薄模，同时针对不同病因的指标蛋白质进行感测，并且希望发展出纳米生医的感测平台，只要使用微量(UL)的血浆检体即可以同时有多种指标蛋白质的分析结果，且不需要专业人员的操作。利用这种分析方法将可以更有效率的用来预测疾病发生的可能。因此，本发明使用分子拓印技术概念发展的人工抗体感测层，具有物理稳定性(耐高温、高压)、较佳的化学稳定性(耐酸、碱、有机溶剂与金属离子)、生命周期长(数年)、可重复使用及价格低廉等多种优点，皆有别于习知使用的生物分子感测层。以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。
图1为拓印模板表面改质的采用半胱胺-戍二醒(cysteamine-glutaraldehyde)法步骤示意图。图2为拓印模板的表面改质处理示意图。图3A为C-反应蛋白拓印薄膜(PIP)制程示意图。图3B为C-反应蛋白抗体拓印薄膜(AIP)制程示意图。图4为C-反应蛋白或其抗体的拓印薄膜(PIP或AIP)的光聚合图案化制程示意图。图5为改善制程后PIP的AFM扫描结果图。图6为原子力显微镜以C-反应蛋白抗体探针微观量测C-反应蛋白拓印薄膜表面的作用力与距离关系图。图7为C-反应蛋白感测微晶片系统的不意图。图8为C-反应蛋白感测微晶片系统的第一腔体与第二腔体规格示意图。图9为裸金电极的等效电路分析图。图10为经表面改质的金电极上外部电路与感测电极间关系图。图11为不同C-反应蛋白浓度所测得的动态电位变化图。图12为图10电位变化曲线的时间常数与C-反应蛋白浓度关系图。图13为C-反应蛋白的感测微晶片系统的感测电极于第二腔体中动态吸附目标蛋白质的表面电容变化图。主要元件符号说明2 试片21 模板22功能性单体23交联剂与起始剂混合溶液241、242 垫片25玻璃晶圆26 光罩27 拓印薄膜(PIP 或 AIP)3 C-反应蛋白的感测微晶片系统
31晶片本体32第一腔体33 拓印薄膜(PIP 或 AIP)34第二腔体35感测电极36微通道371 374液体流通口
具体实施例方式
定义:本发明说明书中所提及的「人工抗体」，定义为人工制造，且可与特定抗原结合之物，例如本案的C-反应蛋白拓印薄膜。本发明说明书中所提及的「同向性」一词，若无特别说明，其意义与「固定相位」相同。本发明的实施例的蛋白分子拓印薄膜，可将蛋白质分子抗体接于金层上，而达到固定蛋白质于其上，且可做到统一蛋白质的相位，聚合出相似的拓印孔洞；另外并检验改质后拓印模板上生化分子间作用力，观察化学分子及生物分子之间产生键结的动态变化，借此建立可重复使用的拓印模板，而降低制程成本。本发明技术特征包含调整溶剂的混合比例以提高辨识薄膜的专一性，以及调整光聚合时间以定义出完整且结构良好的辨识薄膜。
以下就C-反应蛋白拓印薄膜制备方法、利用原子力显微镜(atomic forcemicroscope, AFM)测量C-反应蛋白拓印薄膜的表面状态以及C-反应蛋白的感测微晶片系统分别详述如下:实施例1:C-反应蛋白拓印薄膜的制备1-1拓印模板本发明主要制程分为两部分:拓印模板与蛋白质拓印薄膜。在拓印薄膜方面，本发明的实施例使用的拓印模板为四寸玻璃晶圆，表面以电子枪(E-gun)真空蒸镀厚度为400nm的金层与25nm的黏着层(Ti)。拓印模板的表面改质采用半胱胺-戍二醒(cysteamine-glutaraldehyde)法,如图1所示，其中第一个改质试剂为半胱胺(cysteamine),化学式如式(I):
权利要求
1.一种具固定相位的C-反应蛋白所拓印的薄膜，包含复数个固定相位的拓印孔洞，这些拓印孔洞是借由移除复数个C-反应蛋白而产生，其中这些C-反应蛋白连结于改质的第一基板表面的复数个抗体。
2.一种具固定相位的C-反应蛋白抗体所拓印的薄膜，包含复数个固定相位的拓印孔洞，这些拓印孔洞借由移除复数个C-反应蛋白抗体而产生，其中这些C-反应蛋白抗体连结于一改质的第一基板表面。
3.如权利要求1或2所述的薄膜，其中该改质的第一基板表面，借由半胱胺及戊二醛与该第一基板表面的金层反应所获得。
4.如权利要求3所述的薄膜，进一步于该反应中使用甘氨酸阻隔未连接这些抗体的戊二醛醛基基团。
5.如权利要求1所述的薄膜，其中这些C-反应蛋白进一步与0-4-硝基苯基磷胆碱接触形成复数个预聚合复合物。
6.如权利要求2所述的薄膜 ，其中这些C-反应蛋白抗体进一步与0-4-硝基苯基磷胆碱接触形成复数个预聚合复合物。
7.如权利要求5或6所述的薄膜，其中该复数个预聚合复合物与第二基板的组合物进行微接触，且该组合物由交联剂与起始剂所组成。
8.如权利要求7所述的薄膜，其中该交联剂为二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯或三羟甲基丙烷三丙烯酸酯。
9.如权利要求7所述的薄膜，其中该起始剂为2，2’- 二甲基-2-苯基苯乙酮、1-羟基-环己基-苯酮、对-苯基二苯酮或苯甲基二甲基缩酮。
10.如权利要求7所述的薄膜，其中该交联剂与该起始剂的摩尔比例范围为600:1 640:1。
11.一种C-反应蛋白的感测晶片系统，包含: 晶片本体，包含； 第一腔体，该第一腔体内设有一如权利要求1或2所述的薄膜，且该第一腔体分别连通设置第一流通口与第二流通口，借以使含有C-反应蛋白的待测溶液由该第一流通口注入后流经该拓印薄膜，而由该第二流通口流出； 第二腔体，该第二腔体内设有感测电极，且该第二腔体分别连通设置第三流通口与第四流通口，借由萃取溶液使该拓印薄膜上的C-反应蛋白经由该第三流通口流至该第二腔体；以及 侦测器，侦测该感测电极的电位变化,并根据该电位变化产生侦测结果。
12.如权利要求11所述的感测晶片系统，其中该感测电极为金电极。
13.如权利要求11所述的感测晶片系统，其中该感测电极为指叉状电极。
14.如权利要求13所述的感测晶片系统，其中该指叉状电极由镀金玻璃材料经微影制程所制成。
15.如权利要求11至13任一项所述的感测晶片系统，其中该感测电极表面经硫化改质或以抗体修饰。
16.如权利要求15所述的感测晶片系统，其中该抗体为生物抗体或人工抗体。
17.如权利要求11所述的感测晶片系统，其中该晶片本体为平板状。
18.如权利要求11所述的感测晶片系统，其中该电位变化由该感测电极与该第二腔体内的萃取溶液所形成的等效电路，与该侦测器的感测电路的电位能动态平衡所造成。
19.如权利要求11所述的感测晶片系统，其中该侦测结果由该电位变化的时间常数判定 。
全文摘要
本发明为一种具固定相位的C-反应蛋白所拓印的薄膜及其应用于感测晶片系统。本发明将蛋白质抗体接于金层上，因此可固定蛋白质于其上，使能统一蛋白质相位，进而聚合出相似的拓印孔洞，利用本发明的C-反应蛋白拓印薄膜的方法制造的C-反应蛋白拓印薄膜，其对目标蛋白质吸附能力约为生物抗体的99%。另外，本发明利用上述C-反应蛋白拓印薄膜以及动态电容感测技术，提供一种C-反应蛋白的感测晶片系统。
文档编号G01N27/22GK103163187SQ20121029460
公开日2013年6月19日 申请日期2012年8月17日 优先权日2011年12月16日
发明者洪健中, 陈思颖, 洪嘉呈, 陈治平 申请人:陈治平, 洪健中
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