专利名称：荧光偏振检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过测量荧光各向异性来检测被分析物与适体(aptamers)结合的方法。
背景技术：
1957年的免疫测定和1971年的酶连锁免疫检测剂测定技术的推广是临床医学诊断的一次革命。直到最近，有利于诊断检测的有分子识别能力的分子仍然被局限于抗体。近来，通过化学组合物方法选择高亲和力配合基的生物体外方法的发展，提供了一种独特的新疗法和诊断剂。这些方法能够鉴别许多具有高亲和力与特异性的不同寡核苷酸序列，例如，通过呈指数增长的配合基系统发育(SELEXTM)方式来确定寡核苷酸序列是常规鉴别寡核苷酸配合基的方法，也被称为适体，也被认为是潜在的药物。该方法中，一组完全随机排列的RNAs(核糖核酸)被选出粘附于固定在硝化纤维素滤器上的特定的核酸附着蛋白质。被缚的RNAs或DNAs(脱氧核糖核酸)随后被恢复进而放大成为DNA。DNA可被进一步特性化。这些寡核苷酸可在各种被分析物的鉴别中用作探测器，特定的蛋白质包括各种艾滋病病毒(HIV)酶、增长因子以及炎症诱发酶(Sun，S.，Curr.Opin.Mol.THER.，2(1)100-5(2000))。
典型的用于识别和量化粘附于被分析物上适体的平台受到了从反应物分离被束缚物方法的极大限制。从反应物分离被缚物的方法包括固相、液相色谱法及电泳。
发明内容
一方面，本发明提供了测定被分析物样品的方法。粘附在载体上的具有荧光标识适体与样品相联结并以偏振光辐照，荧光团的荧光各向异性值可被测出，当荧光各向异性值大于没有样品的各向异性值时可确定被分析物的存在。
一个实施例中，具有荧光标识适体所粘附的载体是珠状物，如硅胶珠。珠的直径在1微米到10微米。特定的实施例中，珠的直径约为5微米。珠可以悬浮于溶液也可以成二维排列。
另一实施例中，标识于适体上的荧光团是荧光素衍生物，四溴荧光素衍生物，香豆素衍生物以及玫瑰精衍生物。特定的实施例中，该荧光团是羧基荧光素(FAM)。
适体可以是一批适体中的一部分。一个实施例中，这一批适体包含有两个或更多可设定地址的特定区域，每一可设定地址的特定区域含有单一种类的适体。另一实施例中，每一可设定地址的特定区域含有多个种类的适体。
在一个实施例中，用于辐照适体的偏振光是激光。
另一实施例中，其中的被分析物与某种病症相关，样品可从疑似病例的病人身上获得。
在一个实施例中，被分析物是蛋白质，另一实施例中，被分析物是代谢物。
另一方面，样品是从疑似病例的病人身上获取的。通过从样品中检测有无被分析物就可以确定被分析物是否与该病症有关。如果从病人身体采集的样品中检出被分析物，则该病人将被诊断为患上此疾病。
图1示出了将凝血酶与溶解酵素和具FAM标识的抗凝血酶适体粘合的联结体珠的反应动力学数据。
图2示出了将GP120和FAM-518适体粘合的联结体珠的反应动力学数据。
图3示出了将溶解酵素和FAM-518适体粘合的联结体珠的反应动力学数据。
图4示出了GP120和FAM-518适体可逆粘合的联结体珠的反应动力学数据。
具体实施例方式
一方面，本发明提供了一种通过测量被分析物与被标识的适体粘合后其荧光各向异性的变化来测定样品中被分析物的方法。
定义如果不作别的说明，本发明中的科技术语是本领域专业技术人员所了解的一般含义。本文所述用于实现本发明的相同或相类似的材料和方法都是本领域专业人员所认知的。当然，本发明并不局限于所述材料和方法。本发明中，下列术语被定义为此处的“适体(aptamer)”是指可粘附相关被分析物的不同于杂交碱基对的特定的寡核苷酸。典型的适体含有DNA或RNA或它们的混合物。适体可以是自然存在的，或是合成的，或通过细胞重组而来。典型的适体是单股的，但也可以是双股或三股。它们可以是自然存在的核苷酸，或以化学或非自然方式(如2-氨基嘌呤)改良后的核苷酸。见美国专利5,840,867。适体可经化学改良，如通过附加标识(如荧光团)，或附加分子以使适体和与其粘合的分子相交联。具有相同序列或能与同种特定分子粘合的适体被视为是同一种类。适体的长度各异，但都小于100个核苷的长度。
已知的适体有很多，它们基于各自的特性而有特定的用途。作为选择，新的适体可以基于其与相关特定分子粘合的能力而从一批随机的寡核苷酸中选取并被识别和获取。如美国专利5,475,096和5,270,613所述，新的适体可以通过呈指数增长的配合基系统发育(SELEXTM)的方式而被识别和获取。
适体被一个或多个荧光团标识，荧光团也可以是荧光探针或荧光染料。“荧光团”是指可被特定波长的光波所激发而发出不同波长光的任何分子。荧光团包括但不局限于荧光素(美国专利5，188,934；6,008,379；6,020,481)，四溴荧光素，香豆素，玫瑰精(美国专利5,366,860；5,847,162；5,936,087；6,051,719；6,191,278)，如四甲基玫瑰精，苯甲嗪(美国专利6,140,500)，德州红和丹磺酰衍生物。用以标识生物分子的荧光染料包括能量转移染料捐体与受体对(美国专利5,863,727；5,800,996；5,945,526)，青色素(Kubista，WO97/45539)，以及其他任何可发出荧光探测信号的荧光标识体。荧光染料的实例有5-羧基荧光素(″5-FAM″)，6-羧基荧光素(″6-FAM″)，2′、4′、4、7-四氯荧光素，2′、4′、5′、7′、4、7-六氯荧光素。参见美国专利5,118,934。
荧光素可以与适体以任何方位结合，例如适体可以标识在中线、底部或任一端。适体可以以任何已知的方式标识，如利用荧光标识联结物的标准DNA合成技术。同样，未标识的联结物可用于合成以及后续的与荧光团标识中(见例证Ruth，J.(1991)Oligo and Analogues，pp.255-282，Eckstein，F，Ed.，IRL Press，Oxford，UK；Vinayak R.(1999)Tetrahedron Lett.407611-7813.)。在以SELEXTM方法得到适体后，荧光团可被选择性的混入以确保其不会使被分析物与适体的粘合物混乱。另外，确定适体粘合物中荧光团的位置也能确保被分析物的粘合导致的对荧光各向异性产生的重大改变。
“标识”是指任何可附着于多聚核苷酸并产生可探测信号的组成部分，例如荧光团。
“荧光”是指从样品或染料中发散出的光，该光波波长长于照射在样品或染料上光波的波长。照射在样品或染料上光波通常称为“激发”光波，其被样品或染料所吸收然后发射出“分射”光。
“各向异性”是指系统中因为方向的改变而呈现出的不同特性。上下文中的“荧光各向异性”意指分射光的不同偏振。
本文中的“多聚核苷酸”和“寡核苷酸”可交替使用，是指核苷单体的单股、双股、三股聚合体，包括2′-脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。多聚核苷酸可完全由脱氧核糖核苷酸、完全的核糖核苷酸或其混合体构成。多聚核苷酸由内核苷酸、核酸基及糖类组成，包括非天然基部、糖、L-DNA、核苷酸间键合。
“联结物”是指含有共价键或原子链从而共价地将附着到另一分子或官能基的分子中的化学官能基，如，荧光团粘附于适体或适体粘附于载体。
联结物由可拆卸的保护性基团组成，“保护性基团”是粘附于分子并可在选择性地曝光于活化剂(如光)时被移除。
“载体”一词是指任何可附着或固定适体的固体材料。如，载体可以是玻璃、金属、硅、锗、砷化镓或塑料。载体包含“树脂”，“固相”，“支撑物”等术语。载体可由有机聚合物组成，如聚苯乙烯，聚乙烯，聚丙烯，聚氟乙烯，聚乙烯氧化物，聚丙烯酰胺以及共聚物和接枝聚合体。载体也可是无机物，如玻璃，硅石，可控微孔玻璃珠(CPG)或反相硅石。载体的外形可以是珠状，球体，粒子，微粒，凝胶体，纤维质或面状。面状可以是平面，绝对平面或非平面。载体还可以是多孔的或无孔的，也可能具有膨胀或非膨胀性。载体可被制成井状，坑状或其他形状的容器、器皿、轮廓或位置。大多数的载体是成阵列排列。
“阵列”或“微阵列”意指事先设定的对适体在培养基上的空间排列位置。适体可直接附着于培养基上，或附着于同培养基相连接的载体上。在阵列被用于检测单一被分析物时，适体可以是完全相同的；在阵列被用于检测样品中不同分子时，适体可能并不相同。阵列可包括一个或多个“可设定地址的特定区域”，即是说，物理位置包含已知种类的适体。在一个实施例中，一个可设定地址的区域包括多于一种适体。不管怎样，每个区域内的适体种类是可被得知和测定的。
阵列内可包含任何数量的可设定地址的特定区域，如1到100个(少数)，100到1000个(中等数量)或1000个以上(多数)。另外，阵列内可设定地址的特定区域的密度各不相同。例如，可以增加培养基上可设定地址的特定区域的密度以减少所需培养基的尺寸。典型地，阵列的形式具有几何学上的规则形状，以利于成形，操作，堆砌，反应物或样品导入，检测和贮藏。阵列可以成行或成柱状设置，每一区域内都有整齐的间距。同样，该区域可以成组排列，随机排列或以其他形式排列。在一个实施例中，阵列中含有大量可设定地址的特定区域，其构造使得每一区域在高吞吐量时在空间上都是可设定地址的。
在二维的阵列中，可设定地址的特定区域取决于在表面上的位置。然而，在一个实施例中，阵列在溶液中含有大量的粒子(如微珠)。每一粒子含有特定种类的适体。在这种情况下，适体的同一性可以通过粒子的特性而测定。如，这些粒子具有同样的性质如形状、式样、发色团或荧光团。
“目标物”和“被分析物”都是指特定的分子或化合物，它们的存在与否以及数目都可被检测，同时它们可与适体相合。被分析物可以是任何分子，包括但不局限于多肽、蛋白质、复杂蛋白质、寡核苷酸，DNA，RNA，碳水化合物，多聚糖，代谢物，营养物，药物或小分子。适体可以自然存在或合成。在一个实施例中，适体来自于存活的或曾经存活的有机体(包括但不局限于原核生物，真核细胞，植物，动物和病毒)上的多肽衍生物。
在这里，“培养基”是指本发明中阵列底层上的核心物质。典型的，培养基是具有刚性或半刚性表面的载体。在一个实施例中，培养基的表面是平的。在其他实施例种，培养基的表面具有如下物理性质例如井状、沟状、凸起的或凹陷的层面。形成阵列的适体可能直接粘附在培养基上，或粘附于与其相连(粘附或包含于培养基)的载体上。
实现本发明的示例性模式本发明提供了通过测量被分析物与荧光标识适体的荧光各向异性的变化来检测样品上被分析物是否存在及其数量的方法。荧光各向异性来自于表征荧光团平均角位移的荧光偏振，其在吸收和发散光子时产生。
如上所述，被分析物不局限于任何形式，因而本发明中的方法可广泛用于各个领域。分析物的同一性取决于被分析物的自然属性，本领域的专业人员可视其特定情况而修正本测定方法。
一个或多个被分析物是否存在的检测是通过样品来测定的。样品可以是希望测定被分析物存在性的任何组合物且不局限于任何形式。例如但不限于，在医学检验中，可以检测病人的体液(如血液)中是否存在与病症相关的多肽(如传染体)；在工业检验中，可以测定废水中是否含有特定的有机物。
对同样的被分析物来说其适体是确定的。适体可以是在以前的检测中被认为可以与相应的被分析物相粘合的那一种。许多适体在本领域是熟知的。例如，已知适体选择性的数据库设立在奥斯丁的德克萨斯大学(http//aptamer.icmp.utexas.edu)。例如从索莫罗杰克(Somologic)(美国科罗拉多)或吉利得科技公司(Gilead Sciences，Inc.)(美国加利福尼亚)可商业购得大量不同的适体。如果与某种被分析物相特定的适体以前未见记述，它可被任何现有技术的方法所确定。与特定化合物相合的适体的确定方法已经公开，例如，依照美国专利5,475,096和5,270,613，通过呈指数增长的配合基系统发育(SELEXTM)的方式可以确定相应于特定配合基的适体种类。在SELEXTM方式中，一批随机的RNA或单一的DNA序列被选用作期望的目标体。与目标体紧密联结的序列将被隔离或增强。该选择将基于前面的选择而被多次重复以确定有用的适体。
一旦确定了适体，将会复制一个或多个以在检验中用以检测被分析物的存在性。适体可以用任何现有技术已知的方法复制，因而它可通过标准程序化学合成而得。适体可以在合成过程中或合成完成后以任何现有技术已知得方法标识荧光团。例如，适体在合成过程中可以同改良后的核苷酸相结合而被标识。或者，适体也可在合成后经化学改良。经标识后的适体将和待分析的样品联结。在另一实施例中，适体可在SELEXTM步骤中被结合。这将有利于标识体在被分析物中位置的放置，从而确保被分析物粘合物的荧光各向异性的变化最大。
适体与待分析的样品联结时通常是被放置于载体上的。适体可以被直接地合成在载体上，或者，适体在合成后被粘附在载体上。例如可参见Southernet al.，Nuc.Acids Res.，20(7)1679-1684(1992)；Southern et al.，Genomics，131008-10017(1992)；WO02/30561；WO02/0750；WO96/40790；Maclean et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 942805-2810(1997)；以及美国专利5,744,305；5,405,783；5,445,934和6,261,776。适体可以以现有技术中任何已知的方法被粘附在载体上。例如3′-胺基-变型适体可以应用于载体的活性表面(Potyrailo et AL.，Analytical Chemistry，70(16)3419-3425(1998))。在一个实施例中，环氧丙醇丙基-三甲氧基-硅烷((glycidoxypropyl)trimethoxy silane)(GOPS)对玻璃表面具有活性。经过在3′末端添加胺基而变型后再被荧光标识的适体可以和玻璃培养基共价键和。未反应的适体在冲洗时会被洗刷掉，未反应的表面基团也会被阻断。在一个实施例中，未反应的表面基团被0.1M的乙醇胺培养液所阻断。在另一个实施例中，适体同5′端C6胺基标记(C6-aminolinker at the 5′end)粘合用以处理硅石微粒。
另一实施例中，适体通过联结物分子而与载体相粘附。联结物分子被放置在培养基表面。然后适体在一定条件下与联结物分子结合，从而适体通过联结物分子与培养基粘附。
在一特定的实施例中，适体阵列在含有联结物分子的培养基内成形，该联结物分子的远端含有保护基团的功能基团。该阵列的成形方式记载于美国专利5,445,934；5,744,305和5,405,783中，在此作为参考。当联结物分子暴露在适当的条件下(如光、辐射、电场、电流或其他催化剂)，会失去该保护基团而暴露出功能基团。将活化剂作用在特定的联结物分子上时，确定部分的培养基将会被激活。例如，如果在光照下保护基团被除去，培养基的确定区域将被激发，从而激活了这一区域的联结物分子。继而特定种类的适体就可以与这些活性联结物分子相联结。过剩的适体将会丢失而未反应的联结物分子将被阻断。通过这种方式，就产生了含有特定适体的可设定地址的特定区域。培养基内不同离散区域内的联结物分子同样可被活化。第二特定种类的适体就可以粘合在第二离散区域。经过重复这一步骤，在培养基上就可形成含有大量可设定地址的特定区域(该区域内含有已知种类的适体)的阵列。在其他的实施例中，适体可以被直接合成在培养基的活性区域内而不是将事先合成好的适体粘附上去。
适体也可以粘合在悬浮于溶液中的载体上。例如，适体粘合在微珠上并悬浮于缓冲溶液中。在一实施例中，微珠悬浮于容器内(如微量滴定盘)，每一容器内的微珠含有同种类的适体。在这种情况下，只检测一个被分析物就可以同时分析多个样品。另一实施例中，每一容器内的微珠含有的适体不同种类，用于测定不同种类的被分析物。另一实施例中，每一容器内的微珠含有的适体不同种类，用于确定一个或多个不同种类的被分析物的存在。
确定样品中相关被分析物存在性是通过测定附着在被分析物与适体的粘合物上的荧光团的荧光各向异性的改变来实现的。在没有被分析物的空白试验中测量荧光各向异性的基准线，随后，向样品中加入适体再次测量荧光各向异性，通过荧光各向异性的改变来确定是否有被分析物存在。或者，荧光各向异性的基准线也可以通过测定未附着样品的涂有适体的载体的平行试验来确定。
激发偏振器的位置决定了荧光的强度。偏振光可激发粘合在适体上的荧光团，任何现有技术已知的激发源都可应用。例如，氙弧灯的光线可被偏振并聚焦于特定的区域。另一实施例中使用的是激光激发源，从而省去了偏振激发。
荧光测量法可以是现有技术中已知的任何方法，如单路测定以及T型或L型直角，或利用荧光光度计(如市场上可购得的SPEX(美国新泽西州)公司的Flurolog-3TM仪器)进行几何学上的正面散射收集。参见Lakowicz，″Principles of Fluorescence SPECTROSCOPY，″P.111-153，Plenum Press，NewYork，New York(1986)和Potyrailo et al.Anal.Chem.703419-3425(1998)。
典型的用于测定荧光各向异性的仪器包括激发源，可透过特定波长光波的过滤器，使光线偏振的偏振片，用于将激发光聚焦于适体(如培养基上可设定地址的特定区域)的透镜等。在一实施例中使用的是激光，基于激光的特性，该实施例省去了偏振片和透镜。
该仪器还可以有样品舱，一个或多个用于偏振激发光线的散射偏振器，可透过特定波长光波的过滤器，以及用于收集和测定散射光数量的探测器。
荧光各向异性产生于荧光偏振，它表征了荧光团的平均角位移，而这又在吸收并散射光子时发生。
荧光各向异性(FA)可以通过测量散射强度(I)计算出来，公式为FA＝(Ivv-GIvh)/(Ivv+2GIvh)(I)此处的G是仪器修正因子，G＝Ihv/Ihh，下标v和h分别指偏振器的垂直和水平方向。
在一个实施例中，测量的条件是在25℃下探测1秒钟。
通过测定粘合在被分析物上被荧光标识的适体荧光各向异性随时间而变化的情况可以测定粘合在适体上的被分析物的反应动力学规律。
由于该方法的高灵敏度，可以用于测定样品中的微量被分析物。如，适体中1到10pM范围的被分析物都可被检测到。
微珠阵列适体的阵列可用来确定样品中是否存在一种或多种被分析物。本发明的一方面中，阵列中含有固定在培养基表面上的适体。一个实施例中，与被分析物相应的被标识的特定适体同微滴或微珠相粘合。该微珠继而形成阵列用以测定一种或多种被分析物。参见Walton et al.Analytic.Chem.742240-2247(2002)；Zhou et al.Trends in Biotech.19S34-S39(2001)；WO02/24959；WO00/50903；WO00/61803以及美国专利5,340,422和6,074,609。
附有适体的微珠可以以自由态存在于溶液中，或物理地附着或粘合于培养基。当它们以自由态存在于溶液中时，荧光各向异性可用串流细胞仪来测定；如果微珠是附着在载体或培养基表面上时，它们会附着在特定的位置从而形成具有一个或多个可设定地址的特定区域的阵列。
“微滴”或“微珠”是细小的个别微粒。由于微珠通常是几何球面，它们的形态可能不规则。一个实施例中，不规则的尺寸和形态确定了某一含有特定适体的微珠。通常微珠的直径在1微米到10微米之间。或者，微珠的直径可以在10纳米到1毫米之间甚或10纳米到100微米。微珠可以是任何能与适体相粘合的材料，包括但不局限于塑料，玻璃，陶瓷，金属，纤维素，尼龙或乳胶。
单一微珠上的适体并不受任何局限。通常每一微珠含有至少105个适体。每一微珠上可能含有单一种类的适体，也可以含有超过一种适体。这将很有用处，例如，如果待测样品中含有至少一种化合物时，没有必要去弄清楚是存在哪一种特定物质。在另一实施例中，每一微珠内含有不同种的适体，每种适体含有不同的荧光团，这种方式下，每一微珠都能够用于测定多种被分析物。
适体可以直接合成在微珠上，或者随后借助联结物分子而粘附在微珠上。例如，微珠的表面可以利用化学活性基团(如硫醇或胺)进行修正以使适于粘附适体。该修正技术是现有技术中已知的。适体可在粘附于微珠之前或之后再被荧光标识。
含有适体的微珠可用于检测样品中一种或多种被分析物的存在性。含有适体的微珠也可附着在载体上。通常微珠置于容器内的溶液中，如试管或微滴定盘。
微珠阵列可用于测定样品中的单一被分析物。此时，阵列中的所有微珠都是同一种类，因而通常是同一种类适体的衍生物。
在一个实施例中，微珠和与被分析物相应的特定的经荧光标识的适体标识后，放置于容器中(试管或微滴定盘)的溶液内。加入足够数量的含有适体的微珠以激发出可探测到的信号，溶液中通�：兄辽�106个微珠，然后向溶液中加入待分析样品。分别在加入样品前后按上述方法测量荧光各向异性。如果加入样品后荧光各向异性发生变化则表明样品中含有被分析物。
如果需要检测多个样品中是否含有同一被分析物，将会用到大量容器。可以使用许多单个容器(如小试管)。或者，各个容器可以联结在一起以方便处理，如可使用多位微滴定盘。在一个实施例中，多位滴定盘的每一位置内的溶液中都含有同样种类的含适体的微珠，接着在每一位置加入一种样品。分别在加入样品前后测量每一样品的荧光各向异性，如果加入样品后荧光各向异性发生变化则表明该样品中含有相应的被分析物。
含有结合有适体的微珠阵列也可用于确定样品中是否含有一种或多种被分析物。在该实施例中，微珠内含有大量的各种不同种类的适体，适体的数量等于或大于待检测的被分析物的数量。
通常，各种存在的被分析物的同一性是重要的。因而确定每一位置上微珠内适体的种类是必要的，从而可以区分与其粘合的各种不同被分析物。这可以通过向阵列中放置已知适体的微珠来实现。或者，微珠可以随机地分配于阵列中，在阵列成形后再测定阵列中个别微珠的特定位置。这可以用现有技术中的已知方法来完成。例如，微珠可以用荧光团、条形码或红外标记进行编码。在一个实施例中，和特定适体互补的被荧光标识的寡核苷酸可用于确定含有该适体的微珠的准确位置。
在一个实施例中，阵列可用于测定样品中两种或以上被分析物的存在。先准备好特定于每一种类被分析物的含适体的微珠。不同种类的这种微珠被分别放置于容器内，因而每一容器内仅含有一种含特定于被分析物适体的微珠。在一个实施例中，将含适体的微珠置于微滴定盘的井内的溶液中，标注盛有特定种类含适体微珠的井的位置，然后将相应的特定样品加入到上述每一井中，随后分别在加入样品前后测量每一样品的荧光各向异性，通过比较各个结果(即是被标定位置的特定的含适体微珠的荧光各向异性的变化)就可以确定样品中是否含有被分析物。
在另一实施例中，含有适体的微粒被物理地附着在培养基上而形成二维阵列。附着时，含有同种适体的微珠在可设定地址的特定区域内集中在一起，不同种类的微珠被以放置于微滴定盘的不同井内的方式物理隔离。或者，不同类的微粒也可被空间隔离。标记或确定每一特定于微珠的被分析物的位置。样品和微珠相联结，测量阵列中可设定地址的特定区域内荧光各向异性的变化。确定发生荧光各向异性变化的可设定地址的特定区域就可以确定该区域的样品内是否含有该阵列位置上特定于该适体的被分析物。
另一实施例中，不需要测定被分析物特有的同一性就可以确定样品中是否存在一组被分析物中的一种或多种。此时，不必要将阵列内的微珠分隔，阵列中同种微珠聚集在一起的区域会产生增强的信号，从而可以方便地测定出少量被分析物的存在。
非微珠阵列在非微珠阵列情况下，适体直接排列在用于测定被分析物的培养基表面上。非微珠阵列记载于美国专利5,445,934，5,405,783，5,744,305和6,365,418。利用现有技术中的已知方法即可以将适体通过联结物附着在培养基上。或者，适体也可直接在培养基上合成。
通常的阵列中，一个培养基上含有一个或多个可设定地址的特定区域的适体。可设定地址的特定区域可以相互直接相邻或通过缝隙或阻隔物理隔离。在一个实施例中，可设定地址的特定区域被充分隔离，从而激发某一特定区域来测定荧光各向异性时就不会激发到相邻的区域。因此，如果待激发的区域小于可设定地址的特定区域，这些区域就可以相互相邻而不必分隔。另一方面，如果待激发的区域的大小大于可设定地址的特定区域，则需要足够的空间来隔离以防止重叠激发。
通常，每一可设定地址的特定区域包括一种适体。而在一个实施例中，至少一个可设定地址的特定区域包括超过一种适体。该方式是有用的，例如在确定多个被分析物中的一个存在时，并不关心特定分析物的识别。或者，可使用一组适体实现多丛被分析物检测，其中每一适体在相同位置附着不同荧光团。每一荧光团具有不同的光谱特性，以区分多种附着的被分析物。
在其他实施例中，每一可分析地址的特定区域包括单一种类的适体。此时，在适体阵列上的位置的数量至少与使用的不同种类适体的数量相同，从而至少与被检测的被分析物的数量相同。例如，若待检测的样品中存在十个被分析物，则在培养基上至少需十个可设定地址的特定区域。可设定地址的特定区域不受任何限制，而由待检测的被分析物的数量以及阵列形成的培养基的物理尺寸确定。在一个实施例中，每一可设定地址的特定区域包括至少约105个适体。
通常，每一可设定地址的特定区域的适体组合物和位置是已知的。在一个实施例中，阵列中每一可设定地址的特定区域含有不同种类的适体。例如，如有十个待检测的被分析物，阵列中就有十个可设定地址的特定区域，每一区域内的适体种类各不相同。另一实施例中，至少一个可设定地址的特定区域含有一种特定的适体。
阵列内适体的可设定地址的特定区域可以是任何几何形状。例如，该区域可以是圆形、矩形、正方形或不规则形状。通常选择适当的形状以利于适体在培养基上的附着以及荧光各向异性的测定。
阵列的整体尺寸不受限制并决定于各种因素，包括每一可设定地址的特定区域内适体的数量，可设定地址的特定区域的数量，由于用于检测荧光各向异性变化的系统导致的培养基尺寸大小的物理约束。在一个实施例中，所有可设定地址的特定区域阵列在培养基上的所占的面积不大于100cm2；另一实施例中，所有离散阵列在培养基上的所占的面积不大于10cm2。
在测定样品中被分析物的存在性的时候，样品是和含有适体的阵列相联结的。在和样品联结的前后，每一可设定地址的特定区域的适体都能各自地被偏振光所激发，其中任何的荧光各向异性变化都可被测定。如果某一可设定地址的特定区域适体的荧光各向异性的改变被测量到，则样品中存在的与该特定种类适体相对应的化合物就可被检测出来。
示例性应用该分析样品中是否存在特定被分析物的方法在众多领域有广泛用途，如医药行业、基础生物学研究、制药行业、农业、环境科学、工业分析的蛋白质体学等。
在另一实施例中，本发明中的阵列可用于诊断设备。在一实施例中，该阵列被用于确定某种疾病或疾病阶段与特定蛋白质的表征水平之间的关系。更有一个实施例，在确定或已知某种疾病或疾病阶段与特定蛋白质的表征水平之间的关系后，本发明中的阵列可用于诊断生物体是否感染某种特定的疾病或处于疾病的某一阶段。相应地，在某一实施例中，本发明通过从确诊病人体内获取与该病症相关的被分析物而提供了一种该病症的诊断方法。例如，某病人被怀疑患上肿瘤，本发明中的方法就可用于检测样品中是否含有已知肿瘤细胞(而非正常细胞)的一种或多种表征蛋白质。同样，如果某病人被怀疑接触了传染性物质，就可以检测与该传染物质相关的蛋白质，例如，如果某病人被怀疑感染了HIV，就可以检测样品中是否含有与HIV相关的蛋白质，如GP120MN。
确定并合成出与挑选的被分析物特定相关的适体，适体被荧光标识后附着在阵列中的载体上以用于检测被分析物。以上述方法测定适体的荧光各向异性之后，将适体与从病体取来的样品相联结，如果与样品相联结的特定适体的荧光各向异性发生变化，则表明样品中含有与该特定适体相关的被分析物。
同样，本发明的分析方法可用于评价对被病体的治疗效果。例如，在对病体治疗前后通过检测病人的生物样品中是否含有与病症相关的特定的被分析物，就可以得知某一特定资料方法的效果。
另一实施例中，该发明提供了一种比较两个或以上细胞或细胞群内特定蛋白质表征的方法。该方法包括对样品(如有机体内表征物或其片断的一个或多个细胞)中的多种不同蛋白质进行平行分析。将表征本发明适体阵列特定蛋白质的待分析样品进行培养，检测样品中是否含有相应的蛋白质和/或其含量。该方法中还可以有附加步骤表征出与阵列中至少一种适体相粘合的蛋白质的特性。此外还可以检测被分析物而不是蛋白质的存在，如代谢物。
该方法可以比较细胞或细胞群蛋白质的表征方式，在各种随机情况下，某种控制细胞或细胞群蛋白质的表征方式。例如，可用于比较癌细胞和控制细胞(群)的不同蛋白质表征方式。再例如，不同的状况可以是将某种细胞(群)进行病毒感染，对细胞(群)进行紧张性刺激，或对细胞(群)施以药物，例如潜能性治疗(potential therapeutic)。在这种比较中，将含有表征物质(或其片断)的第一种细胞(群)的样品与适体阵列在适合蛋白质粘合的条件下进行培养，同样，将含有表征物质(或其片断)的第二种细胞(群)的样品与第二种适体阵列(和第一种适体阵列一样)一起进行培养。通过对第一种荧光标记的适体粘合物进行荧光各向异性变化测定而确定出其蛋白质的种类，再与相应的第二种蛋白质种类进行比较。
这种比较两种细胞(群)的不同蛋白质表征的方法可用于潜在的新型药物靶点(drug target)的确认以及药物筛选(drug screening)。特别是，该方法可用于确定在某种疾病下细胞(如肿瘤细胞而非普通细胞)中的蛋白质是否过渡表征，这样的蛋白质将成为药物干涉的目标，如对这些不同表征的蛋白质施加抑止剂。
本发明中对该适体的分析还可用于评估某种特定药物的效果和特异性。例如，处于特定药物环境下的细胞(群)中的特定蛋白质的表征方式可以与没有处于特定药物环境下的细胞(群)中的特定蛋白质的表征方式相比较。
另一实施例中，该阵列可被用于确定某种疾病或疾病阶段与特定蛋白质表征之间的关系。
本技术领域的专业人员对本发明所描述的方法能够毫无困难地进行特殊应用。
实施例下述例证仅用于解释本发明而并不能以任何方式限制本发明的范围。
本说明书所引用的专利和参考文献是指其整体。
实施例一A.一种粘合在含适体微珠上的蛋白质的分析方法粘附在特定蛋白质上带有染料标记的适体其偏振各向异性随着时间而改变。对三种键合在载体上的这种适体的荧光各向异性的变化情况进行了测量。
本实验所用的三种荧光标识适体分别是从人体血浆提取的特定抗凝血酶适体(FAM标识，15mer)，特定于HIV-1蛋白质GP120MN的518适体(FAM标识，60mer)，以及特定于人类重组细胞碱性蛋白FGF的650适体(FAM标识，60mer)。
1.用于凝血酶的抗凝血酶适体对凝血酶和FAM标识的抗凝血酶适体粘合物进行测量。将购至于邦斯(Bangs)实验室(俄亥俄州，美国)的5毫米硅石微粒在100℃1N的NaCl溶液中预处理1小时，接着将硅石微�：�3-胺基丙基三乙氧基硅烷(APTES；西格马(Sigma)，美国)一起处理30分钟，再用200标准强度的酒精稀释至10mM。反应完成后，用酒精冲洗微粒3次再于60℃下置于Vacufuge(Eppendorf，德国)中通宵烘干。烘干后的硅烷化微粒在40℃下在DMF内用10mM的Bis(thiopropyl N-hydroxy succinidimyl)溶液(Sigma，美国)处理30分钟，接着用酒精和DMF迅速冲洗。15mer的5’端C6-氨基链和3’端FAM的抗凝血酶适体用AB1340合成器合成而得，并经高性能液体色谱(HPLC)纯化。10毫克的活性硅石微珠和硅烷以及NHS连同100Elm的适体在4℃下培养12小时。样品经冲洗后真空干燥。
在偏振实验中，100mg/ml的粘附有FAM标识的抗凝血酶适体的微珠的磷酸缓冲溶液(PBS)在环境条件下放置于160微升的石英试管中。试管置于SPEX Flurolog荧光计(新泽西州，美国)进行偏振测定。实验过程中在样品中混入一小块磁激发条。向含适体微珠溶液中添加不同浓度的被分析凝血酶。在实验过程中记录不同时刻的偏振或各向异性值。
2.相应于GP120MN蛋白质的518适体本实验测定GP120MN蛋白与粘附有518适体的微珠的粘合体。5’端C6-氨基链和3’端FAM的518适体用AB1340合成器合成而得。接着被标识的适体经HPLC纯化。活性硅石微珠以上述方法制成并用100纳米被标识的518适体在40℃下处理12小时。样品经冲洗后真空干燥。
含有经FAM标识的518适体的微珠与GP120MN蛋白的粘合物的偏振实验同上述方法一致。
3.相应于人体重组细胞FGF碱性蛋白的650适体本实验测定人体重组细胞FGF碱性蛋白与粘附有650适体的微珠的粘合体。5’端C6-氨基链和3’端FAM的650适体用AB1340合成器合成而得并经HPLC纯化。活性硅石微珠以上述方法制成并用100纳米被标识的650适体在40℃下处理12小时。样品经冲洗后真空干燥。
含有经FAM标识的650适体的微珠和人体重组细胞FGF碱性蛋白的粘合物的偏振实验同上述方法一致。
B.蛋白质与含适体微珠粘合物的实验结果对上述蛋白质与附着有5微米适体微粒的粘合物进行荧光各向异性测定。该分析所用的是附着在硅胶微粒上的3’端FAM标识的5’氨化抗凝血酶。附着有适体的凝血酶置于凝血酶蛋白质中，再测定荧光各向异性的变化情况。加入100nM的凝血酶后观测到了各向异性的增大(如图1)。这种变化类似于对含有凝血酶和凝血酶适体的粘合物溶液的观测结果。在对非特异性溶解酵素粘合物、各种非特异性阳离子蛋白质适体的粘合物的分析中也观测到同样的结果(图1)。
518适体(60mer)是与GP120MN(HIV-1)蛋白质相特定的。添加100nM的GP120后，观测到荧光各向异性有大幅的增加(图2)。该增加显著大于并明显区别于向非特定粘合物中添加1mg/ml的BSA或100nM的凝血酶的荧光各向异性测定结果。同时也观测了溶解酵素与含FAM-518适体微珠的粘合体(图3)。溶解酵素与FAM-518适体的粘合物在添加0.5％SDS的情况下是可逆的(图4)。
权利要求
1.一种测定样品中被分析物的方法，其特征在于，含有以下步骤(a)在样品上联结绑定有荧光团标识适体的载体；(b)用偏振光激发所述适体；(c)测量荧光团的荧光各向异性；并(d)当所测定的荧光各向异性大于没有样品的空白试验所测量的各向异性时，就可以确定被分析物是否存在或含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体是微珠。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微珠是硅石微珠。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微珠的直径在1微米到10微米之间。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述微珠的直径约为5微米。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微珠悬浮于溶液中。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微珠呈二维阵列分布。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述适体含有10到100个核苷酸。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，标识所述适体的荧光团从荧光素衍生物，四溴荧光素衍生物，香豆素衍生物或玫瑰精衍生物中选出。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述适体是经羧基荧光素标识。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述适体是一个适体阵列中的一部分。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述阵列中含有两个或两个以上可设定地址的特定区域。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，每一可设定地址的特定区域内含有单一种类的适体。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，每一可设定地址的特定区域内含有多个种类的适体。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，每一适体标识有具独特光谱特性的荧光团。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述偏振光是激光。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述被分析物与一种病症有关。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品是从被怀疑患有某种病症的病人采集而得。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述被分析物是蛋白质。
20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述被分析物是代谢物。
21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品采集于人体而被分析物与一种病症相关。
全文摘要
本发明涉及通过测量由于被分析物与特定适体结合而产生的荧光各向异性来检测样品中的一种或多种被分析物的方法。所述适体固定于载体，并可以为阵列形式。
文档编号G01N21/76GK1672050SQ03818456
公开日2005年9月21日 申请日期2003年7月28日 优先权日2002年8月2日
发明者迈克尔·M·塞克, 劳伦斯·格林菲尔德 申请人:美国艾培拉公司
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