专利名称：乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的检测方法
技术领域：
本发明涉及分离、检测技术领域，尤其是一种高效液相色谱分离、气相色谱检测乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的方法。
背景技术：
母乳是婴儿成长最好的食物，但是，因各种原因不能母乳喂养或母乳供应不足以及婴儿在6个月以后和断奶期需要增加辅食的情况下，婴幼儿配方乳粉成为可供选择的最
佳食品之一。人乳中最重要的饱和脂肪酸棕榈酸，大约有70%是酯化在Sn-2位上。而牛乳以及绝大多数市场上销售的婴幼儿配方奶粉中所用的植物油脂里的棕榈酸则是连在Sn-I或 Sn-3位上(Sn-2上的量少于20% )，这种甘油三酯中的棕榈酸会在小肠内被胰脂肪酶水解， 形成游离态脂肪酸，并与钙元素结合生成钙皂，造成婴幼儿体内存在大量供能物质棕榈酸以及钙元素的流失。因此，如何通过调整配方乳粉中Sn-2位棕榈酸的含量，以使以牛乳为基础原料的婴幼儿配方乳粉更加适合宝宝食用成为当前国内外各大婴幼儿乳粉生产企业的主研课题。目前，国内外许多研究机构开展了大量的关于甘油三酯Sn-2位脂肪酸检测技术的研究工作。基本步骤都是采用酶或化学试剂对甘油三酯进行部分水解，然后用薄层色谱法(TLC)分离纯化，直接或衍生后用气相色谱(GC)測定。国内的赵海珍、赵玉生等则是分别采用高效液相色谱法和超高效液相色谱法分别对猪油甘油三酯和双低菜籽油/结构脂质的脂肪酸位置分布进行了測定，但在測定Sn-2位上的脂肪酸組成时却是通过间接方式计算而得，而不是将单甘酯直接或衍生后用气相色谱进行測定，影响了结果的准确性。由于这些方法多是对于动、植物油的甘油三酯脂肪酸組成的測定，对乳粉甘油三酷中Sn-2位脂肪酸组成测定的报道很少。因此，开展乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸检测方法的研究工作，对提高我国的婴幼儿乳品品质，加强监督有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高效液相色谱分离、气相色谱检测乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的方法，灵敏度高，稳定性好。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的检测方法，包括如下步骤A、乳粉脂肪的提�。籅、脂肪酶水解上步所得乳粉脂肪；C、上步所得水解产物经高效液相色谱进行分离，收集单甘脂；D、上步所得单甘脂进行甲酯化衍生处理，获取衍生产物；Ε、气相色谱检测上步所得衍生产物，測定乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的含量。作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，采用IS014156法提取乳粉中的甘油
作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，按重量计，取步骤A所得乳粉脂肪100 份置于离心管中，加入胰脂肪酶(15 邪)份，再加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液，小心摇动， 然后加入胆酸钠溶液和CaCL2溶液，盖上塞子小心摇动，并立即将离心管放入38°C 40°C 恒温水浴锅中，震动反应5min 8min，立即加入盐酸和ニ氯甲烷，然后盖上塞子并再次用振荡器剧烈震�。詈罄胄姆掷�、吸取ニ氯甲烷层并用滤膜过滤到高效液相色谱进样瓶中。作为本发明的一种优选技术方案，步骤C中高效液相色谱的分离条件为，色谱柱 键合氨丙基的氨基柱；流动相按体积计30 60份的乙腈和40 70份的ニ氯甲烷；流速 (0. 8 1. 2)mL/min ；检测器采用蒸发光散射检测器，漂移管温度为60°C 90°C。作为本发明的一种优选技术方案，步骤C中，先在色谱柱上用棕榈酸单甘油酯标样，记下单甘油酯的保留时间，再分析步骤B处理好的样品，在到达单甘油酯的保留时间吋，打开制备阀门，收集洗脱液。作为本发明的一种优选技术方案，步骤C中，所述乙腈当中含有0.05% 0. 12% 体积比的冰乙酸。作为本发明的一种优选技术方案，步骤C中，所述键合氨丙基的氨基柱为 HyperSil NH2、Zorbax NH2, InertSil NH2 中的ー种。作为本发明的一种优选技术方案，步骤D中，向单甘油酯中加入正己烷和(1. 0 2. 5)mol/L的氢氧化钾甲醇溶液，混勻、离心，其中的Sn-2位单甘酯完全甲酷化，收集上清液；其中，氢氧化钾甲醇溶液与步骤A中乳粉脂肪的体积重量比为(300 650)uL IOOmgo作为本发明的一种优选技术方案，步骤E中，吸取上步所得上清液于气相色谱进样瓶中，气相色谱的分析条件为采用程序升温，初始温度为100°c 140°C开始，保持 4min 8min，以(3 10) "C /min升至220°C 260°C，保持IOmin 20min ；载气为高纯氮气；载气流速为(0. 8 1. 4)mL/min ；分流比为(20 30) 1 ；气化室温度为240°C 2800C ；FID检测器温度为260 300°C。作为本发明的一种优选技术方案，步骤E中，所述气相色谱柱色谱柱的规格为 SP-2560, IOOmX 0. 25mm, 0. 20 μ m。采用上述技术方案所产生的有益效果在于參看附图，本发明先采用液相色谱进行预分离，再进行液相色谱分析检测，排除杂质干扰，大大提高了检测的灵敏度，可以实现对乳粉中Sn-2位脂肪酸含量的高效检測，
图1 是本发明第一实施例中的酶解产物在高效液相色谱氨基柱上的分离图谱，图中，峰a是分离出的sn-2单甘酯；图2是甲酯化衍生物在SP-2560，IOOmX0. 25mm, 0. 20 μ m毛細管气相色谱柱上的分离图谱，图中，峰a是分离出的sn-2棕榈酸甲酷。传统的薄层层析检测法需要耗费数个小吋，后期还需要烘干等步骤，操作也十分繁琐；本发明采用色谱柱进行分离、检测，时间大大缩短，操作步骤也十分简易。本检测方法稳定性极高，利用其检测乳粉中甘油三酯的Sn-2位脂肪酸含量，重现性达到RSD ^ 5%，下表是同一样品sn-2位棕榈酸占sn-2总脂肪酸的百分比10次检测结果及RSD
权利要求
1.乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的检测方法，其特征在于包括如下步骤A、乳粉脂肪的提�。籅、脂肪酶水解上步所得乳粉脂肪；C、上步所得水解产物经高效液相色谱进行分离，收集单甘脂；D、上步所得单甘脂进行甲酯化衍生处理，获取衍生产物；Ε、气相色谱检测上步所得衍生产物，測定乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的含量。
2.根据权利要求1所述的乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的检测方法，其特征在于步骤A中，采用IS014156法提取乳粉中的甘油三酷。
3.根据权利要求1所述的乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的检测方法，其特征在于步骤B中，按重量计，取步骤A所得乳粉脂肪100份置于离心管中，加入胰脂肪酶(15 25) 份，再加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液，小心摇动，然后加入胆酸钠溶液和CaCL2溶液，盖上塞子小心摇动，并立即将离心管放入38°C 40°C恒温水浴锅中，震动反应5min 8min，立即加入盐酸和ニ氯甲烷，然后盖上塞子并再次用振荡器剧烈震�。詈罄胄姆掷�、吸取ニ氯甲烷层并用滤膜过滤到高效液相色谱进样瓶中。
4.根据权利要求1所述的乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的检测方法，其特征在于步骤C中高效液相色谱的分离条件为，色谱柱键合氨丙基的氨基柱；流动相按体积计30 60份的乙腈和40 70份的ニ氯甲烷；流速(0. 8 1. 2)mL/min ；检测器采用蒸发光散射检测器，漂移管温度为60°C 90°C。
5.根据权利要求4所述的乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的检测方法，其特征在于步骤C中，先在色谱柱上用棕榈酸单甘油酯标样，记下单甘油酯的保留时间，再分析步骤B处理好的样品，在到达单甘油酯的保留时间时，打开制备阀门，收集洗脱液。
6.根据权利要求4所述的乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的检测方法，其特征在于步骤C中，所述乙腈当中含有0. 05% 0. 12%体积比的冰乙酸。
7.根据权利要求4所述的乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的检测方法，其特征在于步骤C中，所述键合氨丙基的氨基柱为HyperSil NH2^Zorbax NH2、InertSil NH2中的ー种。
8.根据权利要求1所述的乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的检测方法，其特征在于步骤D中，向单甘油酯中加入正己烷和(1. 0 2. 5)mol/L的氢氧化钾甲醇溶液，混勻、离心， 其中的Sn-2位单甘酯完全甲酷化，收集上清液；其中，氢氧化钾甲醇溶液与步骤A中乳粉脂肪的体积重量比为(300 650)uL IOOmg0
9.根据权利要求1所述的乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的检测方法，其特征在于 步骤E中，吸取上步所得上清液于气相色谱进样瓶中，气相色谱的分析条件为采用程序升温，初始温度为100°C 140°C开始，保持^iin 8min，以(3 10) °C /min升至220°C 260°C，保持IOmin 20min ；载气为高纯氮气；载气流速为(0. 8 1. 4)mL/min ；分流比为 (20 30) 1 ；气化室温度为240°C 280°C ；FID检测器温度为260 300°C。
10.根据权利要求9所述的乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的检测方法，其特征在于 步骤E中，所述气相色谱柱色谱柱的规格为SP-2560，IOOmX0. 25mm,0. 20 μ m。
全文摘要
本发明公开了一种乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的检测方法，包括如下步骤A、乳粉脂肪的提�。籅、脂肪酶水解上步所得乳粉脂肪；C、上步所得水解产物经高效液相色谱进行分离，收集单甘脂；D、上步所得单甘脂进行甲酯化衍生处理，获取衍生产物；E、气相色谱检测上步所得衍生产物，测定乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的含量。本发明提供的检测方法，灵敏度高、稳定性好。
文档编号G01N30/06GK102539604SQ201110447958
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者张天博, 房新平, 李志钧, 李朝旭, 翟红梅, 贾云虹, 贾树妍 申请人:河北三元食品有限公司
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