专利名称：在非竞争性免疫测定中减少白细胞干扰的制作方法
技术领域：
本发明涉及在用于利用非竞争性免疫测定法测定分析物在血液样品中的存在或浓度的装置和方法中减少或消除来自血沉棕黄层(buffy coat)组分、特别是白细胞的干扰。具体地，本发明涉及通过用受调理素作用的消耗珠(sacrificial bead)和类似地受调理素作用的组件修正(amend)血液样品来减少或消除白细胞免疫传感器干扰。
背景技术：
为了诊断、筛选、疾病分期、法医分析、妊娠测试、药物检测以及其它原因，会对生物样品进行许多目标分析物的实验室免疫测定测试。虽然少数定量测试例如妊娠测试已被简化成用于患者在家中使用的简单试剂盒，但大部分定量测试仍然需要经训练的专业技术人员在实验室环境中使用复杂仪器进行。实验室测试增加了分析成本并且延迟了结果。在许多情况下，延迟可能对患者的病况或预后(例如表示心肌梗塞和心力衰竭的标志物的分析)有害。在此类和类似危急情况下，有利地是在及时现场护理(point-of-care)时准确、便宜地并且以最短延迟进行此类分析。许多类型的免疫测定装置和方法已进行了描述。一种用于成功地测量血液样品中的分析物的一次性传感设备由Lauks在美国专利No. 5，096, 669中公开。其它设备由Davis等人在关于凝血时间的美国专利No. 5，628，961和5，447，440中公开。这些设备使用读数装置和适合读数装置的筒(cartridge)以测量作为时间函数的血液样品中分析物的浓度和粘度的改变。将美国专利Nos. 5，096，669,5, 628，961和5，447，440通过引用整体并入本文。US 20060160164描述了利用免疫参考电极的免疫测定设备，US 20050054078描述了利用改进的样品封闭(sampleclosure)的免疫测定设备，US 20040018577描述了多重杂交免疫测定(multiple hybrid immunoassay), US 20030170881 (授权为 US 7，419，821)描述了用于分析物测量和免疫测定的装置和方法，全部所述专利是共同拥有的并且通过引用并入本文。非竞争性两位点免疫测定法(Non-competitivetwo-site immunoassay)(也称为夹心型免疫测定法)通常用于测定生物测试样品中的分析物浓度，用于例如由AbbottPoint of Care Inc.开发为i-Stat 系统的及时现场分析物检测系统。在典型的两位点酶联免疫吸附测定(ELISA)中，将一种抗体结合至固体载体上以形成固定或捕捉抗体，并且将第二种抗体缀合至或结合至信号产生性试剂例如酶以形成信号或标记抗体。在与包含待测量的分析物的样品反应后，分析物被“夹”在固定抗体与信号抗体之间。在清洗掉样品和任何非特异性结合的试剂后，测量保留在固体载体上的信号抗体的量，该量应当与样品中的分析物的量成比例。电化学检测也已被用于免疫测定，在所述电化学检测中分析物的结合直接或间接引起与电极相邻的电活性物质种类的活性改变。关于电化学免疫测定的综述，参见Laurell等人，Methods in Enzymology,第 73 卷，〃Electroimmunoassay〃，Academic Press, NewYork, 339，340, 346-348(1981)。在电化学免疫传感器中，分析物与其同源抗体的结合产生了电极上的电活性物质种类的活性改变，所述电极处于适当的电化学电势下以引起电活性物质种类的氧化或还源。存在许多用于满足这些条件的设置。例如，可将电活性物质种类直接附着至分析物，或可将抗体共价地连接至从无电活性底物产生电活性物质种类或破坏电活性底物的酶。参见，M. J. Green(1987)Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 316 :135-142。差分安培测量(differentialamperometrie measurement)的概念在电化学领域是公知的。参见，例如，共同拥有的Cozzette美国专利No. 5，112，455，通过引用整体并入本文。此外，差分安培传感器组合的形式公开于共同拥有的Cozzette美国专利No. 5，063，081。该专利还公开了选择性渗透层用于电化学传感器的用途以及成膜乳胶用于固定生物活性分子的用途，通过引用并入本文。聚(乙烯醇)(PVA)在传感器制造中的用途描述于美国专利No. 6，030，827 (通过引用并入本文)。Vikholm (U. S. 2003/0059954A1)教 导了直接连接至具有生物分子排斥涂层例如PVA的表面、抗体之间空隙中的表面的抗体，Johansson (美国专利No. 5，656，504)教导了具有固定在其上的抗体的固相例如PVA。美国专利No. 6，030, 827和6，379，883教导了用于形成聚(乙烯醇)层的方法，所述专利通过引用整体并入本文。如在本领域内是公知的，免疫测定易遭受各种形式的干扰。例如共同拥有的在审的美国申请12/411，325阐述了通过将IgM包括在IgG试剂混合物中来减小嗜异性抗体的干扰。将‘325申请通过引用整体并入本文。随着免疫测定技术不断地被改造以适合进入及时现场护理测试市场，将全血用作测试介质相对于血浆和血清已得到增加，血浆和血清通常用于中心实验室测试。这显然意味着红细胞和血沉棕黄层成分(例如白细胞和血小板)存在于测定介质中。已发现在某些测定中，可针对白细胞有效地对不同的测定组分例如珠子和电极表面进行调理作用。注意，对于电极表面，为了基于超氧离子的电化学检测而观察人嗜中性粒细胞的呼吸爆发，Hill 等人(FEBS 191，257-263，1985)利用人 IgG 对微伏安电极(microvoltammetricelectrode)进行调理作用。先前提及的US 20060160164( ‘ 164申请)论述了电化学免疫传感器和全血与血浆之间的偏差(bias);以及，标志物例如肌钙蛋白等的免疫测定通常被测量和报告为血浆或血清值。其提及当将这些免疫传感器用于分析全血时，需要使用用于消除偏差的校正因子或方法。其说明该偏差的某些方面可被消除，包括与血沉棕黄层(其由白细胞和血小板组成)的组分相关的全血电化学免疫测定中的偏差，以及还有与样品之间的血细胞比容(hematocrit)差异相关的偏差。本领域技术人员公认血沉棕黄层是当将血液离心时在红细胞上方形成的一层白细胞和血小板。在‘164申请中，还观察到在具有涂覆了分析物抗体例如肌钙蛋白抗体的珠子的免疫传感器上发生白细胞干扰。对照实验显示该正偏差不存在于血浆样品和其中已除去血沉棕黄层的血液样品中。因此，白细胞似乎能够粘附至免疫传感器并且促进酶标记的抗体的非特异性结合，所述抗体甚至在洗涤步骤后仍然保持结合。在该公开内容中显示该偏差可通过在珠子制备过程中将少量抗体添加至人血清白蛋白来部分消除。因此，当样品与修饰的珠子接触时，来自样品的白蛋白快速包被珠子，并且一旦它们被一层天然白蛋白包被，白细胞就不应当将珠子识别为受调理作用的表面。‘164申请还描述了对白细胞干扰问题的另一个解决方法，其中通过使血液样品的盐浓度从约140mM的正常钠离子浓度增加至高于约200mM，优选增加至约230mM来消除该偏差。人们相信，解释减少的干扰的机制可能是盐引起白细胞的渗透皱缩。该解释与白细胞受损的与显露的免疫传感器相互作用的能力一致。然而，很明显在至少下列领域仍然需要用于减少白细胞活性在免疫测定中的额外的微小效应的改进的方法(i)免疫传感器干扰，最明显地在及时现场护理测试的情景中，
(ii)电化学免疫测定，(iii)与免疫-参考传感器结合的免疫传感器的使用，(iv)全血免疫测定，(V)基于一次性使用的筒的免疫测定，(Vi)仅使用单一洗涤步骤的非相继免疫测 定,和(vii)干试剂涂层。发明概述本发明涉及用于减少或消除白细胞干扰、尤其是非竞争性免疫测定中的白细胞干扰的试剂盒、筒(cartridge)和方法。根据本发明的不同实施方案，可以通过使用针对白细胞进行了调理作用的消耗珠子来减少或消除白细胞干扰。白细胞优先吞噬所述消耗珠子，从而减少白细胞干扰。例如，在一个实施方案中，本发明是用于对怀疑存在于血液样品中的分析物进行夹心式免疫测定的试剂盒，包括针对白细胞进行了调理作用的消耗珠子、针对分析物的固定的第一抗体和针对分析物的标记的第二抗体。在另一个实施方案中，本发明是用于对怀疑存在于血液样品中的分析物进行夹心式免疫测定的筒，所述筒包括(a)接收血液样品的样品入口 ；(b)用于计量血液样品以形成计量样品的计量室；(C) 一个或多个包含针对白细胞进行了调理作用的消耗珠子和针对分析物的标记的抗体的干试剂涂层；(d)包含针对分析物的固定抗体的电极；和(e)用于将计量样品、流态化的消耗珠子和标记的抗体移至电极的一个或多个泵件。 在另一个实施方案中，本发明是对怀疑存在于血液样品中的分析物进行夹心式免疫测定的方法，包括(a)将怀疑含有分析物的血液样品暴露于针对白细胞进行了调理作用的消耗珠子、针对分析物的固定的第一抗体；和标记的第二抗体以形成包含所述第一抗体、所述分析物和所述第二抗体的复合物；和(b)测定复合的标记物的量。在一个方面，(i)将血液样品与消耗珠子混合，随后与固定的第一抗体混合，随后与标记的第二抗体混合。在另一个方面，在大体上相同的时间将血液样品与消耗珠子、固定的第一抗体和标记的第二抗体混合。在另一个方面，在大体上相同的时间将血液样品与固定的第一抗体和标记的第二抗体混合。在另一方面，在将血液样品与固定的第一抗体混合之前，在大体上相同的时间将血液样品与消耗珠子和标记的第二抗体混合。在另一个实施方案中，本发明是显著减少白细胞在分析物免疫传感器(所述传感器包含固定在电极上的针对分析物的抗体涂覆的珠子)上积累的方法，所述方法包括步骤(a)将怀疑包含分析物的样品与消耗珠子接触以形成修正的样品，其中样品中的白细胞优先吞噬消耗珠子，和(b)将修正的样品与免疫传感器接触。在另一个实施方案中，本发明涉及对怀疑存在于血液样品中的分析物进行免疫测定的方法，包括(a)将怀疑包含分析物的血液样品与过量消耗珠子混合以形成修正的样品，其中样品中的白细胞优先吞噬消耗珠子；(b)将修正的样品与包含固定在电极上的针对分析物的抗体涂覆的珠子的免疫传感器接触，在所述抗体-涂覆的珠子、所述分析物和第二标记抗体之间形成夹心；(C)从所述免疫传感器洗涤所述血液样品；和(d)使用所述免疫传感器测定所述夹心式标记物的量和使所述标记物的量与样品中的分析物的浓度相关联。在另一个实施方式中，本发明是用于对怀疑存在于血液样品中的分析物进行夹心式免疫测定的方法，包括(a)将怀疑包含分析物的血液样品与过量的进行了调理作用的消耗珠子混合以形成修正的样品，其中样品中的白细胞优先吞噬消耗珠子；(b)将修正的样品与针对分析物的抗体涂覆的珠子在有效地在所述抗体涂覆的珠子、所述分析物和第二标记抗体之间形成夹心的条件下接触；(C)从所述抗体涂覆的珠子洗涤所述血液样品；和
(d)测定所述夹心式标记物的量并使所述标记物的量与样品中的分析物的浓度相关联。对怀疑存在于血液样品中的分析物进行免疫测定的测试筒，所述测试筒在导管中包含免疫传感器，所述免疫传感器具有针对分析物的固定的第一抗体，所述导管具有布置在其中的干试剂涂层，所述干试剂涂层包含消耗珠子和针对所述标记物的第二标记的抗体并且被构造为溶解于所述血液样品中。在上述实施方案中，血液样品优选是全血样品，任选地利用抗凝剂修正。分析物优选选自 BNP、proBNP、NTproBNP, cTnl、TnT、HCG, TSH、PSA、D- 二聚体、CRP、肌红蛋白、NGAL,CKMB和髓过氧化物酶。例如，消耗珠子可包含利用非人IgG或其片段涂覆的基底珠子。所述基底珠子可以由选自聚苯乙烯、聚丙烯酸和葡聚糖的材料形成。在一些其它方面，消耗珠子包括利用选自蛋白质、细菌、病毒和异型生物质(xenobiotic)的材料或其片段涂覆的基底珠子。在另一个实施方式中，消耗珠子是经稳定的细菌或细菌孢子。消耗珠子优选具有0. 01 ii m至20 ii m例如0. I U m至5 U m的平均粒度,理想地，以足以提供每微升样品至少104个珠子的溶解的消耗珠子浓度的量存在。消耗珠子和第二标记抗体可以存在于一个或多个可溶解的干试剂涂层中，所述涂层可以例如布置于计量室内。所使用的固定的第一抗体优选附着至传感器，所述传感器选自安培计电极(amp erome trie electrode)、电位测定电极(potentiometric electrode)、电导测定电极(conductimetric electrode)、光波导(optical wave guide)、表面等离子体共振传感器(surface plasmon resonance sensor)、声波传感器和压电式传感器。例如，固定的第一抗体可以连接至测定珠子，然后测定珠子可以连接至安培计电极。任选地，所述标记的第二抗体用选自放射性标记物、酶、生色团、荧光团和化学发光物质种类的标记物标记分析物。标记的第二抗体用酶标记，所述酶优选选自碱性磷酸酶、葡萄糖苷酶、黄递酶、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶。附图概述本发明的这些和其它目的、特征和有利方面描述于下列特定实施方案的详细说明中并且在下列图中进行了显示，其中图I是免疫传感器筒盖的等轴俯视图；图2是免疫传感器筒盖的等轴仰视图3是免疫传感器筒的带垫圈(tape gasket)的布局的俯视图；图4是免疫传感器筒底座的等轴俯视图；图5是免疫传感器筒的布局的图解视图；图6是免疫传感器筒内的流体和空气路径的图解视图，包括用干试剂修正流体的位置； 图7显示包括IgM的电化学免疫传感器的操作原理；图8是未按比例绘制的具有抗体标记的颗粒的电化学免疫传感器的构造的侧视图；图9是免疫传感器筒的电导测定电极和免疫传感器电极的掩模(mask)设计的俯视图；
图10显示包括针对白细胞进行了调理作用的消耗珠子的电化学免疫传感器的操作原理；图11 (a)显示具有正斜率输出信号的BNP筒的意外波形，图11 (b)显示具有负斜率输出信号的BNP筒的意外波形。图11(c)显示对于低分析物浓度具有接近零斜率的正常反应，图11(d)显示仅在高分析物浓度时预期负斜率，其中测量可变成基底限制的而非酶限制的。图12显示在(a)正常样品和(b)异常血沉棕黄样品上进行的洗涤步骤中氧化电极脉冲的效应；图13是电活性物质种类的酶促再生的示意图；图 14 显不区段形成法(segment forming means)；图15是免疫传感器筒的优选实施方案的俯视图；图16是免疫传感器筒的优选实施方案的流控技术(fIuidics)的图解视图；图17(a)和(b)显示在消耗珠子在样品中(a)不存在和(b)存在的情况下在高棕黄(high buffy)样品中的BNP的测定后免疫传感器的显微照片；图18显不具有用于关闭关闭位直(closed position)中的样品进入端口的可滑动密封组件的筒设备；图19显示具有用于关闭开口位置中的样品进入端口的滑动密封组件的筒设备；图20显示在分析过程中发生的信号产生反应(a)利用碱性磷酸酶切割底物以产生电活性对-氨基苯酚和(b)对-氨基苯酚的氧化；图21显示在高棕黄(左图框)和正常全血(右图框)样品中对于免疫传感器斜率的影响的图形数据试剂中掺入了(亚批2和3)和未掺入(亚批I)消耗微粒；图22(a)和(b)显示图17(a)和(b)中的相关免疫传感器的显微照片的分析仪波形；和图23显示不充分的洗漆(poor washing)(不能用分析流体替换传感器结构内的样品流体)对安培计波形的影响。发明详述本发明涉及减少或消除因白细胞的存在而引起的干扰的增强的方式。在优选实施方案中，本发明可用于下列领域的一个或多个领域(i)免疫传感器，最明显地在及时现场护理测试的情景中，(ii)电化学免疫测定，(iii)与免疫-参考传感器结合的免疫传感器的用途，(iv)全血免疫测定，(V)基于一次性使用的筒的免疫测定，(Vi)仅具有单一洗涤步骤的非相继免疫测定和(Vii)干试剂涂层。值得注意地，虽然上述的US20060160164基于在免疫传感器上添加抗人血清白蛋白抗体涂层和向测定介质添加盐解决了与白细胞相关的某些干扰，但本说明书公开了与白细胞相关的偏差的其它来源，提供了用于减少所述干扰的新型解决方法。如将被本领域技术人员理解的一样，此处公开的一般概念适用于许多免疫测定法和平台。本发明允许使用筒快速原位测定分析物，所述筒具有分析物传感器的阵列和用于将修正的样品相继呈递至免疫传感器或分析物阵列的装置。在优选实施方案中，本发明用于经设计利用读数设备来进行操作的筒，例如1992年3月17日授予Lauks等人的美国专利No. 5，096，669或2008年9月2日授予的美国专利No. 7，419，821 (将所述两个专利通过引用整体并入本文)中公开的。本发明在该情景中得到最佳理解。因此，首先描述用于及时现场护理免疫测定系统的适当设备和操作方法，然后描述可使所述系统最好地适合在全血免疫测定中进一步减少或消除白细胞干扰的方法。用于本发明的消耗珠子可用于基于异质或匀质珠子的测定，以及用于非竞争性(夹心)免疫测定或竞争性免疫测定。在优选实施方式中，本发明用于异质的电化学免疫测 定，其是基于在电极表面或附近形成夹心。在另一个实施方式中，本发明用于匀质夹心免疫测定，其在流体介质内。因此，在该情景中，术语“异质的”和“匀质的”是指捕捉步骤。因此，对于匀质测定，捕捉步骤在流体介质中发生，然而在异质测定中，捕捉步骤在宏观表面例如传感器表面(以竞争性或非竞争性方式)上发生。在这类实例的每一个实例中，当在血液样品中进行测定时，固定的测定珠子易受白细胞攻击。在竞争性和非竞争性测定中，该效应可通过添加针对白细胞进行了调理作用的消耗珠子(优选地过量)来减小。在一个实施方案中，本发明涉及用于处理液体样品以测定分析物在样品中的存在或量的筒和方法。所述筒优选包含计量装置(metering means)，其允许导入未计量体积的样品，筒和其连接的读数装置通过该计量装置处理计量的量。因此，使医生或操作者在测量之前免除了手工测量样品的体积，从而节省了时间、人工投入以及增加了准确性和重现性。在一个实施方案中，计量装置包括连接有毛细管栓并且沿着其长度具有空气进入点的延长的样品室。在空气进入点上施加的空气压力驱动计量体积的样品通过毛细管栓。通过空气进入点与毛细管栓之间的样品室的体积预定计量的体积。筒可具有用于以气密方式封闭样品端口的关闭设备。该关闭设备优选相对于筒的主体是可滑动的并且提供了移除位于端口区域的任何过量样品的剪切作用，从而可靠地封闭进入端口与毛细管栓之间的保持室(holding chambe)中的样品的一部分。参见,例如，公布的美国专利申请US2005/0054078A1，将其完整内容通过弓I用并入本文。筒可以这样密封例如，以将过量流体样品从样品口移除的方式将密封组件滑动地移动至筒的表面上，将一定体积的流体样品封闭在内部流体样品保持室内，并且抑制流体样品过早地冲破内部毛细管栓。通过该滑动关闭设备获得的密封优选是不可逆的并且防止过量血液被捕捉在筒中，因为关闭设备在口(血液通过其进入筒)的平面上移动并且提供将血液封闭在进入端口的平面下的剪切作用，从而将过量血液即口的平面上方的血液从进入端口移除以及任选地将其转移至废料室。一个示例性关闭设备示于图I中并且包括罩子I的集成组件2、3、4和9。在该实施方案中，关闭设备2围绕铰链旋转直至钩3咬住闭锁(shut)，从而封闭样品进入端口 4。包括图I中的罩子I的集成组件2、3、4和9的关闭设备的另一选择显示为图18和19中的独立滑动组件200。图18和19显示了包括图I的罩子的改进形式的筒设备，其附着于与图4中的底座相似的底座(所述底座具有图3中显示的插入粘附层(intervening adhesivelayer)和独立的滑动关闭组件200)。图19显示了开口位置中的关闭设备200，其中样品进入端口 4可接收样品，例如血液。图18显示了关闭位置中的关闭设备200，其中其以气密方式封闭样品进入端口。在操作中，在已将样品例如血液添加至进入端口并且其进入保持室34后，手工将组件200从打开位置推至关闭位置。在显示的实施方案中，将进入端口的区域中的任何过量血液被移入溢流室201或相邻的保留区域或腔。该室或区域可包括保留过量样品例如血液的流体吸收垫或材料。样品进入端口 4可以是环状(如图19中显示的)或椭圆形的口，并且口的直径通常在0. 2-5_，优选1-2_的范围内，或具有1-15_(对于椭圆形)的周长。围绕口的区域可选择为疏水性或亲水性的以控制施用的样品的滴形，从而促进向进入端口内的进入。图18和19中显示的关闭设备的一个有利方面是其防止样品被推送超出保持室34末端上的毛细管栓组件之外。少量样品例如血液在毛细管栓之外的存在对于测量分析物的主要浓度的测试并不重要，因此其不依赖于样品体积。然而，对于免疫测定应用(其中样品的计量通常为有利的)，密封组件提高设备的计量准确性并且确保当分析仪在筒导管内推动样品时，样品的测定区段相对于免疫传感器被适当地定位。在操作中，当将样品例如血液添加至筒中时，其移动至毛细管栓。因此，当毛细管栓至样品进入端口的区域即保持室34包含样品时，存在用于测试的充足样品。在填充保持室的过程中，一些样品可保留在进入端口的口的平面上方。当将密封组件从打开移动至关闭位置时，进入端口上方的任何样品被剪切掉而不在关闭行动中捕捉额外的样品，从而确保样品不移动至毛细管栓25之外。在优选实施方案中，密封组件200位于图3的带垫圈21的表面上方数千分之一英寸内。通过随后使200的表面下降至粘性带垫圈来封闭进入端 口，此时所述表面哨合锁闭部件(locking feature) 212和213。由于所述带是基本上不可压缩的并且所述口的直径�。虼吮挥没┘又撩芊庾榧娜魏尾痪獾难沽换崾寡芬贫撩腹芩ㄖ�。在某些使用几滴样品的筒的实施方案中，不希望在保持室中形成气泡，因为这可影响测定。因此，已开发了用于将超过一滴样品例如血液导入保持室34而不产生气泡的可靠方法。样品进入端口可以被设计为接收多滴样品，由于首先用电晕(Corona)和/或试剂混合物处理保持室，因此连续液滴不会在保持室34中引起捕获的气泡形成。对一次性医疗设备使用电晕处理在本领域是公知的，并且是增加实际上任何材料例如金属化表面、箔、纸、纸板原料(paperboard stock)或塑料例如聚乙烯、聚丙烯、尼龙、乙烯树脂(vinyl)、PVC和PET的表面活性的有效方法。该处理使得它们更易接收墨水、涂层和粘合剂。在实践中，将待处理的材料暴露于放电或“电晕”。放电区域中的氧分子断裂成原子并且结合至待处理的材料中的分子，从而导致化学活化的表面。用于电晕处理的适当设备是商购可得的(例如Corotec Corp.，Farmington, Conn.)。过程变量包括处理材料所需的功率的量、材料速度、待处理的面的宽度、数目以及具体材料对电晕处理的反应性，所述变量可由操作者确定。安装电晕处理的常见位置与打印、涂覆或成层(laminating)过程成直线。另一种常见安装是直接在吹塑薄膜(blown film)或铸制薄膜(cast film)挤压机上，因为新鲜材料更易接收电晕处理。如上所述，非竞争性(夹心)免疫测定形式是最广泛使用的免疫测定法，并且其也是本文中论述的分析设备例如筒的优选形式。在该实施方案中，将一种抗体(固定的抗体)结合至固体载体或免疫传感器上，将第二抗体(信号抗体)缀合/结合至信号产生性试剂例如酶，例如碱性磷酸酶。简而言之，图20显示了在分析过程中发生的信号产生反应，图20(a)显示底物被碱性磷酸酶切割以产生电活性对-氨基苯酚，图20(b)显示对-氨基苯酚的氧化。图20(a)中的反应在传感器结构的上层发生而图20(b)中的反应在金电极表面发生。图20(a)中的插图显示碱性磷酸酶催化的水解的PH-依赖性。中间的图描述了暴露于样品之前的免疫传感器结构的总体特征。
信号产生性试剂(例如，信号抗体)可以是分析设备中的干试剂涂层的一部分(如下文中描述的)，并且优选在样品到达免疫传感器之前溶解在生物样品中。在洗掉样品和非特异性结合的试剂后，保留在固体载体上的信号产生性试剂(例如，信号抗体)的量原则上应当与样品中的分析物的量成正比。然而，此类测定构型的一个限制是对于由存在于血液样品中的白细胞引起的干扰的易感性。虽然白细胞干扰可通过共同拥有的US 20060160164中公开的方法来缓解，但现已发现对于某些血液样品，令人惊讶是，可通过添加与样品均匀混合的消耗珠子(其中已针对白细胞特别地对所述珠子进行了调理作用)来显著地减小或消除所述效应。优选利用从动物种类分离的非人IgG(IgG种类的免疫球蛋白)或其片段涂覆消耗珠子。如本文中所用，术语“片段”是指来源于指定分子的任何携带表位的片段。因此，IgG片段可包含例如携带表位的F(ab’)2或Fab片段或Fe片段。此外，关于“IgG或其片段”，其是指单独的IgG、单独的IgG片段(即，IgG的F(ab’)2片段、Fab片段和/或Fe片段中的一个或多个)或IgG和IgG片段的组合。可利用多个表面涂层达到期望的效果，只要对表面涂层进行了调理作用，或当与待测定的样品接触后所述表面涂层可经历调理作用。在优选实施方案中，将消耗珠子掺入干试剂涂层，所述干试剂涂层在一些实施方案中可以是相同的干试剂涂层，其包含信号产生性试剂(例如，信号抗体)。因此，在一个实施方案中，分析设备包括干试剂涂层，所述涂层包含如下组分之任一或两者(a)适合于缓解白细胞的效应的组分，例如用IgG或其片段涂覆的珠子，和/或(b)信号抗体。干试剂涂层可从试剂混合物形成，其优选还包含如下组分之任一和两者(a)适合于缓解白细胞的效应的组分，例如用IgG或其片段涂覆的珠子，和/或(b)信号抗体。在一个方面，试剂涂层和/或混合物还包含IgM或其片段以缓解由嗜异性抗体引起的干扰，如共同在审的美国申请12/411，325中所公开的。优选首先对待将试剂混合物沉积于其上的表面进行电晕处理以提供带电荷的表面基团，所述基团将促进打印的混合物扩散。一般来说，用于形成干试剂涂层的试剂混合物还可包含水溶性蛋白质、氨基酸、聚醚、含有羟基的聚合物、糖或碳水化合物、盐和任选地染料分子。可使用一种或多种各组分。在一个实施方案中，混合物包含牛血清白蛋白(BSA)、甘氨酸、盐、甲氧基聚乙二醇、蔗糖和任选地溴酚蓝以提供帮助使打印过程可视的颜色。在一个实施方案中，将I至20 y L混合物打印至分析设备的期望的表面上(例如保持室或其它导管内)并且使其风干(加热或不加热)，然后将其与其罩子装配在一起。在优选方面，所述试剂混合物和从其形成的干试剂涂层包含拉克替醇、DEAE-葡聚糖、盐例如氯化镁和氯化钠、IgG/IgM、肝素、表面活性剂和罗丹明。优选将试剂混合物配制为包含消耗珠子和任选地其它干扰减少性试剂的可打印的水溶液。在导入生物样品例如血液后，优选在测定的第一步骤中将样品与试剂混合。试剂还可包括无机盐和表面活性剂以使测定性能在化学和流体性属性方面得到最优化。其它任选添加剂可包括肝素以确保足够的抗凝；和染料以使打印后试剂的定位可见。任选地还存在稳定剂例如叠氮化钠(以抑制微生物生长)和拉克替醇与二乙氨乙基-葡聚糖的混合物(Applied Enzyme Technologies Ltd. , Monmouth House, MamhiladPark, Pontypool, NP40HZ UK)(以稳定蛋白质)。一旦沉积在设备中，可将沉积的试剂在暖和气流中例如干燥30至60分钟。在一个实施方案中，使用自动打印仪器将试剂打印在设备的样品入口中并且干燥以形成包含消耗珠子的试剂涂层。除了包含消耗珠子外，还可将其它任选的添加剂包含在筒中或与测定结合使用。如上文所论述的，可添加抗凝剂肝素以便在未将样品收集在肝素化的管或未将样品在肝素化的管中正确混合的情况下提高性能。添加足够的肝素以便新鲜未肝素化的血液在筒的测 试循环过程中(通常在2至20分钟的范围内)保持不凝固。可添加山羊和小鼠IgG以抵抗免疫测定领域中公知的嗜异性抗体问题。可添加Proclin、DEAE葡聚糖、Tris缓冲液和拉克替醇作为试剂稳定剂。可添加Tween 20以减少蛋白质与塑料(其是用于筒的优选材料)的结合。其还允许试剂更均匀地涂覆塑料表面并且用作使糖例如拉克替醇的结晶减少至最低程度的杂质，以便它们保持为玻璃。可添加叠氮化钠以抑制细菌生长。在优选实施方案中，如下制备I升(L)批次的基本打印混合物(base printcocktail):将蛋白质稳定溶液(PSS, AET Ltd.，50%固体，100. Og)添加至200_250mL的氯化钠(8. OOg)和叠氮化钠(0. 500g)的水溶液中，将所得的溶液转移至IL容量瓶中。通过将鼠IgG (0. 9g)添加至75mL去离子水并且搅拌15-60分钟直至完全溶解来制备鼠IgG的溶液。以相同的方式制备同样地浓缩的羊IgG溶液，将两个溶液都通过I. 2 PM滤器过滤。从提供商(例如，Sigma-Aldrich)获得以液体形式存在的鼠IgM。在280nm处通过分光光度计测量3种免疫球蛋白(Ig)原液的每一种的蛋白质浓度。计算提供鼠IgG(0.75g)、羊IgG(0. 75g)和鼠IgM(25mg)所需的这些Ig溶液的质量，将这些量添加至打印溶液中。通过将DEAE-葡聚糖(2. 5g)添加至50-100mL的去离子水中并且搅拌30分钟来制备二乙氨乙基-葡聚糖(DEAE-葡聚糖)的溶液。将DEAE-葡聚糖溶液添加至打印溶液。向该溶液中添加肝素钠(10，000IU/mL, 3. OOmL) ,Tween-20 (3. 00g)和 5%(w/v)的罗丹明水溶液(200 u L)。用去离子水将所得的溶液稀释至I. 000L，然后贮存在冷冻室或冰箱直至使用。当被包含时，可在该最终稀释之前添加用于白细胞干扰缓解的IgG-涂覆的微粒。优选使打印此类和相似的流体以在筒组分上形成干试剂涂层自动化并使其基于微分配系统(microdispensing system),包括照相机和计算系统，以对齐组分,如美国专利No. 5，554，339 (通过引用将其整体并入本文)中所公开的。在该专利中，利用轨道(track)替代娃片夹(wafer chuck)以将塑料筒底座输送至分配头(dispensing head)。轨道以预定方向将底座呈递至分配头以确保一致的位置分配。在另一个实施方案中，测试筒可包含多个干试剂涂层(在该情况下所述涂层可分别称为第一试剂涂层、第二试剂涂层等以区分它们)。例如，可将消耗珠子包含在第一试剂涂层中，该涂层例如可与包含信号产生性成分例如信号抗体的第二试剂涂层相邻。在该方面，第二试剂涂层可位于第一试剂涂层的上游或下游，尽管优选地包含信号抗体的试剂涂层位于包含消耗珠子的试剂涂层的下游。在优选实施方案中，用包含消耗珠子和任选地缓解不同干扰形式的其它试剂的第一试剂涂层涂覆保持室。在该方面，包含信号抗体的第二试剂涂层优选位于保持室的下游，例如紧靠在免疫传感器的的上游。在其它实施方案中，消耗珠子可以不是分析设备例如筒的一部分。例如，可将消耗珠子集成在样品收集设备例如毛细管、Vacutainer 或注射器中。例如，可在收集设备的内壁上形成消耗珠子涂层。因此，在一个实施方案中，本发明是用于进行免疫测定的试剂盒，其包括首先用于修正第一容器或位置中的血液样品的消耗珠子，随后将样品通过具有捕捉和信号抗体的第二容器或位置。·在另一个实施方案中，可将用于缓解白细胞干扰的组分包含在溶液中并与生物样品例如血液混合，将所得的修正的样品导入分析设备例如筒中。在一个实施方案中，例如，可将血液样品与消耗珠子混合以形成修正的样品，随后将该样品导入分析设备例如筒。在另一个方面，所述设备在其中包括小袋(pouch)，所述小袋包含含有消耗珠子的液体，其与血液样在设备中混合，随后大体上如本文中所述进行处理以形成测定，例如夹心测定，以进行分析物检测。在另一个实施方案中，电润湿法(electrowetting)用于将包含消耗珠子的第一液体与液体生物样品例如血液混合。在该实施方案中，可提供用于操作微滴的装置。所述装置例如可具有单面电极设计，其中将所有导电组件包含在于其上操作微滴的表面上。为了包含待操作的微滴，可与第一表面平行地提供另外的表面。通过进行基于电润湿法的技术(其中以受控的方式相继激励和去激励包含在第一表面上或植入其中的电极)操作微滴。所述装置可使得能够进行多个微滴操作过程，包括将两个微滴融合和混合在一起，将微滴分成两个或更多个微滴，通过从液流形成单个可控微滴而从连续液流取样，以及迭代二元(iterative binary)混合或数字混合微滴以获得期望的混合比率。如此，可将包含消耗珠子和其它试剂的第一液体的微滴与液体生物样品例如血液小心和可控地融合和混合。参见，例如，美国专利No. 6，911，132，将其整体通过引用并本文。虽然本发明可广泛地应用于免疫测定系统，但其在i-STAT 免疫测定系统(Abbott Point of Care Inc.，Princeton, N. J.)的情景中获得最好的理解,如上文中弓丨述的共同拥有的在审的和授权的专利中所描述的。在一些实施方案中，所述系统使用免疫-参考传感器(参见US2006/0160164A1，通过引用整体并入本文)以评估在测定过程中发生的非特异性结合(NSB)的程度。NSB可因不充分的洗涤或因干扰的存在而产生。来自测定的净信号由从分析物免疫传感器产生的特异性信号(通过扣除从免疫-参考传感器产生的非特异性信号而修正)组成。免疫-参考传感器上的信号的量受制于通过质量控制算法确定的限制。在一个实施方案中，本发明改善了 i-STAT免疫测定形式对于由白细胞引起的干扰的抗性；然而，其同样地适用于标准ELISA形式，其中这类细胞存在于分析介质中。具体地，本发明包括使用涂覆的消耗珠子，发现所述涂覆的消耗珠子显著减少由存在于某些测试样本中的白细胞引起的干扰。
如上文中指出的，现已发现用优选与其它试剂(如例如在‘164和‘325申请中公开的)组合的消耗珠子修正样品可导致减少的或消除的白细胞干扰。在实验中，将非人IgG-标记的微粒珠子添加至i-STAT 免疫测定形式中使用的样品条件化干试剂打印混合物。随后测试先前因来自白细胞的干扰而不能被可靠分析的已知样品。值得注意的是，虽然常规夹心测定在这些情况下产生错误结果，但先前的i-STAT系统测定先前未报道这些样品的不准确的结果，因为所述系统包括检测假信号的算法，以错误代码警示用户，并禁止结果被显示。这是进行可靠及时现场护理测试所需的质量体系的一个部分的实例。通过该方式，分析系统的质量和完整性得到了维持。令人惊讶地，当测试包含消耗珠子的改进的筒并将结果与不存在消耗珠子的常规筒相比较时，结果显示当应用消耗珠子，在常规筒中展示白细胞干扰的血液样品可被精确地分析。就本发明的主题而言，发现某些免疫测定测试筒，特别是BNP筒，展示因先前未知的干扰机制而产生的意外的正和负倾斜的波形。分别参见，例如，图11(a)和(b)。这导致 关于干扰机制的假说，所述假说是基于，在洗涤步骤中将电极脉冲至正电位的效应的实验。注意，基于理论基础预期的的正常免疫传感器反应在低分析物浓度下具有接近0的斜率，并且仅在高分析物浓度下预期负斜率，其中测量可变成底物限制性的而非酶限制性的。这两种情况分别示于图11(c)和(d)中。存在几个引起动态(非稳态)安培计信号的潜在机制。动态电极活性(变化的有效电极区域)是不可能的，因为电极从形成的组件分离(因为聚乙烯醇(PVA)层上存在固定的测定珠子(微粒))，两者在血浆样品中都未显示该效应。取决于流体接触，动态层厚度例如上述组分的膨胀或收缩是不可能的，因为对于这样的现象不存在引起正斜率和负斜率的驱动力。酶的动态覆盖(例如，ALP，变化的酶表面浓度)被排除，因为在薄层形式中，在测量的时间标度上，酶(例如，ALP)从传感器的扩散是不可能的。鉴于相对小的分子尺寸并且相对容易扩散(D 5X10_6cm2/s)，酶底物(例如对-氨基苯酚磷酸(P-APP))至电极表面的动态运输是不可能的。因此，通过消除的方法，动态ALP活性被认为是动态传感器信号的最可能诱因。此外，进行研究以评估所述机制。值得注意的是，ALP对于对-氨基酸苯酚磷酸的水解是PH依赖性的，最佳pH接近pH 10。在筒中，使用9. 2的工作pH，因为这种略低的PH确保免疫复合物的稳定性。此外，电极上对-氨基苯酚(p-AP)的氧化是pH依赖性的并且预期PH每减小十倍程，电位偏移约+59mV，即在较低的pH下，反应一定更难驱动，即需要增加的应用电位。如果微粒打印层因与干扰组分相互作用至传感器结构内的样品流体(pH 7.4)在洗涤步骤中不能完全被分析流体(pH 9.2)完全替代的程度而变得不太可渗透，则这将导致亚最适的检测步骤PH，特别是对于在离分析流体的进入点最远的区域上发生的电极反应而言。更重要地，该受损的流体替代将一定会产生随时间而缓和的PH梯度。随着酶和电极反应的相对速率改变，观察到信号也如此。该技术评估具有重要的有利方面其为正向和负向倾斜的信号提供了解释。参见，例如，图11(a)和(b)。通过在洗涤步骤中，将脉冲应用至极端电位，例如将脉冲应用至氧化电位，进一步评估观察到的干扰与不完全洗涤步骤(因微粒层的“堵塞(Plugging) ”或“污染(fouling) ”而产生)相关的概念。预期正倾斜波形可能由失活阻断的传感器引起，可应用脉冲在分析步骤之前清洁电极。观察到，在正常样品的洗涤步骤期间应用氧化脉冲对观察到的信号和在随后的分析中没有影响。参见图12(a)。然而，在异常高棕黄样品的情况下，脉冲的效应是大且动态的信号，此外，鉴于分析物的浓度，这些信号比预期的要大。参见图12(b)。在这两种情况下对氧化电位脉冲的反应的差异证明传感器结构内的流体确实不同。如所预期，正确反应因期望的分析流体在传感器上的存在而引起，而异常反应产生是因为传感器结构上的流体是血浆，或血浆与分析流体的组合。可如下理解反应的差异根据H2O — l/202+2H++2e_，氧化脉冲导致氧气的进展和pH的减小。在包含缓冲至pH 9. 2的分析流体的传感器结构的情况下，在电极上产生的质子在缓冲液(IOOmM的碳酸盐，在分析流体中)存在的情况下被快速消耗。然而，在由分析流体提供的缓冲不存在的情况下，质子维持在电极的区域中，导致酸性流体的羽流(plume)。 该酸性羽流导致PAPP至pAP的酸催化水解，产生比预期的更大的信号。具体地，异常波形产生自pAP，所述pAP通过酶例如ALP对pAPP的酶促作用以及还有非酶促的酸催化的水解产生。值得注意的是，对于对-氨基苯酚磷酸，除非氨基如在低pH时那样被质子化，否则不会大量发生酸催化的水解反应不会大量发生。这是因为反应在对位上需要强吸电子取代基(Barnard et al. J. Chem. Soc. (1966)，227-235)。如在本领域是已知的，-NH2 取代基主要提供电子，然而在质子化后，-NH3+取代基变得高度吸电子(甚至比-NO2更强；例如，对于-NH2, Hammet para-rho 值为-0. 66,对于-NH3+ 为 I. 70)。这些实验使观察到的干扰与“高棕黄”样品发生关联并且可有意地通过运行具有富集的血沉棕黄层的全血样品来引发。注意，该术语是指当将全血离心时在血浆-红细胞边界形成的一层白细胞和血小板。表明白细胞和潜在地血小板作为污染试剂的其它证据示于显微照片图17(a)(不使用消耗珠子的测定)和17(b)(使用消耗珠子后的测定)。为了进行比较，图20中显示了与全血接触之前的原始免疫传感器。图17(a)显示与高棕黄样品ClO5个白细胞/yL)接触的传感器，使用标准测量循环和10分钟的传感器温育时间。不将样品与进行了调理作用的消耗珠子接触。很明显，一部分测定珠子涂覆的传感器表面被不容易通过洗涤步骤被去除的细胞的粘着层覆盖。相比之下，图17(b)显示了与高棕黄样品ClO5个白细胞/yL)接触的传感器，使用标准测量循环和10分钟的传感器温育时间。然而，与图17(a)中显示的测定相反，将图17(b)中显示的样品与根据本发明的一个实施方案进行了调理作用的(IgG涂覆)消耗珠子接触。很明显，在洗涤步骤后，测定珠子-涂覆的传感器表面的部分与图17(a)相比较具有显著较少的粘着的细胞。IgG用作调理素，其是能够标记例如被白细胞吞噬的病原体的物质。通常将IgG添加至免疫测定以对付嗜异性抗体干扰，如共同在审的美国申请2/411，325中所描述的，所述IgG存在于本文中描述的BNP筒中的测定珠子上。因此，很可能，该来源的IgG (当存在于免疫测定设备中时)或天然存在于血液样品中的IgG可用于不希望地对传感器表面进行针对白细胞的调理作用。此外，由于测定珠子在尺寸上与作为吞噬作用的天然靶标的生物细胞(细菌)相似，所以IgG在测定珠子上的积累可能不期望地促进白细胞在这些珠子上积累。这与在具有高白细胞计数和可能地具有激活的免疫状态的细胞的样品中观察到的干扰是一致的。本发明提供了对这种白细胞干扰的解决方法，其中将消耗性IgG-涂覆的微粒包含在样品中，这为白细胞活性提供了诱饵靶，从而使它们绕开传感器上的主要免疫试剂。使用与用于制备测定珠子的方法类似的方法进行IgG-涂覆的微粒的制备。该方法包括将IgG吸附至MES缓冲液(2- (N-吗啉代)乙磺酸)中的羧化聚苯乙烯微粒上，然后在EDACd-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)存在的情况下进行交联。现性描述用于形成消耗珠子的一个非限定方法。在优选程序中，通过以18，000RCF(相对离心力)离心20分钟而从它们的基质(10%的微粒在，在水中，Seradyn)沉淀出粗制微粒，将其重悬浮于25mMMES缓冲液至100-200mg/mL的浓度。随后以等于约I至5%的重量的微粒的量添加溶解在25mM MES缓冲液中的IgG。在于冰箱中进行15-20分钟回转(nutation)后，通过以1300RCF离心20分钟沉淀出微粒，将其重悬浮于新鲜MES缓冲液至75mg/mL的浓度。通过测量280nm处的吸光度(I. 4AU/mg/mL蛋白质的有效消光系数)测定来自离心的上清液的蛋白质含量，以确认IgG已被吸附至微粒上。将新鲜制备的EDAC交联剂(10mM，在MES缓冲液中)添加至重悬浮的微粒至约2_4mM的终浓度。随后通、过在冰箱中回转120±15分钟而搅拌混合物。随后可通过以1300RCF离心20分钟再次沉淀出微粒，将其重悬浮于1/5PPS (磷酸缓冲盐溶液)中并且在冻箱中回转15-30分钟。在最终的离心后，可将微粒重悬浮于PBS+0. 05%叠氮化钠中或1:11/5PPB:PSS(1/5PPB为用4份水稀释的 PBS,PSS=蛋白质稳定溶液,Applied Enzyme Technologies, Pontypool, UK)中至10%的固体浓度。可将所得的制剂等份冷冻贮存(优选在-60° C)。将通过该方法形成的悬浮于PBS中的微粒用于本文中描述的实验，以及直接施用至血液样品中。富集的或高棕黄全血样品的制备(如对于用于本文中描述的实验所描述的)如下。从供体抽取新鲜全血放入2个6mL EDTA-抗凝Vacutainers ，将其以2000RCF (标准转子)离心10分钟。当需要BNP “阳性”样品时，在离心之前将BNP抗原掺入管。除了最后高出血浆/血沉棕黄层/红细胞界面的I毫米外，取出所有血浆并置于一旁。随后使用移液管取出界面区域(注意尽可能多地取出血沉棕黄层)并置于一旁。随后取出红细胞并置于一旁。通过将棕黄材料与更少部分的血浆和红细胞级分组合，可以产生高棕黄血液样品，同时保留正常样品血细胞比容，例如，35-55wt. %。类似地，可产生存在低水平或基本上不存在棕黄材料(白细胞和血小板)的样品。在实验中，利用如下样品测试BNP测试筒⑴高棕黄样品，(ii)在临运行之前用10%体积的10%重量的用PBS中的IgG涂覆的微粒(y P-IgG)的悬浮液处理的高棕黄样品，
(iii)高血细胞比容的不含白细胞的样品，和Qv)低血细胞比容的不含白细胞的样品。图21包括显示白细胞干扰对电化学免疫传感器的信号斜率的影响和消耗微粒处理对所述斜率的影响的图形数据。右图框和左图框中显示的是作为正常全血样品(右图框)和高棕黄血液样品(富含白细胞，高棕黄，左图框)的净信号(X-轴)的函数绘制的传感器斜率(y_轴)。左图框显示在消耗微粒不存在的情况下(亚批I)，在高棕黄样品中观察到的信号斜率的相当大的变化性。该变化性在消耗微粒存在的情况下(亚批2和3)被显著缓解。注意，在具有和不具有消耗微粒的正常全血样品(右图框)中观察到极小的信号斜率变化性。测定后传感器的显微检查显示在高棕黄(HB)中运行的芯片上存在厚的沉积；在HB/^P-IgG运行的样品上不存在沉积。免疫传感器的显微照片示于图17(a)和17(b)中，并且它们的相关分析仪波形分别显示于图22(a)和(b)中。从与血液样品接触之前的原始免疫传感器(如图20中显示的)与在利用消耗珠子的优选制剂处理的血液接触之后的免疫传感器(图17(b))的比较清楚地看到，在视觉上存在显著的改善，即与图17(a)相比较附着的白细胞减少。基于许多观察，该视觉改善与免疫传感器性能的实际改善直接相关。其它实验显示干扰现象在单独的血浆或在含血小板但不含白细胞的样品中不发生，但仅在含高棕黄水平的样品中发生。此外，利用IgG涂覆的更小的微粒，例如具有小于0.2um的平均粒度的微粒，不具有与较大颗粒相同的对传感器斜率的干扰缓解效应。优选地，IgG-涂覆的微粒(消耗珠子)的平均粒度为0.01至20 iim，例如，0.1至20 iim，I至10iim，0. I至5iim或2至5iim。消耗微粒的粒度分布优选是单型的，虽然多型分布也是可能的。原理上，可使用具有正确尺寸和能够进行调理作用的的任何颗粒；然而，聚苯乙烯珠子是优选的。在优选方面，使用山羊或绵羊IgG涂覆的颗粒，虽然可使用其它IgG来源例如小鼠或兔IgG。一般而言，发现微粒的尺寸是非常重要的但其组成或IgG的来源是不重要的。关于消耗珠子，它们优选包含由选自聚苯乙烯、聚丙烯酸和葡聚糖的材料形成的基底珠子，并且可具有约0. 01 ii m至约20 ii m的范围内的平均粒度,更优选在0. Iiim至5iim或约 2 y m至约5 y m的范围内的平均粒度。注意，虽然球状珠子的使用是优选的，但其它珠子结构例如椭圆形和其它不规则形状的颗粒在此处所用的术语珠子和微粒的含义之内。在该情况下，平均粒度是指颗粒的平均最长尺度，例如球状颗粒的直径，如通过本领域内公知的方法测定的。总之，实验数据支持这样的结论白细胞是其中传感器在洗涤循环中变得不太可渗透的现象的主要原因，并且该免疫测定干扰可通过添加消耗IgG涂覆的颗粒至测定介质来缓解。免疫传感器的优选实施方案的晶片级(Wafer-level)微制造如下。基础电极(图9的94)在15 ii m中心上包含7 ii m金盘(gold disk)的方阵列。所述阵列覆盖直径约600 ii m的圆形区域，并且这样实现在由一系列包含Si/Si02/TiW/Au的层制造的基底上光图案化一薄层厚度0. 35 y m的聚酰亚胺。7 u m微电极的阵列提供电活性物质种类的高收集效率，具有减小的来自任何电化学本底电流(与暴露的金属的电容相关)的贡献。在金属上包含PVA层显著地增强了本底电流的减小。通过在晶片上的微电极上旋转涂覆PVA+有机卩比唳盐(stilbizonium)光敏交联试剂的含水混合物来制备多孔PVA层。旋转涂覆混合物任选地包括牛血清白蛋白(BSA)。随后对其进行光图案化以仅覆盖阵列上方和围绕阵列的区域，并且优选具有约0. 6 y m的厚度。差分测量(differential measurement)的一般概念在电化学和传感领域是已知的。现在描述用于减少电化学免疫传感系统中的干扰信号的新型方法。然而，虽然描述了成对安培计电化学传感器的差分测量，但其在其它电化学传感系统包括电位测定传感器、场效应晶体管传感器和电导测定传感器中具有等同的效用。其还适用于光学传感器，例如消逝波传感器和光波导，以及还有其它类型的传感，包括声波和温度传感等。因此，可将固定的抗体附着至选自安培计电极、电位测定电极、电导测定电极、光波导、表面等离子体共振传感器、声波传感器和压电式传感器的传感器。理想地，在非竞争性测定实施方案中，来自免疫传感器(IS)的信号仅来源于包含固定的抗体(Abl)、分析物和被标记的信号抗体(Ab2)的夹心的形成，其中标记物(例如，酶)与底物(S)反应以形成可检测的产物(P)，如下面方案(I)中显示的。表面-Abl-分析物-Ab2-酶；酶+S—P (I)已知一些信号抗体(Ab2)可非特异性结合至表面，如下面方案(2)和(3)中显示的，并且在洗涤步骤中可能不从免疫传感器的区域被完全洗掉(达到约100微米远)，从而产生与表面-Abl-分析物-Ab2-酶免疫测定夹心结构无关的总的检测产物的一部分，从而产生干扰信号。表面-Ab2-酶；酶+S — P (2)表面-分析物-Ab2_酶；酶+S — P (3) 如上文显示的，可以任选地将第二免疫传感器置于筒中，其可用作免疫-参考传感器(IRS)并且产生与在第一免疫传感器上发生的相同的(或可预测地相关的)程度的NSB。干扰可通过从第一免疫传感器的信号扣除该免疫-参考传感器的信号而被减少，即，除去信号的NSB组分，从而提高测定的性能，如下面方案(4)中显示的。该修正可任选地包括额外的补偿值的扣除或添加。修正的信号=IS-IRS(4)优选地，除用于分析物(例如，cTnl)的捕捉抗体被针对血浆蛋白(以高浓度天然存在于样品(正�：筒±硇缘�)中)的抗体替代外，免疫-参考传感器在所有重要方面(例如，尺度、多孔筛选层、乳胶颗粒涂层和金属电极组成)与第一免疫传感器是相同的。可将免疫传感器和参考免疫传感器在硅芯片上分别制造为相邻结构94和96 (如图9显示的)。虽然描述了肌钙蛋白I和BNP测定的优选实施方案，但该结构对于其它心脏标志物测定包括例如肌钙蛋白T、肌酸激酶MB、原降钙素、proBNP、NTproBNP、肌红蛋白等加上临床诊断中使用的其它夹心测定例如PSA、D- 二聚体、CRP、HCG、NGAL、髓过氧化物酶和TSH也是有用的。结合血浆蛋白的适当的抗体的实例包括针对人血清白蛋白、血纤蛋白原和IgGfc区域的抗体，白蛋白是优选的。然而，如果适当的抗体是可获得的，则可使用以大于约lOOng/mL的浓度存在的任何天然蛋白质或血衆组分。然而，所述蛋白质应当以充足的量存在，以快速地涂覆传感器(与进行分析物测定所需的时间相比)。在优选实施方案中，所述蛋白质以足以在接触血液样品的约100秒内结合参考免疫传感器上超过50%的可用抗体的浓度存在于血液样品中。一般地，第二固定的抗体具有约lxl0_7至约1x10_15M的亲和常数。例如，归因于血液样品中白蛋白的约IxKT4M的高摩尔浓度，具有约lxlO,M的亲和常数的针对白蛋白的抗体是优选的。已发现提供被来源于样品的天然白蛋白覆盖的表面可显著地减少可存在的其它蛋白质和细胞材料的结合。该方法通常优于使用常规封闭试剂以使NSB减少至最低限度的 常规免疫测定，因为此类试剂通常必须被彻底干燥并且在使用前保持稳定数月或数年，在该时间过程中它们可降解，产生比期望的更粘的表面，导致随年代增长而产生的NSB。相反地，此处描述的方法在使用时提供了新鲜表面。接下来描述用于心脏脑利钠肽(BNP)的免疫传感器和用于进行差分测量以减少NSB的效应的参考-免疫传感器。通过相同的方法制备利用抗-BNP和抗-HAS涂覆的羧化物-修饰的乳胶微粒(由 Bangs Laboratories Inc.或 Seradyn Microparticles Inc.提供)。首先通过离心对颗粒进行缓冲液交换，随后加入抗体，所述抗体被允许被动吸附在颗粒上。随后用pH 6. 2的MES缓冲液中的EDAC活化颗粒上的羧基，以与抗体形成酰胺键。通过离心除去任何珠子聚集，将完成的珠子冷冻贮存。发现，对于抗-人血清白蛋白(HSA)抗体，乳胶珠子的饱和覆盖导致珠子质量增加约7%。使用共价连接从包含7mg的抗-HAS和IOOmg的珠子的混合物制备涂覆的珠子。通过使用该制剂，将约0. 4nL的微滴(包含约1%的固体，在去离子水中)微分散(使用美国专利No. 5，554，339的方法和装置，将所述专利通过引用整体并入本文)至覆盖传感器96的光图案化的多孔聚乙烯醇选择性渗透层上，然后使其干燥。干燥颗粒附着至多孔层并且显著阻止它们在血液样品或洗涤流体中的溶解。对于BNP抗体，乳胶珠子表面的饱和覆盖导致约10%的珠子的质量增加。因此通过将IOmg抗-BNP连同偶联试剂一起添加至IOOmg珠子，实现饱和覆盖。随后将这些珠子微分散至传感器94上。在另一个实施方案中，用具有血浆蛋白抗体例如抗-HAS和分析物抗体例如抗-BNP的珠子涂覆免疫传感器94。利用约2mg或更少的抗-HAS/100mg珠子制备的并且随后用抗-BNP饱和涂覆的乳胶颗粒在免疫传感器上提供了优良的NSB性质。已发现肌钙蛋 白测定的斜率(信号对分析物浓度)未受实质影响，因为在珠子上存在充足的抗-BNP来捕捉可用的分析物(抗原)。通过测定不同抗体的珠子饱和浓度和免疫传感器(具有只有针对靶分析物的抗体的珠子)的斜率，可测定具有针对给定的分析物和血浆蛋白的抗体的珠子的抗体组合的适当比率。具有参考免疫传感器的免疫传感器的重要方面是由一层血浆蛋白优选HSA/抗-HAS组合产生的表面的“人源化”。这似乎使得珠子不易于被抗体-酶缀合物的NSB影响。其也似乎减少了珠子差异性。不受理论束缚，似乎随着传感器被样品覆盖，它们因抗-HAS表面而迅速被天然白蛋白涂覆。这与常规封闭材料相比较提供了优良结果，所述常规封闭材料在制造中被彻底干燥并且通常在长期贮存之后复水化。“人源化”传感器表面的另一个有利方面是其提供了对人抗-小鼠抗体(HAMA)和其它嗜异性抗体干扰的抗性的额外模式。HAMA对免疫测定的影响是公知的。可用于本发明的设备和方法中的免疫-参考传感器的另一个用途是监测分析循环中获得的洗涤效率。如上所述，本底噪声的一个来源是少量酶缀合物仍然存在于溶液中，或非特异性吸附在传感器上并且未被洗涤步骤除去。本发明的该方面涉及通过导入实施例2中提及的空气段，使用小体积的洗涤液进行高效洗涤步骤。在安培计电化学系统的优选实施方案的操作中，通过分析仪记录因ALP的活性而产生的与免疫传感器94和免疫-参考传感器96上的对-氨基苯酚的氧化相关的电流。对于银-氯化银参考电极，将免疫传感器和免疫-参考传感器的电位设置在相同的值上。为了除去干扰效应，根据上述公式(4)，分析仪从免疫传感器的信号扣除免疫-参考传感器的信号。当在两个传感器之间存在特征性常值偏移时，该偏移也被扣除。应认识到免疫-参考传感器不必具有所有与免疫传感器相同的非特异性性质，仅需在测定的洗涤和NSB部分一致成比例。植入分析仪中的算法可解释两种传感器之间的任何其它基本恒定的差异。免疫传感器与免疫-参考传感器的差异组合而非单独的免疫传感器的使用，给测定提供了下列改善。在优选实施方案中，筒设计提供了干试剂，所述干试剂产生约40-50亿个溶解至约10 UL血液样品中的酶缀合物分子。在结合和洗涤步骤结束时，传感器上的酶分子的数目为约70，000个。在利用优选实施方案的实验中，在免疫传感器和参考免疫传感器上存在平均约200，OOO (土约150,000)个酶分子，作为非特异性结合的本底。通过使用免疫-参考传感器的差异测量，消除了约65%的不确定度，显著提高了测定的性能。虽然其它实施方案可具有其它程度的提高，但关于测定性能的总体提高的基础仍然保持。任选的免疫-参考传感器的另一个用途是检测异常样品状况，例如不恰当地抗凝固的样品，其将材料沉积在整个导管中并且在免疫传感器和免疫-参考传感器上都引起增加的待测量的电流。该效应与在测量步骤中非特异性吸附的酶和保留在传感器上的洗涤流体的薄层中的酶相关。任选的免疫-参考传感器的另一个用途是修正洗涤效率的信号。在某些实施方案中，免疫传感器上的信号水平取决于洗涤的程度。例如，利用更多流体/空气段转换的更长洗涤可因一部分特异性结合的缀合物被洗掉而产生更低的信号水平。然而这可能是相对小的影响，例如小于5%，修正可提高测定的总体性能。可基于传感器上的相对信号，或与位于与传感器相邻的导管中的电导传感器(用作用于检测和计数空气段/流体转换的数目的传感器)结合来实现修正。这为嵌入分析仪的算法修正工具提供了输入。在利用内源蛋白质例如HSA的参考免疫传感器的另一个实施方案中，可通过利用以针对外源蛋白质例如牛血清白蛋白(BSA)的抗体涂覆的免疫-参考传感器来实现相同的目的。在该情况下，在与传感器接触前需要将一部分BSA溶解在样品中(作为额外的试剂提供)。可在筒的样品保持室中或在外部收集设备例如BSA涂覆的注射器中以BSA作为干试剂进行该溶解步骤。该方法提供了某些有利方面，例如，可就表面电荷、特定表面基团、糖基化程度等选择蛋白质。这些性质可以不必存在于内源蛋白质的可获得的选择中。除了盐以外，其它试剂也可提高免疫测定的全血精确度。应当以促进快速溶解的方式将此类试剂呈递给全血。涂覆在血液保持室(或另一种导管)的壁上的支持基质(包括纤维素、聚乙烯醇和明胶(或其混合物))促进快速溶解，例如在15秒内完成超过90%。本发明的筒具有下列优点样品和第二流体可在测定顺序中在不同的时间接触传感器阵列。还可利用最初作为干涂层存在于各导管内的其它试剂或化合物独立地修正样品 和第二流体。筒内液体的受控运动还允许超过一种物质被修正进入每一种液体，而无论样品或流体何时移动至导管的新区域。这样，给每一种流体提供了多个修正，从而极大地扩大了可进行的自动化测定的复杂性，从而增强了本发明的效用。在一次性筒中，优选使包含的液体的量保持少量以使成本和尺寸降至最低程度。因此，在本发明中，导管内的区段还可用于通过使区段的空气-液体界面通过待漂洗的传感器阵列或其它区域至少一次来帮助清洁和漂洗导管。已发现，与利用更大体积的液体的连续漂洗相比较，利用该方法使用更少的流体实现了更高效的漂洗。导管内的限制在本发明中适用于几个目的。位于样品保持室与第一导管之间的毛细管栓被用于通过阻止保持室中的样品转移(直至施加足够的压力来克服毛细管栓的阻抗)来促进样品计量。第二导管内的限制用于使洗涤流体沿着替代途径转向朝向废料室(当流体到达缢缩时)。垫圈中的小孔与疏水涂层一起被提供来阻止从第一导管至第二导管的流动直至施加足够的压力。将液体流动控制在本发明的导管内和导管之间的部件在本文中统称为阀门。因此，本发明的一个实施方案提供了一次性使用的筒，其具有连接至第一导管(其包含分析物传感器或分析物传感器的阵列)的样品保持室。将部分地包含流体的第二导连接至第一导管并且可在第二导管的流体中导入空气段以分割它。提供泵装置以替代第一导管内的样品，并且这将流体从第二导管移入第一导管。因此，可将传感器首先与样品接触，随后与第二流体接触。在另一个实施方案中，筒包括位于第一导管与废料室之间的可关闭阀门。该实施方案允许只使用单个连接至第一导管的泵装置将流体从第二导管移入第一导管。该实施方案还允许高效地洗涤本发明的筒的导管，这是小型一次性使用的筒的重要特征。在操作中，样品被排出以接触传感器，随后被排出通过可关闭阀门而进入废料室。在湿润后，可关闭阀门密封对废料室的开口，从而提供了气密密封，其允许只使用连接至第一导管的泵装置抽取第二导管中的流体使其与传感器接触。在该实施方案中，可关闭阀门允许以该方式排出流体并且阻止空气从废料室进入第一导管。在另一个实施方案中，提供了可关闭阀门和用于将区段导入导管的装置。该实施方案可具有许多有利方面，所述有利方面之一是在传感器或传感器的阵列上互换分段的流体的能力。因此将第一区段或区段组用于漂洗传感器，随后新鲜区段替代其以进行测量。只需要一个泵装置(连接至第一导管)。在另一个实施方案中，在覆盖分析传感器的液体的薄膜中进行分析物测量。优选利用安培计量法进行此类薄膜测定。该筒与前述实施方案相异在于具有可关闭的阀门和导管内的排气口，当将样品排出通过阀门时所述可关闭的阀门被密封，所述排气口允许至少一个空气段随后被导入测量流体，从而增加从传感器漂洗样品的效率，并且还允许在测量之前从传感器除去几乎全部液体，并且还允许新鲜液体区段被带动穿过传感器以允许就提高的精确度进行连续的重复测量以及重现性的内部检查。在非竞争性测定实施方案中，如上所描述的，用于检测低浓度免疫活性分析物的分析方案依赖于酶标记的抗体/分析物/表面结合的抗体的“夹心”复合物的形成，如上文中所论述的。将样品中分析物的浓度转化为成比例的酶表面浓度。所述酶能够通过将底物转化成可检测的产物来放大分析物的化学信号。例如，当所述酶是碱性磷酸酶时，单个酶分子每分钟可产生约9000个可检测的分子，从而与其中将电活性物质种类附着至抗体(替代碱性磷酸酶)的方案相比较，在分析物的可检测性上提供了几个数量级的提高。在免疫传感器实施方案中，有利的是将传感器首先与样品，然后与洗涤流体接触，随后记录来自传感器的反应。在具体的实施方案中，除了利用IgG-涂覆的微粒修正以减少白细胞干扰外，还在修正的样品与传感器接触之前，利用结合样品中的目标分析物的抗体-酶缀合物(信号抗体)修正样品。样品中的结合反应产生分析物/抗体-酶复合物。传感器包括靠近电极表面附着的针对分析物的固定的抗体。在与传感器接触后，分析物/抗体-酶复合物结合电极表面附近的固定的抗体。有利地在该点尽可能多地从电极附近除去未结合的抗体-酶缀合物以使来自传感器的本底信号减小至最小。抗体-酶复合物的酶有利地能够转化流体中提供的底物以产生电化学活性物质种类。使该活性物质种类靠近电极产生，并且当施加适当的电位(安培计操作)时，其从电极上的氧化还原反应提供电流。或者，如果电活性物质种类是离子，可电压计量地测量它。在安培计测量中，可在测量过程中固定电位或按照预定的波形改变电位。例如，三角波可用于扫描限度之间的电位，如循环 伏安法的公知技术中所使用。或者，可将数字技术例如方波用于改善与电极邻近的电活性物质种类的检测灵敏度。根据电流或电压测量，计算样品中分析物的量或存在。这些和其它分析电化学法在本领域是公知的。在其中筒包括免疫传感器的实施方案中，有利地从惰性金属例如金、钼或铱的基本传感器和 覆盖有连接至微粒例如乳胶颗粒的生物活性层的多孔选择性渗透层微制造免疫传感器。将微粒分配在覆盖电极表面的多孔层上，形成粘着的多孔生物活性层。生物活性层具有特异性结合目标分析物的性质，或当分析物存在时表现出可检测的变化的性质，最优选为针对分析物的固定的抗体。参考附图，本发明的筒包括罩子(图I和2)、底座(图4)和置于底座与罩子之间的薄膜粘着垫圈(图3)。现参考图1，罩子I由坚硬材料(优选塑料)制造，并且能够在柔性铰链区5、9、10上反复变形而不破裂。罩子包括盖子2，其通过柔性铰链9连接至罩子的主体。在操作中，在将样品导入样品保持室34后，可确保盖子在样品进入端口 4的入口上方，阻止样品渗漏，通过钩3将盖子保持在原位。罩子还包括两个桨(paddle) 6、7，其相对于罩子的主体可移动，并且通过柔性铰链区5、10连接至罩子。在操作中，当利用泵装置操作时，桨6对由被薄膜垫圈21覆盖的腔43组成的气囊施加压力，以排出筒的导管内的流体。当通过第二泵装置操作时，桨7对垫圈21施加压力，所述垫圈由于在其中切割的裂缝22而变型。筒经改造适合于插入读数装置，从而具有多个用于该目的的机械和电气连接。还应当明显的是筒的手工操作是可能的。因此，在将筒插入读数装置后，垫圈将压力传递至位于腔42中的包含流体的箔袋(装有约130 u L的分析/洗涤溶液(“流体”)，从而刺破尖状物38上的包装，将流体排入导管39，所述导管通过底座中的短横向导管连接至传感器导管。分析流体填充分析导管的前端，首先将流体推至带垫圈中用作毛细管栓的小开口。施加至筒的分析仪器械的其它运动用于将一个或多个区段在分析导管内受控的位置处注射入分析流体。这些区段用于帮助以最少的流体洗涤传感器表面和周围的导管。罩子还包括被柔性薄膜8覆盖的孔。在操作中，对薄膜施加的压力将一个或多个空气区段通过垫圈上的小孔28排入导管20。参考图2，底座的下表面还包括第二导管11，和第一导管15。第二导管11包括缢缩12，其通过提供对流体流动的阻抗来控制流体流动。任选的涂层13，14提供了疏水表面，其与垫圈孔31、32—起控制第二与第一导管11，15之间的流体流动。底座中的凹陷17提供了用于导管34中的空气经垫圈中的孔27通过导管34的路径。参考图3，薄膜垫圈21包括多个孔和裂缝来帮助底座与罩子内的导管之间的流体转移并且在必要时允许垫圈在压力下变形。因此，孔24允许流体从导管11流入废料室44 ；孔25包括导管34与15之间的毛细管栓；孔26允许空气在凹陷18与导管40之间流动；孔27提供了凹陷17与导管34之间的空气流动；孔28允许流体从导管19经任选的可关闭阀门41流至废料室44。孔30和33允许分别安放在切除物(cutaway) 35和37内的多个电极与导管15内的流体接触。在具体的实施方案中，切除物37安放接地电极和/或对-参考电极，切除物35安放至少一个分析物传感器和任选地电导测定传感器。在图3中，胶带21在22上切开，以允许被3个切口 22围绕的胶带在仪器向下施力以在尖状物38上破裂组件42内的校准物小袋时变形。还在23上切割胶带，这允许当仪器提供向下的力时胶带向下弯曲至组件43中，从而将空气从室43排出，并且使样品流体通过导管15朝向传感器移动。图3中的组件29用作连接罩子图2与底座图4中的区域的胶带中的开口。参考图4，导管34是连接样品进入端口 4至装配的筒中的第一导管11的样品保持室。切除物35安放分析物传感器或分析物反应表面以及任选的电导测定传感器。切除物37安放接地电极(需要时)作为电化学传感器的返回电路，并且还可安放任选的电导测定传感器。切除物36在垫圈孔31与32之间提供了流体路径，以便流体可通过第一与第二导管之间。凹陷42在装配的筒中安放包含流体的包装，例如可破裂的小袋，所述包装由于在插入读数装置后施加在桨7上的压力而被尖状物38刺破。来自刺破的包装的流体流入39上的第二导管。气囊由凹陷43 (在其上表面上被垫圈21密封)组成。气囊是泵装置的一个实施方案，并且由施加至桨6的压力驱动，其将空气排入导管40中，从而样品从样品室34的排至第一导管15中。 空气从气囊进入样品保持室(垫圈孔27)的位置以及毛细管栓25的位置一起确定了样品保持室的预定体积。当桨6被压下时，相应于该体积的样品的量被排入第一导管。因此该排列是用于递送计量的量的未计量的样品至筒的导管内的一个可能的实施方案。在本发明的筒中，在底座塑料部件中提供用于计量样品区段的装置。区段尺寸受到底座中的区室的尺寸和毛细管栓以及带垫圈中的通气管孔的位置控制。该体积可容易地从2至200 y L变化。样品尺寸的该范围的扩大在本发明的情景中是可能的。将流体被推着通过分析前导管11，所述导管可用于在样品出现在传感器导管19中之前将试剂(例如，颗粒、可溶性分子或IgM或其片段)加入样品以进行修正。或者，修正试剂可位于部分15中，部分16之外。推动样品通过分析前导管也用于将张力导入膈膜泵桨7，这促进其对流体排出的驱动的反应性。在一些测定中，如果需要定量分析物，则计量是有利的。为从导管排出的样品和/或流体提供了废料室44，以防止对筒的外表面的污染。还提供了连接废料室与外部大气的排气口 45。筒的一个期望的特征是一旦加载了样品，可完成分析，并且可弃去筒而操作者或其他人不接触样品。现参考图5，提供了筒和组件的特征的示意图，其中51-57是可任选地用干试剂涂覆以修正样品或流体的导管和样品室的部分。将样品或流体在干试剂上方通过至少一次以溶解它。用于修正样品的试剂可包括如下的一种或多种抗体-酶缀合物(信号抗体)、IgM和/或其片段、IgG和/或其片段以及阻止测试化合物间的特异性或非特异性结合反应的其它封闭试剂，和/或用于减少白细胞干扰的上述IgG涂覆的微粒。还可提供不溶性的但帮助阻止测定组分对筒的内表面的非特异性吸附的表面涂层。在具体的实施方案中，在第一导管与废料室之间提供了可关闭的阀门。在一个实施方案中，该阀门58由用不能渗透的物质涂覆的干燥海绵材料组成。在操作中，将海绵材料与样品或流体接触导致海绵的膨胀以充满腔41 (图4)，从而实质上阻断液体至废料室44的进一步流动。此外，湿润的阀门也阻断第一导管与废料室之间的空气流动，这允许连接至样品室的第一泵装置排出第二导管内的流体，以及以下列方式将流体从第二导管排出至第一导管中。现参考图6，该图显示了免疫传感器筒的示意性布局，其中提供了 3个泵61-63。虽然这些泵已根据具体的实施方案进行了描述，但可容易地理解，能够进行泵61-63的各自功能的任何泵设备可用于本发明中。因此，泵1，61，应当能够将样品从样品保持室排出至第一导管中；泵2，62应当能够排出第二导管内的液体；泵3，63应当能够将至少一个区段插入第二导管。本申请中所设想的其它类型的泵包括但不限于与气动装置(通过该气动装置可对气囊施加压力)接触的气囊、柔性膈膜、活塞和气缸(cylinder)、电动力学泵以及振动泵(sonic pump)。参考泵3，63，术语“泵”包括通过其可将一个或多个区段插入第二导管的所有设备和方法，例如用于将空气从气囊排出的气动装置、当溶解时产生气体的干化学药品或多个可操作地连接至电源的电解电极。在具体的实施方案中，使用可具有超过一个气囊或小室的机械区段产生性膈膜产生区段。如所显示的，孔8具有单个开口，所述开口连接内部膈膜泵与流体充满的导管(将向所述导管内注射区段)20。可分割膈膜以产生多个区段，每一个区段被注射在流体充满的导管内的指定位置中。在图6中，组件64表示这样的区域其中免疫传感器进行捕捉反应以形成包含固定的抗体、分析物和信号抗体的夹心。在替代性实施方案中，使用被动部件注射区段。通过带垫圈密封筒的底座中的孔。覆盖孔的带垫圈在任一末端上具有两个小孔。一个孔是开口，而另一个被过滤材料覆盖，所述过滤材料当与液体接触后变湿。用疏松亲水材料例如纤维素纤维滤器、滤纸或玻璃纤维滤器充满孔。该亲水材料通过毛细管作用将液体吸入底座中的孔内，将先前存在于孔中的、空气排出。空气通过带垫圈中的开口排出，从而产生了其体积通过孔的体积和疏松亲水材料的空体积(void volume)确定的区段。可选择用于覆盖至底座中的孔的进口之一的滤器以计量流体填充孔的速率，从而控制区段被注射入罩子中的导管的速率。该被动装置允许任意数目的受控区段被注射在流体路径中的指定位置并且需要最小的间隔。基于本公开内容，很明显本发明的方法提供了在分析物免疫测定中减少或消除来自白细胞的干扰的方法，其中首先收集样品例如全血样品，随后通过将包含消耗珠子的干试剂溶解在样品中来修正样品。优选地，所述试剂盒或方法包括充足的消耗珠子以提供相对于血液样品中的白细胞过量的珠子。这产生了具有至少5微克/微升样品、例如至少10微克/微升样品、或至少15微克/微升样品的溶解的消耗珠子浓度的样品，所述浓度足以实质上啮合样品中的任何白细胞。就范围而言，干试剂优选溶解于样品中以产生约5微克至约40微克珠子/微升样品、优选约10至约20微克珠子/微升样品的消耗珠子浓度。取决于珠子的尺寸，这相应于至少约IO4个珠子/微升样品、至少约IO5个珠子/微升样品、或约IO5至约IO6个珠子/微升样品。因此，在一些优选实施方案中，消耗珠子以足以提供至少IO4个珠子/微升样品、例如至少约IO5个珠子/微升样品或约IO5至约IO6个珠子/微升样品的溶解的消耗珠子浓度的量存在。一旦该步骤完成，可能对修正的样品进行免疫测定例如电化学免疫测定以测定分析物的浓度。注意，干试剂的溶解和夹心形成步骤可同时发生或以逐步的方式发生。所述方法主要针对作为心血管标志物的分析物，例如Tnl、TnT、CKMB、肌红蛋白、BNP、NT-proBNP和proBNP，但也可用于其它标志物例如P -HCG, TSH、髓过氧化物酶、珠蛋白、D- 二聚体、CRP、NGAL和PSA。为了确保大部分白细胞在检测步骤之前已被隔离，优选将使品修正步骤进行约I分钟至约30分钟的范围内的选择的预定时间。优选在包括免疫传感器、导管、样品进入端口和样品保持室的筒中进行所述方法，其中用干试剂涂覆这些组件的至少一个的至少一部分。注意，干试剂可包括如下的一种或多种用于减少白细胞干扰的消耗珠子、缓冲剂、盐、表面活性剂、稳定剂、简单碳水化合物、复杂碳水化合物及各种组合。此外，干试剂还可包括针对分析物的酶标记的抗体(信号抗体)。
如上文中所建议的，除了使用完整IgG分子涂覆消耗珠子外或并非使用完整IgG分子涂覆消耗珠子(其中从连接至F(ab’)2区域的Fe区域形成单个单层，这继而包含两个Fab区域)，还可以使用IgG的片段。IgG片段化可使用二硫键还原(-S-S-至-SH HS-)与酶促胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化的组合以产生F(ab’) 2片段、Fab片段和/或Fe片段的一些组合来不同地实现。可通过层析分离这些片段以单独使用，或组合使用这些片段。例如，当封闭位点位于Fe片段上时，可使用片段而不使用完整IgG分子。这同样也适用于Fab片段和F(ab’)2片段。在实际测定步骤中，优选地一旦在固定的抗体与信号抗体之间形成夹心，随后就将样品介质洗涤至废料室，然后将夹心暴露于能够与酶反应以形成能够电化学检测的产物的底物。优选形式是电化学酶偶联免疫吸附测定。优选地，所述设备是对样品例如血液样品中的分析物进行免疫测定的设备，其中具有减少的来自白细胞的干扰。设备安放有电化学免疫传感器、导管和样品进入端口，其中导管允许样品以受控的方式通过进入端口至免疫传感器。在一个方面，至少一部分安装组 件利用可包含非人IgG-涂覆的消耗珠子的干试剂进行涂覆。重要特征是干试剂能够溶解于样品中并且在结合和优选吞噬中啮合白细胞。这通常足以隔离样品中的潜在干扰性白细胞。在优选实施方案中，所述设备还包括免疫-参考传感器。所述免疫传感器优选用于检测心血管标志物例如，分析物例如1'111、1'111\0(]\^、肌红蛋白、8册、见'- 1'08册和proBNP。设备在其中运转的系统通常允许样品与试剂保持接触持续预定时间例如I至30分钟。优选地，所述装置是一次性使用的筒(例如充满单个样品)，用于测试一次，随后弃去。通常，设备包括能够将样品洗至废料室的洗涤流体，和能够与免疫传感器上的酶夹心反应以形成适用于电化学检测的底物。更广泛地，本发明涉及在用于任何生物样品(其中通常存在白细胞)的分析物免疫测定中减少来自白细胞的干扰。此外，对修正的样品进行免疫测定以测定选择的分析物的浓度可基于多种技术，包括电化学技术，例如安培计技术和电位测定技术，以及还有光学技术，例如吸光度、荧光和发光。虽然已在BNP测试筒的情景下描述了本发明，但其同样地适用于其中白细胞存在并且可以是干扰的原因的任何免疫测定。例如，其可以以用于对怀疑存在于血液样品中的分析物进行免疫测定的试剂盒的形式存在，其中所述试剂盒包括针对白细胞进行了调理作用的消耗珠子、针对分析物的固定的第一抗体和针对分析的第二标记的抗体。此外，可对本领域已知的现有免疫测定形式进行修饰以包括消耗珠子，例如通过在样品预处理步骤中添加珠子。该预处理可通过将消耗珠子整合在血液收集设备中、独立容器中来实现，或可通过将消耗珠子整合在设备的测试循环中而在分析(免疫测定)设备本身中发生。方法或试剂盒不限于BNP，但可经改造适用于任何免疫测定，包括但不限于proBNP、NTproBNP、cTnl、TnT、HCG, TSH、PSA、D- 二聚体、CRP、肌红蛋白、NGAL, CKMB 和髓过氧化物酶。此外，所述方法和试剂盒适用于这样的测定其中用任何非人(包括鼠、羊、�：屠�)IgG或其片段涂覆消耗珠子，以及或者用活化的人IgG或其片段涂覆消耗珠子。消耗珠子可包含用选自蛋白质、细菌、病毒和异型生物质的材料或其片段涂覆的基底珠子，或可由静止或稳定的细菌细胞、孢子或其片段例如大肠杆菌提供，任选地不具有基底珠子。虽然上述优选测定使用附着至测定珠子(所述珠子继而附着至具有底层电极(underlying electrode)的多孔层)的固定的第一抗体，但可将第一抗体直接固定在电极或任何其它表面上，或固定在可溶性珠子上。所述试剂盒或方法可包括以可溶解的干试剂(包括进行了调理作用的消耗珠子作为可溶解的干试剂的一部分)的形式存在的第二标记的抗体，或其中两者存在于单独的干试剂位置中。注意，固定的和标记的抗体都可以是单克隆抗体、多克隆抗体、其片段及其组合。此外，第二抗体可用各种标记物包括放射性标记物、酶、生色团、荧光团、化学发光物质种类和免疫测定领域已知的其它标记物来进行标记。当用酶来标记第二抗体时，其优选为ALP、辣根过氧化物酶或葡糖氧化酶。所述试剂盒或方法适用于包含白细胞的任何样品，例如全血，并且所述样品可以是利用抗凝剂例如EDTA、肝素、氟化物、柠檬酸盐等修正的血液样品。当所述方法或试剂盒用于进行非-竞争性免疫测定时，存在依次的混合步骤，包括(i)将怀疑包含分析物的血液样品与进行了调理作用的消耗珠子混合；(ii)将血液样品与针对分析物的固定的第一抗体混合并且在固定的抗体与所述分析物之间形成复合物；和(iii)将血液样品与标记的第二抗体混合以形成具有所述分析物和所述固定的抗体的复合物。注意，这些混合步骤可同时进行或按有序顺序进行。例如，步骤(ii)和(iii)可同时进行，或可在步骤(ii)之前进行步骤(i)和(iii)。在最后的步骤中，测定在固定的第一抗体、分析物与标记的第二抗体之间形成的复合物的量。本发明的方法特别地涉及显著缓解白细胞在分析物免疫传感器上的积累，所述传感器由针对固定在电极上的分析物的抗体涂覆的测定珠子制造。在将怀疑包含分析物的样品与进行了调理作用的消耗珠子混合以形成修正的样品(其中样品中的白细胞优先吞噬消耗珠子)后，随后将修正的样品与免疫传感器接触。作为结果，白细胞在测定珠子上的积累最小化并存在测定珠子的吞噬，并且可实现可靠的测定。本发明的方法涉及对怀疑存在于血液样品中的分析物进行免疫测定，包括将怀疑包含分析物的血液样品与过量的进行了调理作用的消耗珠子混合以形成修正的样品，其中样品中的白细胞优先吞噬消耗珠子；将修正的样品与包含针对固定在电极上的分析物的抗体涂覆的珠子的免疫传感器接触；在所述抗体涂覆的珠子、所述分析物与第二标记的抗体之间形成夹心；从所述免疫传感器洗涤所述血液样品；以及利用所述免疫传感器测定所述夹心标记物的量和使所述标志的量与样品中分析物的浓度相关联。本发明的方法还涉及对怀疑存在于血液样品中的分析物进行免疫测定，包括将怀疑包含分析物的血液样品与过量的进行了调理作用的消耗珠子混合以形成修正的样品，其中样品中的白细胞优先吞噬消耗珠子；将修正的样品与针对分析物的抗体涂覆的珠子接触；在所述抗体涂覆的珠子、所述分析物与第二标记的抗体之间形成夹心；从所述抗体涂覆的珠子洗涤所述血液样品；和测定所述夹心标记物的量和使所述标记物的量与样品中的分析物的浓度相关联。本发明还涉及用于对怀疑存在于血液样品中的分析物进行免疫测定的测试筒，包括导管中的免疫传感器，其中所述免疫传感器具有针对分析物的固定的第一抗体。在该实施方案中，导管优选具有干试剂涂层或包含针对白细胞进行了调理作用的消耗珠子和针对所述分析物的第二标记的抗体的单独涂层。在操作中，干试剂溶解于所述血液样品中。根据下列非限定性实施例，本发明将变得更好理解。、
实施例I图7显示了根据相关在审美国申请12/411，325的特定实施方案的安培计免疫测定(用于测定肌钙蛋白I (TnI)，一种心脏坏死标志物的存在和量)的原理。将血液样品导入筒的样品保持室，通过将涂覆的干试剂溶解在样品保持室中来修正血液样品。干试剂包括IgM 77，其在溶解入样品后，选择性结合可包含在样品中的互补嗜异性抗体78。如所显示的，干试剂还包含IgG 79，其也在溶解于样品中后选择性结合互补抗体78。图10显示根据本发明的特定实施方案的用于测定心脏功能的标志物例如BNP和TnI的存在和量的安培计免疫测定的原理。将血液样品导入筒的样品保持室，通过将涂覆的干试剂溶解于样品保持室中来修正血液样品。干试剂包括消耗珠子102，其在溶解于样品中后选择性结合可包含在样品中的白细胞103。注意，干试剂还可以包含，并优选包含IgM和 IgG，如对于图7所描述的。此外，图7和10显示包含共价附着至信号抗体71例如多克隆抗-肌钙蛋白I抗体的碱性磷酸酶的缀合分子，也将其溶解于样品中。该缀合物特异性结合血液样品中的分析物70例如TnI或BNP，从而产生由结合至AP缀合物的分析物组成的复合物。在捕获步骤中，该复合物结合至附着在免疫传感器上或接近免疫传感器的捕获抗体72 (固定的抗体)。传感器芯片具有电导传感器，其用于监测样品到达传感器芯片的时间。流体的到达时间可用于检测筒内的渗漏到达的延迟发出渗漏的信号。可使用流体的边缘作为定位标志来主动控制传感器导管内样品区段的位置。由于样品/空气干扰穿过电导传感器，因此产生精确的信号，所述信号可用作流体标志物，从该流体标志物可执行受控的流体排出。优选在传感器上方对流体区段进行边靠边(edge-to-edge)的振荡，以将完整样品呈递至免疫传感器表面。可在传感器芯片之外的传感器导管中导入第二试剂，所述试剂在流体振荡过程中均匀分布。传感器芯片包括捕捉区和用针对目标分析物的抗体涂覆的区域。这些捕捉区由聚酰亚胺的疏水环或另一种光刻产生的层界定。将以一些形式(例如结合至乳胶微球体)包含抗体的一个或几个微滴(大小约5至40纳升)分配在传感器的表面上或传感器上的选择性渗透层上。光限定的环包含该含水微滴，从而允许抗体涂覆的区域定位至数个微粒的精确度。可产生大小为0.03至约2平方毫米的捕捉区。该大小的上限受到本实施方案中的导管和传感器的大小的限制，并且不是本发明的限制。因此，用与Tnl/AP-aTnl复合物结合的生物层73 (例如共价连接的抗-肌钙蛋白I抗体)涂覆金电极74。从而AP被固定至紧靠电极，与最初存在于样品中的分析物的量成正比。除了特异性结合外，酶-抗体缀合物可非特异性结合传感器。非特异性结合提供了来自传感器的本底，所述本底是不期望的并且优选将其减小至最小。如上所述，漂洗方案，特别是将分段流体用于漂洗传感器，提供了使该本底信号减小至最小的高效方法。在紧接漂洗步骤的第二步骤中，将被例如碱性磷酸酶水解以产生电活性产物76的底物75呈递给传感器。在具体的实施方案中，底物由磷酸化二茂铁或对-氨基苯酚组成。将安培计电极设置在足以氧化或还原水解底物的底物(但非直接氧化或还原所述底物)的固定电化学电位上，或将电位在适当的范围内扫描一次或多次。任选地，可以用这样的层涂覆第二电极在制造过程中制造分析物/AP抗-分析物的复合物例如Tnl/AP-aTnl，以用作用于测量的参考传感器或校准工具。
在本实施例中，传感器包括两个安培计电极，其用于检测从4-氨基苯基磷酸盐与酶标记碱性磷酸酶的反应酶促产生的4-氨基苯酚。优选从用聚酰亚胺的光限定的层涂覆的金表面产生电极。绝缘聚酰亚胺层中的规则间隔的开口界定了在其上以2个电子/分子反应氧化的4-氨基苯酚的小金电极的网格。传感器电极还包括生物层，而参考电极可以例如从不存在生物层的金电极或从银电极或其它适当的材料构建。不同的生物层可提供具有感知不同分析物的能力的各种电极。可选择底物例如对-氨基苯酚以便底物和产物的E (1/2)显著不同。优选地，底物的伏安半波电位E(l/2)比产物的显著更高(更加正)。当条件满足时，可在底物存在的情况下选择性电化学测量产物。电极的大小和间距在测定灵敏度和本底信号中起着重要作用。格子中的重要参数 是暴露的金属的百分比和活性电极之间的间距。电极的位置可以直接在抗体捕捉区之下或偏离捕捉区受控的距离。电极的实际安培计信号取决于传感器相对于捕捉抗体位置的定位和在分析过程中流体的运动。记录电极上的电流，所述电流取决于传感器附近的电活性产物的量。本实施例中碱性磷酸酶活性的检测依赖于4-氨基苯酚氧化电流的测量。这可在约+60mV相对于Ag/AgCl接地芯片的电位实现。所用的检测的确切形式取决于传感器构型。在传感器的一个形式中，金微电极的阵列直接位于抗体捕获区之下。当分析流体被拉在该传感器上方时，位于捕获位点上的酶在酶限制的反应中将4-氨基苯酚磷酸转化成4-氨基苯酚。选择4-氨基苯基磷酸的浓度以使之过剩，例如10倍于Km值。分析溶液是0. IM(在二乙醇胺中)，I. OM NaCl (被缓冲至pH 9. 8)。此外，分析溶液包含0. 5mM MgCl2，其为酶的辅因子。或者，碳酸盐缓冲液具有期望的性质。在另一个电极几何学实施方案中，电极位于离捕捉区域数百微米的地方。当将分析流体的新鲜区段拉至捕捉区上方时，酶产物建立而不存在因电极反应的丢失。在一段时间后，溶液被缓慢地从捕捉区拉至检测器电极上方，从而导致产生电流峰，从所述电流峰可测定酶活性。碱性磷酸酶活性的灵敏检测的重要考虑是与在金传感器上发生的本底氧化和还原相关的非-4-氨基苯酚电流。金传感器倾向于在这些电位上在碱性缓冲液中提供显著的氧化电流。本底电流在很大程度上取决于缓冲液浓度、金电极的面积(暴露的面积)、表面预处理和所用缓冲液的性质。二乙醇胺是特别好的用于碱性磷酸酶的激活缓冲液。在摩尔浓度上，酶促速率增加为非激活缓冲液例如碳酸盐的约3倍。在替代实施方案中，缀合至抗体或其它分析物-结合分子的酶是尿素酶，并且底物是尿素。通过使用铵灵敏电极在本实施方案中检测到了通过尿素的水解产生的铵离子。铵特异性电极对于本领域技术人员来说是公知的。适当的微制造的铵离子选择性电极公开于美国专利No. 5，200，051 (通过引用并入本文)中。与底物反应以产生离子的其它酶在本领域是已知的，对于与其一起使用的其它离子传感器在本领域也是已知的。例如，可在磷酸根离子选择性电极上检测到从碱性磷酸酶的底物产生的磷酸根。现参考图8，其中显示了微制备免疫传感器的实施方案的构建。优选地，提供平面非导电基底80，通过本领域技术人员已知的常规方法或微制造在所述非导电基底上沉积导电层81。导电材料优选是贵金属例如金或钼，虽然也可使用其它惰性金属例如铱，也可能使用石墨、导电聚合物或其它材料的非金属电极。还提供了电气连接82。将生物层83沉积在至少一部分电极上。在本公开内容中，生物层意指在其表面上包含充足量的分子84(所述分子可结合目标分析物或通过产生能够测量的变化来对这样的分析物的存在作出反应)的多孔层。任选地，可在电极与生物层之间插入选择性渗透筛选层以筛选电化学干扰，如美国专利No. 5，200，051中所描述的。在具体的实施方案中，从具有约0. 001至50微米的范围内的特定直径的乳胶珠子构建生物层。通过共价连接与上述生物层的定义一致的任何适当的分子来修饰珠子。本领域存在许多连接方法，包括提供胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺酯基团以容易地偶联蛋白质的赖氨酸或N-末端氨基。在具体的实施方案中，生物分子选自离子载体、辅因子、多肽、蛋白质、糖肽、酶、免疫球蛋白、抗体、抗原、外源凝集素、神经化学物质受体、寡核苷酸、多核苷酸、DNA、RNA或适当的混合物。在最具体的实施方案中，生物分子是经选择以结合人绒毛膜促性腺素、肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、肌钙蛋白C、肌钙蛋白复合物、肌酸激酶、肌酸激酶亚基M、肌酸激酶亚基B、肌红蛋白、肌球蛋白轻链或这些蛋白的经修饰的片段的一个或多个的抗体。此类修饰的片段是通过至少一个氨基酸的氧化、还原、缺失、添加或修饰(包括利用天然部分或利用合成部分的化学修饰)产生的。优选地，生物分子特异性结合分析物并且具 有约10_7至10_15M的结合分析物配体的亲和常数。在一个实施方案中，通过下列方法将包含具有通过适当分子共价修饰的珠子的生物层附着至传感器。将微分散针用于将一小微滴(优选约20nL)经修饰的珠子的悬浮液沉积在传感器表面上。允许微滴干燥，这导致在表面上形成在使用过程中抵抗排出的珠子的涂层。除了其中生物层相对于安培计传感器存在于固定位置中的免疫传感器外，本发明还设想了其中将生物层涂覆在可移动的颗粒例如测定珠子上的实施方案。筒可包含能够与分析物相互作用的可移动微粒，例如在捕获步骤之后定位至安培计电极的磁性颗粒，其中磁力被用于将颗粒浓缩在电极上以进行测定。本发明的可移动的微粒的一个有利方面是它们在样品或流体中的运动会加速结合反应，从而使得测定的捕捉步骤更快。对于使用非磁性可移动的微粒的实施方案，将多孔滤器用于在电极捕捉珠子。注意，关于本发明的消耗珠子，当测定珠子具有磁性时，消耗珠子优选是非磁性的并且被单独隔离。此外，当测定珠子不具有磁性时，消耗珠子优选是有磁性的并且被单独隔离。现参考图9，其中显示了用于单个基底上的几个电极的掩模设计。关于掩蔽和蚀刻技术，可沉积独立的电极和导线。因此，以低成本在紧凑的面积上提供多个免疫传感器94和96以及电导测定传感器90和92连同它们各自的连接垫91、93、95和97，以实现至读数装置的电气连接。原理上，可以以这样的方式装配非常大的传感器阵列，每一个传感器对不同的分析物灵敏或用作对照传感器或参考免疫传感器。具体地，可如下制备免疫传感器。加热氧化硅晶片以形成约I微米绝缘氧化物层。将钛/钨层溅射在氧化层上达到100至1000埃的优选厚度，然后溅射一层最优选800�：竦慕�。随后，将光致抗蚀剂旋制在晶片上，并干燥和适当地烘焙。随后使用接触掩模例如相应于图9中显示的接触掩模使表面曝光。对潜像(latent image)显影,将晶片与金-蚀刻剂接触。用光可限定的聚酰亚胺涂覆图案化的金层，适当地烘焙，使用接触掩模进行曝光，显影，在O2浆(plasma)中进行清洁，优选在350° C碘化5小时。可对晶片背侧进行任选的金属化以用作电阻加热元件(resistive heating element),其中免疫传感器将被用于恒温器形式中。随后用抗体涂覆的颗粒打印表面。将优选具有约20nL的体积并且包含1%固体内容物(在去离子水中)的微滴沉积在传感器区域并且通过风干原位干燥。任选地，将抗体稳定化剂(由SurModica Corp. or AET Ltd提供的)涂覆在传感器上。干燥颗粒以使它们以阻止在样品或包含底物的流体中溶解的方式粘附至表面。该方法提供了可靠且可重现的适用于制造高容量的传感器芯片的固定方法。实施例2关于筒的使用方法，未计量的流体样品通过样品进入端口 4被导入筒的样品保持室34。毛细管栓25阻止样品在该阶段进入导管15，并且使保持室34充满样品。关闭盖子2或组件200以阻止样品从筒渗漏。随后将筒插入读数装置，例如属于Zelin的美国专利No. 5，821，399 (将其通过引用并入本文)中公开的读数装置。将筒插入读数装置激活了机 械装置，当包装被压靠在尖状物38上时，所述机械装置刺穿位于42上的包含流体的包装。从而流体被排入第二导管，以39、20、12和11的顺序到达。12上的缢缩阻止液体的进一步运动，因为残余静水压被经第二导管部分11进入废料室44的流体流动所消散。在第二步骤中，泵装置的操作对气囊43施加压力，迫使空气通过导管40，通过切除物17和18，在预定的位置27进入导管34。毛细管栓25和位置27界定了原始样品的计量部分。当样品在样品保持室34内时，其被室的内表面上的包含消耗珠子和其它材料的干试剂涂层修正。随后通过在气囊43内产生的气压将样品的计量部分排出通过毛细管栓。样品通过导管15并且与位于切除物35内的分析物传感器接触。在使用位于切除物35内的免疫传感器的实施方案中，在样品到达传感器之前，利用例如酶-抗体缀合物(信号抗体)修正所述样品。为了促进分析物与传感器的高效结合，任选地将包含分析物的样品以振荡运动在传感器上方反复通过。优�。褂迷�0. 2至2Hz，最优选0. 7Hz的振荡频率。因此，使与信号抗体结合的信号酶紧邻安培计电极表面，与存在于样品中的分析物的量成正比。一旦已提供分析物/酶-抗体缀合物复合物结合免疫传感器的机会，就通过对气囊43进一步施加压力来射出样品，样品进入废料室44。洗涤步骤接着从传感器室除去非特异性结合的酶-缀合物和消耗珠子。通过泵装置43将第二导管中的流体移动至与传感器接触。分析流体被缓慢地拉动直至在电导传感器上检测到第一空气段。可通过任何适当的方法在导管内产生空气段，包括但不限于(I)被动方法，如图14中显示和下文中描述的；(2)主动方法，包括使用泵短暂地降低导管内的压力，其中空气通过瓣或阀门被抽入导管；或(3)通过溶解预置于导管内的化合物，所述化合物在与导管内的流体接触后释放气体，其中这样的化合物可包括碳酸盐、碳酸氢盐等。该区段在从导管15清除样品污染的流体上是极有效的。漂洗传感器区域的效率可通过如所描述的将一个或多个空气段导入第二导管来极大地增加。使空气段的前沿和/或后缘在传感器上通过一次或多次以漂洗和重悬浮可能已从样品沉积的外来物质。外来物质包括除特异性结合的分析物或分析物/抗体-酶缀合物复合物外的任何材料。然而，本发明的目的是使漂洗不要达到足以促进特异性结合的分析物或分析物/抗体-酶缀合物复合物从传感器分离的延长时间或剧烈程度。将空气段导入流体的第二有利方面是分割流体。例如，在流体的第一个区段用于漂洗传感器后，随后将第二区段置于传感器上方，两个区段以最低限度混合。该特征通过更有效率地除去未结合的抗体-酶缀合物而进一步减小来自传感器的本底信号。在前沿洗涤后，分析流体被缓慢地拉动直至在电导传感器中检测到第一空气段。该区段在清除与第一分析流体样品混合的样品污染的流体上是极有效的。为了进行测量，将新的流体部分置于传感器上方，并且将电流或电位记录为时间的函数(在对操作模式适宜的情况下)。实施例3现参考图15，其 中显示了免疫传感器筒的俯视图。筒150包括底座和顶部，优选由塑料构成。两个部分通过细的粘着性垫圈或细的柔性薄膜连接。如在先前的实施方案中一样，装配的筒包括样品保持室151(通过样品入口 167将包含目标分析物的样品导入其中)。如之前一样通过毛细管栓152 (优选由连接筒的两个部分的垫圈或薄膜中的0. 012英寸(0.3mm)的激光掏槽孔(laser cut hole)形成)和位于样品保持室内的预定的点上的进入点155 (通过泵装置例如浆的作用压迫样品膈膜156将空气由此处导入)的组合作用经样品导管154(第一导管)将样品的计量部分递送至传感器芯片153。在接触传感器以允许结合发生之后，样品被移动至排气口 157，该排气口包括吸收样品的芯吸材料，从而使关闭的排气孔密封以防止液体或空气的进一步通过。芯吸材料优选是棉花纤维材料、纤维素材料或具有孔的其它亲水材料。在本申请中重要的是所述材料具有充足的吸收力(即，具有足够的芯吸速度)，阀门在与下文中描述的样品膈膜驱动装置的随后缩回相当的时期内关闭，这样样品随后不被抽回传感器芯片的区域。如在特定的实施方案中显示的，提供了洗涤导管(第二导管)158，其在一端连接至排气口 159并且在另一端连接至位于排气口 157与传感器芯片153之间的样品导管的点160上的样品导管。在将筒插入读数装置后，流体被导入导管158。优选地，流体最初存在于箔袋161内，当驱动装置对小袋施压时所述箔袋被刺破。还提供了通过垫圈163中的小开口将流体连接至导管154的短导管162。第二毛细管栓最初防止流体到达毛细管栓160，以便流体保留在导管158内。在已关闭排气口 157后，开动泵，从而在导管154内产生降低的压力。排气口164(优选在垫圈中包括小瓣切(flap cut)或振动以提供间断气流的膜)提供了用于空气经第二排气口 165进入导管158的装置。第二排气口 165优选还包括当被湿润时能够关闭排气口的芯吸材料，需要时，所述芯吸材料允许样品膈膜156随后凹陷以封闭排气口 165。与样品膈膜156的驱动同时，流体经毛细管栓160从导管158被抽入导管154。因为流体的流动被空气进入口 164打断，所以至少一个空气段(区段或区段流)被导入。样品膈膜156的进一步缩回将包含至少一个空气段的液体抽回穿过传感器芯片153的传感表面。液体内空气-液体边界的存在增强了传感器芯片表面的漂洗以除去剩余样品。优选地，样品膈膜156的运动受到安装在与分析传感器相邻的传感器芯片内的电导电极接收的信号的控制。这样，液体在芯片上的存在可被检测到，并且可通过在分开的步骤中通过流体的运动来进行多个读取。当只有流体薄膜覆盖芯片、接地芯片(ground chip) 165和传感器与接地电极之间的导管154的壁的连续部分时，有利地在本实施方案中进行分析物测量。通过操作样品膈膜156抽出流体来获得适当的薄膜，直至紧邻传感器的电导测定传感器显示大体积液体不再存在于导管154的区域中。已发现可在极低(nA)电流下进行测量，因接地芯片与传感器芯片之间的薄膜的增加的阻抗(与大体积流体相比较)而产生的电位下降不明显。接地芯片165优选是银/氯化银。为了避免在相对疏水的氯化银表面上容易形成的空气段，有利地将接地芯片图案化为散布有更亲水的区域例如二氧化硅的表面的银/氯化银的小区域。因此，优选接地电极构型包括密集排列的并且散布有二氧化硅的银/氯化银方块的阵列。如果银/氯化银的区域有些凹陷，对于避免非有意的区段是更有利的。现参考图16，其中显示了免疫传感器筒的优选实施方案的流控技术的图解视图。区域R1-R7表示与特定操作功能相关的导管的特定区域。因此Rl表示样品保持室；R2是籍以将样品的计量部分排出至捕捉区域的样品导管，并且在所述导管中任选地用涂覆在导管壁上的物质修正样品；R3表示捕捉区域，其安放有电导测定传感器和分析物传感器；R4和R5表示任选地用于进一步利用涂覆在导管壁上的物质修正流体的第一导管的部分，通过其实现更复杂的测定方案；R6表示在将筒插入读数装置后，向其中导入流体的第二导管的部分；R7包括位于毛细管栓160与166之间的导管的一部分，在所述部分中可进行进一步修正；R8代表位于点160与排气口 157之间的导管154的部分，其还可被用于修正包含在其中的液体。实施例4关于流控技术和分析物测量的协作，在分析顺序中，用户将样品置于筒中，将筒置于分析仪中，并且在I至20分钟内，进行一种或多种分析物的定量测量。此处是在分析过程中发生的事件的顺序的非限定性实例(I)将25至50 ii L样品导入样品入口 167，然后填充至毛细管栓151，该毛细管栓由在将罩子和底座组件保持在一起的胶带中的0.012英寸(0. 3mm)的激光掏槽孔形成。将 一种或多种包含消耗珠子+任选地用于缓解干扰的其它材料和优选地信号抗体的干试剂涂层溶解在样品中。用户旋转安装在按钮瓣(snap flap)上的乳胶橡胶盘以关闭样品入口167和将筒置于分析仪中。(2)分析仪与筒接触，然后马达驱动的活塞压在箔袋161上迫使洗涤/分析流体流出进入中央导管158。(3)独立的马达驱动的活塞接触样品膈膜156，沿着样品导管推动样品的测量区段(从试剂区域Rl至R2)。通过电导传感器在传感器芯片153上检测样品。传感器芯片位于捕获区域R3。(4)以预定和受控的方式利用R2与R5之间的样品膈膜156振荡样品，持续受控的时间，以促进与传感器的结合。(5)将样品推向筒的废液区(R8)并且与以纤维素或类似的吸收芯形式存在的被动泵157接触。湿润该芯的作用使芯对气流产生密封，从而消除其排泄由样品膈膜156产生的多余压力的能力。主动排气口(active vent)成为图16的“受控排气口 ” (6)样品导管的快速排空(通过从样品膈膜156缩回马达驱动的活塞来实现)迫使空气(来自排气口)和洗涤/分析流体的混合物从第二导管移动进入位于图16中的R5与R4之间的进口。通过重复样品导管的快速排空，产生一系列空气分隔的流体区段，所述区段被拉动穿过传感器芯片朝向样品入口(从R4至R3至R2和R1)。这洗涤不含过量试剂的传感器并且利用适用于分析的试剂湿润传感器。源自箔袋的洗涤/分析流体还可通过在中央洗涤/分析流体导管内的R7与R6中添加试剂来修正。
(7)洗涤/分析流体区段以更慢的速度被抽向样品入口以产生只包含一薄层分析流体的传感器芯片。在该点上进行电化学分析。优选分析方法是电流测定法但也可使用电位测定法或阻抗检测。(8)机械装置收回，从而使筒从分析仪取出。实施例5在一些实施方案中，为了评估在测定过程中发生的非特异性结合的程度，设备利用免疫-参考传感器。除免疫试剂是抗-HSA(人血清白蛋白)抗体而非抗-分析物抗体夕卜，以与分析物免疫传感器同样的方式制造免疫-参考传感器。在与人全血或血浆样品接触后，参考电极被特异性结合的HAS涂覆，HAS是存在于所有人血液样品中的丰富的内源蛋白质，从而为所有使用本发明的免疫测定形式的单个测试运行提供共同参照。因不充分的洗涤而产生的或因干扰存在而产生的NSB可通过该第二传感器来监测。来自测定的净信号由从分析物免疫传感器产生的特异性信号(通过扣除从参考 传感器产生的非特异性信号而修正)组成，例如净信号=分析物传感器信号-参考传感器信号-偏移，如上述公式4中显示的。“偏移”是解释待经历NSB的两个传感器的趋势的差异的系数。实际上，其解释每一个传感器在它们非特异性结合缀合物的能力方面的相对“粘度”，并且是基于不含分析物和不含干扰的样品的反应建立的。这可通过独立实验来进行。在参考传感器上耐受的信号的量受制于由质量控制算法确定的限制，所述算法寻求在低分析物浓度上保证结果的完整性，其中NSB的效应最可能以可在临床环境中改变决策制定的方式影响测定结果。基本原理是过量信号在参考传感器上的存在用作NSB存在(因不充分的洗涤步骤或干扰而产生的)的标识。虽然上述的本发明通常涉及在利用全血样品的分析物免疫测定中减少或消除来自白细胞的干扰，但其也适用于在其它类型的生物样品(在所述生物样品中可能存在白细胞，例如脑脊髓液)中进行的免疫测定。此外，其适用于其中可存在残留白细胞(虽然有意地通过离心或过滤除去它们)的样品，例如血浆。其也适用于可以例如利用缓冲液稀释的样品。此外，虽然本发明通常涉及通过将干试剂溶解在样品中来修正样品，但其也实际上在其它实施方案中用于在分析过程中或在样品收集过程中将试剂以液体形式添加至样品。也明显地，在本文中已在电化学检测方法例如安培计法和电位测定法方面描述了本发明，虽然其同样地适用于其它检测模式，特别是光传感法例如基于发光、荧光和吸光度的方法。虽然已根据多个优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员承认可进行各种修饰、置换、省略和改变而不背离本发明的精神。例如，虽然说明书的部分涉及非竞争性夹心免疫测定法，但本发明的设备和方法类似地可用于竞争性免疫测定。此外，其目的是，本发明的范围仅受下列权利要求的范围限制。
权利要求
1.一种用于对怀疑存在于血液样品中的分析物进行夹心式免疫测定的试剂盒，包括针对白细胞进行了调理作用的消耗珠子，针对分析物的固定的第一抗体和针对分析物的标记的第二抗体。
2.权利要求I的试剂盒，其中所述分析物选自BNP、proBNP、NTproBNP、cTnI、TnT、HCG、TSH、PSA、D- 二聚体、CRP、肌红蛋白、NGAL, CKMB和髓过氧化物酶。
3.权利要求I的试剂盒，其中所述消耗珠子包括用非人IgG或其片段涂覆的基底珠子。
4.权利要求3的试剂盒，其中所述基底珠子由选自聚苯乙烯、聚丙烯酸和葡聚糖的材料形成。
5.权利要求I的试剂盒，其中所述消耗珠子包括利用选自蛋白质、细菌、病毒和异型生物质的材料或其片段涂覆的基底珠子。
6.权利要求I的试剂盒，其中所述消耗珠子是经稳定的细菌或细菌孢子。
7.权利要求I的试剂盒，其中所述消耗珠子具有O.01 μ m至20 μ m的平均粒度。
8.权利要求I的试剂盒，其中所述消耗珠子具有O.I μ m至5 μ m的平均粒度。
9.权利要求I的试剂盒，其中所述消耗珠子以足以提供每微升样品至少IO4个珠子的溶解的消耗珠子浓度的量存在。
10.权利要求I的试剂盒，其中所述固定的第一抗体附着至传感器，所述传感器选自安培计电极、电位测定电极、电导测定电极、光波导、表面等离子体共振传感器、声波传感器和压电式传感器。
11.权利要求I的试剂盒，其中固定的第一抗体附着至测定珠子，并且测定珠子附着至安培计电极。
12.权利要求I的试剂盒，其中所述消耗珠子和第二标记的抗体在一种或多种可溶解的干试剂涂层中。
13.权利要求I的试剂盒，其中所述标记的第二抗体用选自放射性标记物、酶、生色团、荧光团和化学发光物质种类的标记物进行标记。
14.权利要求I的试剂盒，其中所述标记的第二抗体用选自碱性磷酸酶、葡萄糖苷酶、黄递酶、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的酶标记。
15.一种用于对怀疑存在于血液样品中的分析物进行夹心式免疫测定的筒，所述筒包括 (a)接收血液样品的样品入口； (b)用于计量血液样品以形成计量样品的计量室； (C) 一个或多个包含针对白细胞进行了调理作用的消耗珠子和针对分析物的标记的抗体的干试剂涂层； (d)包含针对分析物的固定抗体的电极；和 (e)用于将计量样品、流态化的消耗珠子和标记的抗体移至电极的一个或多个泵件。
16.权利要求15的筒，其中所述分析物选自BNP、proBNP、NTproBNP,cTnl、TnT, HCG,TSH、PSA、D- 二聚体、CRP、肌红蛋白、NGAL, CKMB和髓过氧化物酶。
17.权利要求15的筒，其中所述消耗珠子包括用非人IgG或其片段涂覆的基底珠子。
18.权利要求17的筒，其中所述基底珠子由选自聚苯乙烯、聚丙烯酸和葡聚糖的材料形成。
19.权利要求15的筒，其中所述消耗珠子有O.Ol μ m至20 μ m的平均粒度。
20.权利要求15的筒，其中所述消耗珠子以足以提供每微升样品至少IO4个珠子的溶解的消耗珠子浓度的量存在。
21.权利要求15的筒，其中一个或多个干试剂涂层沉积在计量室内。
22.—种对怀疑存在于血液样品中的分析物进行夹心式免疫测定的方法，包括 (a)将怀疑含有分析物的血液样品暴露于针对白细胞进行了调理作用的消耗珠子、针对分析物的固定的第一抗体、和标记的第二抗体以形成包含所述第一抗体、所述分析物和所述第二抗体的复合物；和 (b)测定复合的标记物的量。
23.权利要求22的方法，其中所述消耗珠子在有效地使样品中的白细胞优先吞噬消耗珠 子的条件下接触血液样品。
24.权利要求22的方法，其中所述分析物选自BNP、proBNP、NTproBNP、cTnI、TnT、HCG、TSH、PSA、D- 二聚体、CRP、肌红蛋白、NGAL, CKMB和髓过氧化物酶。
25.权利要求22的方法，其中所述消耗珠子包括用非人IgG或其片段涂覆的基底珠子。
26.权利要求25的方法，其中所述基底珠子由选自聚苯乙烯、聚丙烯酸和葡聚糖的材料形成。
27.权利要求22的方法，其中所述消耗珠子具有O.01 μ m至20 μ m的平均粒度。
28.权利要求22的方法，其中所述消耗珠子具有O.I μ m至20 μ m的平均粒度。
29.权利要求22的方法，其中所述消耗珠子以足以提供每微升样品至少IO4个珠子的溶解的消耗珠子浓度的量存在。
30.权利要求22的方法，其中所述血液样品是以抗凝剂修正的全血。
31.权利要求22的方法，其中所述血液样品与消耗珠子混合，然后与固定的第一抗体混合，然后与标记的第二抗体混合。
32.权利要求22的方法，其中在大体上相同的时间所述血液样品与消耗珠子、固定的第一抗体和标记的第二抗体混合。
33.权利要求22的方法，其中在大体上相同的时间所述血液样品与固定的第一抗体和标记的第二抗体混合。
34.权利要求22的方法，其中在血液样品与固定的第一抗体混合之前，在大体上相同的时间血液样品与消耗珠子和标记的第二抗体混合。
35.一种实质性减少白细胞在分析物免疫传感器上积累的方法，所述免疫传感器包含固定在电极上的针对分析物的抗体涂覆的珠子，所述方法包括步骤 a)将怀疑包含分析物的样品与消耗珠子混合以形成修正的样品，其中样品中的白细胞优先吞噬消耗珠子，和 (b)将修正的样品与免疫传感器接触。
36.权利要求35的方法，其中所述消耗珠子以足以提供每微升样品至少IO4个珠子的溶解的消耗珠子浓度的量存在。
37.一种对怀疑存在于血液样品中的分析物进行免疫测定的方法，包括 (a)将怀疑包含分析物的血液样品与过量的消耗珠子混合以形成修正的样品，其中样品中的白细胞优先吞噬消耗珠子；(b)将修正的样品与包含固定在电极上的针对分析物的抗体涂覆的珠子的免疫传感器接触，以在所述抗体-涂覆的珠子、所述分析物和第二标记抗体之间形成夹心； (C)从所述免疫传感器洗涤所述血液样品；和 (d)使用所述免疫传感器测定所述夹心式标记物的量和使所述标记物的量与样品中的分析物的浓度相关联。
38.一种用于对怀疑存在于血液样品中的分析物进行夹心式免疫测定的方法，所述方法包括 (a)将怀疑包含分析物的血液样品与过量的进行了调理作用的消耗珠子混合以形成修正的样品，其中样品中的白细胞优先吞噬消耗珠子； (b)将修正的样品与针对分析物的抗体涂覆的珠子在有效地在所述抗体涂覆的珠子、所述分析物和第二标记抗体之间形成夹心的条件下接触； (C)从所述抗体涂覆的珠子洗涤所述血液样品；和 (d)测定所述夹心式标记物的量和使所述标记物的量与样品中的分析物的浓度相关联。
39.一种用于对怀疑存在于血液样品中的分析物进行免疫测定的测试筒，所述测试筒在导管中包含免疫传感器，所述免疫传感器具有针对分析物的固定的第一抗体，所述导管具有沉积在其中的干试剂涂层，所述干试剂涂层包含消耗珠子和针对所述分析物的第二标记的抗体并且被配置为溶解于所述血液样品中。
全文摘要
本发明涉及用于在分析物免疫测定、尤其是非竞争性免疫测定中减少来自白细胞的干扰的方法和设备。在一个实施方案中，本发明是包括如下步骤的方法(a)用消耗珠子修正生物样品例如全血样品；和(b)对修正的样品进行竞争性免疫测定以测定所述分析物在所述样品中的浓度。优�。肐gG-涂覆的消耗珠子修正样品。
文档编号G01N33/543GK102713627SQ201080061356
公开日2012年10月3日 申请日期2010年11月17日 优先权日2009年11月17日
发明者A·R·摩丝, G·戴维斯, J·L·E·坎贝尔 申请人:雅培医护站股份有限公司
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