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专利名称：一种检测碳水化合物类农产品中重金属的方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种提取重金属的方法，特别涉及一种检测碳水化合物类农产品中重金属的方法与应用。该方法是一种简便、高效、准确的检测方法。
背景技术：
近年来，我国的经济有了飞速的发展，但与此同时所引发的环境污染也愈加明显， 特别是工业和加工制造业带来的大气、水体、土壤的重金属污染。水体、土壤及农田的重金属污染是造成蔬菜、水果及粮食等农产品中重金属含量超标的最主要原因。
重金属铜、铅、镉主要是通过食物和呼吸进入人体。虽然农产品中重金属一般情况下不会造成人们急性中毒，但重金属通过食物链在人体内蓄积，进而影响人体健康。面对越来越严峻的环境污染所引发的食品，特别是农产品的安全问题，对人民群众的健康产生了不利影响以及潜在的风险。建立一种快速、简捷、高效和安全的食品中重金属的检测技术迫在眉睫。
近年来，免疫学检测技术已广泛应用于毒素、杀虫剂、炸药等领域的检测。随着免疫学检测技术在重金属检测上的日臻成熟，ELISA试剂盒已成为了一种快速、简便和可靠的检测手段，其应用解决了传统检测技术检测需要大型分析仪器、仪器价格昂贵、操作繁琐、 要求检测人员具备一定的专业知识等弊端。它可以代替传统检测技术适应企业质控和产品检验、产品的现场抽查及产品进出口的快速通关的要求。
本课题组已经成功制得了重金属铅的酶联免疫试剂盒，可以检测环境水样中的铅离子。已将其申请专利，申请号为“201010539824. 8”、申请名称为“一种快速检测重金属铅离子的免疫学方法与试剂盒”。镉离子和铅离子的胶体金试剂条已制备成功，可以成功检测液态的重金属离子。已有的研究成果表明，ELISA重金属检测方法只能检测液态离子态的重金属，无法检测结合态的重金属。因此，要将ELISA重金属检测方法高效、快速地应用于实际工作中，还需解决重要但繁琐的样品前处理技术的问题。目前，农产品及食品中重金属的前处理技术有湿法消化法、干法灰化法和微波消解法，均是破坏有机质，将样品转变为液态澄清溶液进行测定。这些前处理技术虽然能准确提取样品中的重金属，但费时、费力且产生大量有害气体，获得的消解液具有强酸性，而ELISA中的酶免反应需要在一个温和的环境(中性至偏弱碱性)下进行，所以传统的样品前处理方法得到的消解液无法直接应用于 ELISA检测重金属。发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测碳水化合物类农产品中重金属的方法。
本发明的另一目的在于提供所述检测碳水化合物类农产品中重金属的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现一种检测碳水化合物类农产品中重金属的方法，包括以下步骤
(I)样品的前处理将碳水化合物类农产品洗净、匀浆，加入稀酸浸提；接着去除不溶性物质，得到含有重金属离子的待测样品溶液；
(2)将待测样品溶液直接用于酶联免疫吸附反应(ELISA)，得到待测样品中重金属含量。
步骤(I)中所述的碳水化合物类农产品为蔬菜类农产品、水果类农产品或粮食类农产品；
所述的蔬菜类农产品优选为菜心、胡萝卜及南瓜；
所述的水果类农产品优选为苹果、葡萄及香蕉；
所述的粮食类农产品优选为大米、小麦及糙米；
步骤⑴中所述的稀酸指的是浓度小于6mol/L的酸；优选浓度为I 4mol/L的酸溶液；更优选为2 4mol/L ；
所述的酸溶液优选为HCl溶液、HNO3溶液或H2SO4溶液；
步骤⑴中所述的浸提的条件优选为4 70°C浸提10 20min ；
所述的去除不溶性物质的方式优选为离心；
所述的离心的条件优选为4000 8000rpm离心15min ;更优选为10000 13000rpm 离心 IOmin ；
步骤(I)中所述的重金属离子优选为铜离子、铅离子或镉离子；
步骤⑵中所述的酶联免疫吸附反应优选为间接竞争ELISA检测方法；
所述的间接竞争ELISA检测方法的过程如下
①包被用碳酸盐缓冲液溶解重金属-螯合剂-蛋白质复合物，将其包被于酶标板微孔；
②洗板甩干板孔中液体，然后向孔中加入PBS-T洗涤液，放置，再轻轻晃动，弃去洗液，拍干，重复洗板三次；
③封闭用含有脱脂奶粉的PBST缓冲液封闭；如前法洗板三次；
④加样在ELISA酶标板孔中依次加入重金属离子标准品以及前述的含有重金属离子的待测样品溶液，再加入重金属离子抗体工作液，用盖板膜封板，孵育；取出酶标板，如如法洗板二次；
⑤加酶标记二抗加入HRP-羊抗鼠IgG抗体工作液，孵育；取出酶标板，洗板五次；
⑥加显色液加入TMB显色液，轻轻振荡混匀，室温避光反应；
⑦终止反应加入H2SO4终止反应；于酶标仪450nm处测定每孔吸光度值；
⑧结果判定所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(BO)再乘以100%，即百分吸光度值；
百分吸光度值(％) = B/B0X100% ；
式中B_标准溶液或样本溶液的平均吸光度值；
B0-0ng/ml标准溶液的平均吸光度值；
以标准品百分吸光率为纵坐标，以重金属标准品浓度(ng/ml)的对数为横坐标， 绘制标准曲线图，将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中重金属实际浓度。
步骤①中所述的碳酸盐缓冲液的浓度为0. 05M，pH值为9. 6 ；
步骤①中所述的重金属-螯合剂-蛋白质复合物优选为Cu2+-DTPA-OVA、 Pb2+-DTPA-OVA 或 Cd2+-DTPA-OVA ；
所述的重金属-螯合剂-蛋白质复合物的用量优选为96孔板中每孔使用16ng ；
步骤①中所述的包被的条件优选为于4°C包被16h ；
步骤②中所述的PBST是含有体积百分比0. 05% Tween-20的PBS溶液；PBS的浓度为 0.015M，pH 值为 7. 4 ；
步骤②中所述的放置的时间优选为2 4min ；
步骤③中所述的含有脱脂奶粉的PBST缓冲液中脱脂奶粉的浓度为0. 05g/ml ； PBST是含有体积百分比0. 05% Tween-20的PBS溶液；PBS的浓度为0. 015M, pH值为7. 4 ；
步骤③中所述的封闭的条件优选为37°C反应Ih ；
步骤④中所述的孵育的条件优选为37°C孵育Ih ；
步骤⑤中所述的孵育的条件优选为37°C孵育30min。
前述检测碳水化合物类农产品中重金属的方法在碳水化合物类农产品的重金属检测中的应用。
本发明相对于现有技术具有以下的优点及效果
(I)本发明所述的检测碳水化合物类农产品中重金属的方法中的前处理步骤可以用于蔬菜类、水果类、粮食类农产品中重金属离子铜、铅、镉的浸提，不仅加快了重金属从样品中浸提出来的时间，同时也减少了传统的样品前处理技术带来的环境污染。该步骤的反应条件温和。对于菜心、胡萝卜和苹果来说，该步骤完全可以取代传统的样品前处理方法进行重金属的浸提。
(2)本发明所提供的检测碳水化合物类农产品中重金属的方法实现农产品的现场快速、高效及便捷的检测。


图I是本发明与GF-AAS联用前处理步骤两种方法分别测定碳水化合物类农产品中重金属铜的比较结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例I
(I)样品的制备
先用自来水将样品(蔬菜、水果)冲洗干净，再用超纯水漂洗3次，擦干水分。用食品匀浆机进行匀浆，储于250ml的烧杯中，_4°C下冷冻保存备用。
粮食样品则直接干磨至粉末状，储于密封盒内常温下保存备用。
(2)样品的前处理(稀酸浸提样品)
①蔬菜类农产品
A、称取步骤(I)中制备的菜心2. 0g，将其置于IOml离心管中，加入2. OM的HCl 溶液2. Oml,常温下反应20min,于4000rpm下离心15min,取上清液置于2ml的离心管中， 13000rpm下离心IOmin,取上清液并调节pH值至6. 0 8. 0,定容至4ml, GF-AAS (石墨炉原子分光光度计)测定其重金属铜、铅、镉的含量，结果与国标法样品前处理方法(前处理方法为微波消解法,可参考 GB/T5009. 13-1996,GB/T 5009. 15-2003 及 GB/T5009. 12-2010) 的测定结果的比值依次为86. 95%,72. 39%,89. 78%。
石墨炉原子分光光度计使用C型热解石墨管，光温度控制加热方式，偏振塞曼法对背景信号校正。仪器的主要参数和工作条件分别见表I和2。
表I仪器工作参数
权利要求
1.一种检测碳水化合物类农产品中重金属的方法，其特征在于包括以下步骤(1)样品的前处理将碳水化合物类农产品洗净、匀浆，加入稀酸浸提；接着去除不溶性物质，得到含有重金属离子的待测样品溶液；(2)将待测样品溶液直接用于酶联免疫吸附反应，得到待测样品中重金属含量；所述的碳水化合物类农产品为蔬菜类农产品、水果类农产品或粮食类农产品；所述的稀酸指的是浓度小于6mol/L的酸。
2.根据权利要求I所述的检测碳水化合物类农产品中重金属的方法，其特征在于所述的蔬菜类农产品为菜心、胡萝卜及南瓜；所述的水果类农产品为苹果、葡萄及香蕉；所述的粮食类农产品为大米、小麦及糙米。
3.根据权利要求I所述的检测碳水化合物类农产品中重金属的方法，其特征在于所述的稀酸指的是浓度为I 4mol/L的酸溶液。
4.根据权利要求3所述的检测碳水化合物类农产品中重金属的方法，其特征在于所述的酸溶液为HCl溶液、HNO3溶液或H2SO4溶液。
5.根据权利要求I所述的检测碳水化合物类农产品中重金属的方法，其特征在于所述的浸提的条件为4 70°C浸提10 20min ；所述的去除不溶性物质的方式为离心；所述的重金属离子为铜离子、铅离子或镉离子。
6.根据权利要求5所述的检测碳水化合物类农产品中重金属的方法，其特征在于所述的离心的条件为4000 8000rpm离心15min。
7.根据权利要求I所述的检测碳水化合物类农产品中重金属的方法，其特征在于所述的酶联免疫吸附反应为间接竞争ELISA检测方法。
8.根据权利要求7所述的检测碳水化合物类农产品中重金属的方法，其特征在于所述的间接竞争ELISA检测方法的过程如下①包被用碳酸盐缓冲液溶解重金属-螯合剂-蛋白质复合物，将其包被于酶标板微孔；②洗板甩干板孔中液体，然后向孔中加入PBS-T洗涤液，放置，再轻轻晃动，弃去洗液，拍干，重复洗板三次；③封闭用含有脱脂奶粉的PBST缓冲液封闭；如前法洗板三次；④加样在ELISA酶标板孔中依次加入重金属离子标准品以及前述的含有重金属离子的待测样品溶液，再加入重金属离子抗体工作液，用盖板膜封板，孵育；取出酶标板，如前法洗板二次；⑤加酶标记二抗加入HRP-羊抗鼠IgG抗体工作液，孵育；取出酶标板，洗板五次；⑥加显色液加入TMB显色液，轻轻振荡混匀，室温避光反应；⑦终止反应加入H2SO4终止反应；于酶标仪450nm处测定每孔吸光度值；⑧结果判定所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值除以第一个标准的吸光度值再乘以100%，即百分吸光度值；百分吸光度值(％ ) = B/B0X100% ；式中B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值；B0-0ng/ml标准溶液的平均吸光度值；以标准品百分吸光率为纵坐标，以重金属标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图，将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中重金属实际浓度。
9.根据权利要求8所述的检测碳水化合物类农产品中重金属的方法，其特征在于步骤①中所述的碳酸盐缓冲液的浓度为0. 05M，pH值为9. 6 ；步骤①中所述的重金属-螯合剂-蛋白质复合物为Cu2+-DTPA-OVA、Pb2+-DTPA-OVA或 Cd2+-DTPA-OVA ；所述的重金属-螯合剂-蛋白质复合物的用量为96孔板中每孔使用16ng ；步骤①中所述的包被的条件为于4°C包被16h ；步骤②中所述的PBST是含有体积百分比0. 05% Tween-20的PBS溶液；PBS的浓度为 0. 015M, pH 值为 7. 4 ；步骤②中所述的放置的时间为2 4min ；步骤③中所述的含有脱脂奶粉的PBST缓冲液中脱脂奶粉的浓度为0. 05g/ml ；PBST是含有体积百分比0. 05% Tween-20的PBS溶液；PBS的浓度为0. 015M, pH值为7. 4 ；步骤③中所述的封闭的条件为37V反应Ih ；步骤④中所述的孵育的条件为37°C孵育Ih ；步骤⑤中所述的孵育的条件为37°C孵育30min。
10.权利要求I 9所述检测碳水化合物类农产品中重金属的方法在碳水化合物类农产品重金属检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测碳水化合物类农产品中重金属的方法与应用。本发明所述的方法具体如下将碳水化合物类农产品匀浆，加入稀酸浸提；接着去除不溶性物质，离心取上清液得到含有重金属离子的溶液；将待测样品溶液直接用于酶联免疫吸附反应，得到待测样品中重金属含量。本发明所述的方法可以用于蔬菜、水果及粮食类农产品中重金属离子铜、铅、镉的浸提，不仅加快了重金属从样品中浸提出来的提取时间，同时也减少了传统的样品前处理技术带来的环境污染。该方法的反应条件温和，实现农产品的现场快速、高效及便捷的检测。
文档编号G01N1/28GK102539742SQ20111041683
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者唐勇, 李支微, 江天久, 江涛, 邹军辉 申请人:暨南大学