专利名称：一种测定红花黄色素含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种红花黄色素检测方法，具体地说，涉及一种检测红花黄 色素及含量的方法。属于药物领域。
背景技术：
红花属菊科植物红花CaW/ww^f/""w/iwL.的干燥花，具有活血化淤、通 经之功效。红花是当今世界研究和应用的"热点"植物之一，对它的化学成 分的研究，己有大量文献报导，红花黄色素经药理研究证明是红花的主要药 效部位，其中主要活性成分为红花黄色素。
现有技术已有大量红花黄色素或者红花黄色素有效部位及其制剂的文献 报道。关于红花黄色素或者红花黄色素的测定方法，也有一些报道。为了有 效地控制红花黄色素或者红花黄色素药物制剂质量，确保原料或者中间体品 质，需要提供一种便捷、有效地红花黄色素产品质量品价方法，特别是检测 方法，从而可以保证药品制剂质量有效和可控。
发明内容
为此，本发明主要目的是提供一种有效、可控、便捷地检测红花黄色素 的方法，进而可以有效地评估红花黄色素产品质量和品质。
为实现上述发明目的，本发明技术方案如下
本发明提供一种检测红花黄色素的方法，其包括如下步骤-
(1) 红花黄色素的检测，用薄层色谱法或者紫外分光光度法检测红花黄色素
的供试品中红花黄色素；
(2) 总黄酮的含量测定，用紫外分光光度法，以羟基红花黄色素A为对照品，
测定波长为360nm，测定红花黄色素的供试品中总黄酮含量；
(3) 羟基红花黄色素A的含量测定，用高效液相色谱法，以羟基红花黄色素 A为对照品，用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，用甲醇、乙腈、水和 磷酸的混合溶剂为流动相，测定波长为360nm，理论塔板数按羟基红花
黄色素A峰计算应不低于3000，测定红花黄色素供试品中羟基红花黄 色素A的含量。
本发明所述的红花黄色素，均系从红花中提取、分离、纯化得到的总黄 酮，可以通过现有技术已知方法从红花原药材中提取、分离、纯化得到红花 黄色素。例如CN1600817A、 CN1935176A、 CN101007828A等专利申请中公 开的红花中提取、分离、纯化得到的红花黄色素或者红花黄色素或者红花提 取物产品等。前述专利申请公开内容引入本申请作为参考。
本发明上述所述的方法，其中步骤(1)红花黄色素的检测，可以通过薄 层色谱法检测。例如可以红花黄色素作为对照品，采用聚酰胺薄层色谱、硅 胶薄层色谱等方法检测供试品中的红花黄色素。也可以采用紫外分光光度法， 检测样品在一定波长范围内测定其最大吸收波长，测定样品中的红花黄色素。
其中，作为优选实施方案，本发明采用薄层色谱法检测红花黄色素的供 试品中红花黄色素。并且优选步骤(1)所述的薄层色谱，是以聚酰胺为吸附 剂，水、乙醇、甲酸和乙酰丙酮的混合溶剂为展开剂，以羟基红花黄色素A 为对照品，薄层色谱展开后，供试品与对照品色谱相应的位置尚显现相同的 点。
其中，更加优选所述的展开剂为水、乙醇、甲酸和乙酰丙酮的混合溶剂， 按体积比配伍，水:乙醇:甲酸:乙酰丙酮为5:1.5:1:0.5的混合溶剂。
作为本发明的另一实施方案，其中步骤(1)紫外分光光度法检测红花黄 色素的供试品中红花黄色素，在221 227nm波长处有最大吸收峰。
其中，本发明上述所述的检测方法，其中步骤(3)中所述的流动相，优 选按体积比配伍，甲醇:乙腈:水:磷酸为32:3:64.5:0.5的混合溶剂。
本发明另一目的，是提供一种检测注射用红花黄色素的方法，其中所述 的红花黄色素系从红花中提取分离、纯化得到的总黄酮，其包括如下步骤
(1) 红花黄色素的检测，用薄层色谱法或者紫外分光光度法检测出注射用红 花黄色素中的红花黄色素；
(2) 总黄酮的含量测定，用紫外分光光度法，以羟基红花黄色素A为对照品， 检测波长为360nm，测定出注射用红花黄色素中的总黄酮含量；
(3) 羟基红花黄色素A的含量测定，用高效液相色谱法，以羟基红花黄色素
A为对照品，用十八垸基硅垸键合硅胶为固定相，用甲醇:乙腈:水:磷酸 的体积比为32:3:64.5:0.5的混合溶剂为流动相，检测波长为360nm，理 论塔板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000，测定出注射用红 花黄色素中的羟基红花黄色素A含量。
其中，上述所述的方法，优选步骤(1)采用薄层色谱法检测注射用红花
黄色素中的红花黄色素，薄层色谱是以聚酰胺为吸附剂，水:乙醇:甲酸:乙酰
丙酮的体积比为5:1.5:1:0.5的混合溶剂为展开剂，羟基红花黄色素A为对照 n
叫o
上述所述的方法，其中步骤(i)采用紫外分光光度法检测注射用红花黄
色素中的红花黄色素，在221 227nm波长处有最大吸收峰。
上述所述的注射用红花黄色素的检测方法，其检测红花黄色素冻干粉针 剂，规格为50mg/每瓶，其中步骤(2)中总黄酮含量不得少于38.25mg，步 骤(3)中羟基红花黄色素A含量应为31.5 38.5mg。
本发明所述的注射用红花黄色素，也是从红花中提取、分离、纯化得到 的纯度较高的总黄酮，可以通过现有技术己知方法从红花原药材中提取、分 离、纯化得到红花黄色素。例如CN1600817A、 CN1935176A、 CN101007828A 等专利申请中公开的红花中提取、分离、纯化得到的红花黄色素或者红花黄 色素或者红花提取物产品等。前述专利申请公开内容引入本申请作为参考。
例如本发明所述的注射用红花黄色素，可以通过如下方法制备得到称 取红花，加10-13倍药材重量的去离子水，于100 'C提取20-25分钟，过滤， 滤渣加10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提取一次，过滤。合并二 次提取液，冷却至室温，用离心机离心后，取离心液备用。
将上述离心液缓缓加到已处理平衡好的HZ801大孔吸附树脂柱中，柱径 高比为1 : 12，上样流速为每分钟10ml。上样结束后，用常温的去离子水以 每分钟20ml的流速洗脱。收集富含红花黄色素的洗脱液，洗脱液于80 90 。C减压浓縮，得红花黄色素粗品浓縮液。
红花黄色素粗品浓縮液上凝胶LH-20柱，柱的径高比为1:5，上样量为 柱床体积的10%，注射用水洗脱，流速为每分钟5ml，收集含红花黄色素部 分。收集液经80 卯'C减压浓缩后，得红花黄色素精品浓縮液，经冷冻干燥，
得注射用红花黄色素(或者称为红花黄色素冻干粉针)。
作为优�。痉⒚魉龅淖⑸溆煤旎ɑ粕兀渲凶芑仆坎坏陀�75 %，羟基红花黄色素A含量为60X 80。/。。
作为优�。痉⒚魉龅淖⑸溆煤旎ɑ粕兀旎ɑ粕囟掣煞壅耄� 制剂规格为50mg/瓶，其中总黄酮含量不得少于38.25mg，红花黄色素含量应 为31.5 38.5mg。
本发明发现，通过对红花黄色素产品中红花黄色素鉴别、总黄酮含量检 测以及羟基红花黄色素A含量检测的步骤，可以有效地评价红花的有效部位 红花黄色素，可以控制红花黄色素或者红花黄色素药用制剂的中间体质量， 进而能够有效地控制红花黄色素药品制剂质量，确保制剂安全、有效和可控。 特别是通过采用特定的混合溶剂配比，运用薄层色谱法这一简便、快捷的方 法，能够非常有效地鉴别出红花黄色素产品中红花黄色素，专属性和准确性 高，取得令人惊喜的发明效果。本发明方法，不仅可以有效地评估红花黄色 素及其药物制剂的质量和品质，是质控有效措施，而且方法简便、快捷、有 效，准确性和专属性高的优点。
具体实施例方式
以下实施例是为了进一步解释和说明本发明内容，不应被理解为对本发 明主旨进行限定或限制。
实施例l:红花黄色素供试品检测
供试品注射用红花黄色素(规格50mg、生产厂家浙江永宁药业股 份有限公司、批号080303) 步骤一红花黄色素检测
采用聚酰胺薄层板，对照品为羟基红花黄色素A，展开剂为水-乙醇-甲酸-
乙酰丙酮(5:1.5:1:0.5)。取供试品适量，加水制成每lml中含2mg的溶液， 作为供试液。另取对照品加水制成每lml中含2mg的溶液作为对照液。取聚 酰胺薄层板，规格10X20cm，吸取上述两种溶液各2)il，分别点于同一薄层 板上，以展开剂展开后取出、晾干。结果供试品中在与对照品相同位置显示 一个斑点。展开系统较好，羟基红花黄色素A的Rf约为0.7，分离度较好。 步骤二总黄酮含量测定对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷真空干燥24小时后的羟基红
花黄色素A对照品适量，加水制成每lml含45)ig的溶液作为对照品溶液。
标准曲线的制备精密量取上述对照品溶液0、 1.0、 2.0、 4.0、 6.0、 8.0ml 分别置于10ml容量瓶中，加水至刻度摇匀，同时以水作空白。采用日本岛津 UV-260紫外风光光度计进行测定，在360nm的波长处测定吸收度，以吸收度 为纵坐标，浓度为横坐标，制得标准曲线。
测定取本品25mg，精密称定，置于100ml量瓶中，加水溶解并稀释至 刻度。精密量取2ml，置于25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，采用日本 岛津UV-260紫外风光光度计进行测定，在360nm的波长处测定吸收度，从 标准曲线上读出供试品溶液中总黄酮量。
结果测得供试品中总黄酮含量为43.66mg。
步骤三羟基红花黄色素A含量测定
对照品溶液制备精密量取经五氧化二磷真空干燥24小时后的羟基红花 黄色素A对照品适量，加水制成每lml含0.20mg的溶液，摇匀即得。
供试品溶液制备取本品25mg，精密称定，置于100ml量瓶中，加水溶 解并稀释至刻度，摇匀即得。
色谱条件采用高效液相色谱法，用十八垸基硅烷键合硅胶为固定相，用 甲醇:乙腈:水:磷酸的体积比为32:3:64.5:0.5的混合溶剂为流动相，检测波长为 360nm，理论塔板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000。
测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2(^1,注入液相色谱仪， 测定峰面积，计算即得。
结果测得本品按干品计算含羟基红花黄色素A为36.7mg。
实施例2:薄层色谱检测红花黄色素 供试品自制注射用红花黄色素 对照品羟基红花黄色素A
薄层版聚酰胺薄层板 展开剂
1、 甲醇-水(8:2)
2、 水-乙醇-乙酰丙酮(4:2:1.5)
3、 乙醇-水(3:2)
4、 乙醇-水-丁酮-乙酰丙酮(3:13:3:1)
5、 苯-甲醇-丁酮(6:2:2)
6、 水-乙醇-甲酸-乙酰丙酮(5:1.5:1:0.5)
取供试品适量，加水制成每lml中含2mg的溶液，作为供试液。另取对 照品加水制成每lml中含2mg的溶液作为对照液。取聚酰胺薄层板，规格10 X20cm，吸取上述两种溶液各2^1，分别点于同一薄层板上，以展开剂展开 后取出、晾干。结果如下表l。
表l:红花黄色素薄层结果
展开剂序号结果
1前沿与原点两个斑点
2带状无点
3原点未展开
4原点
5原点未展开
61个点，Rf约0.7
结果表明，展开剂6可以有效地检测样品中红花黄色素，展开系统较好， 羟基红花黄色素A的Rf约为0.7，分离度较好。
己经根据优选实施例对本发明作了描述。应当理解的是前面的描述和实 施例仅仅为了举例说明本发明而已。在不偏离本发明的精神和范围的前提下， 本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理 解为在本发明的保护范围之内。
权利要求
1、一种检测红花黄色素的方法，其中所述的红花黄色素系从红花中提取、分离、纯化得到的总黄酮，其包括如下步骤(1)红花黄色素的检测，用薄层色谱法或者紫外分光光度法检测红花黄色素供试品中的红花黄色素；(2)测定总黄酮的含量，用紫外分光光度法，以羟基红花黄色素A为对照品，测定波长为360nm，测定红花黄色素供试品中的总黄酮含量；(3)测定羟基红花黄色素A的含量，用高效液相色谱法，以羟基红花黄色素A为对照品，用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，用甲醇、乙腈、水和磷酸的混合溶剂为流动相，测定波长为360nm，理论塔板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000，测定红花黄色素供试品中羟基红花黄色素A的含量。
2、 根据权利要求l所述的方法，其中步骤(1)采用薄层色谱法检测红花黄色素供 试品中的红花黄色素。
3、 根据权利要求2所述的方法，其中步骤(1)所述的薄层色谱是以聚酰胺为吸附 齐U，水、乙醇、甲酸和乙酰丙酮的混合溶剂为展开剂，羟基红花黄色素A为对 照品。
4、 根据权利要求3所述的方法，其中所述的展开剂为水:乙醇:甲酸:乙酰丙酮的体 积比为5:1.5:1:0.5的混合溶剂。
5、 根据权利要求l所述的方法，其中步骤(1)采用紫外分光光度法检测红花黄色 素供试品中的红花黄色素，在221 227nm波长处有最大吸收峰。
6、 根据权利要求1一5所述的检测方法，其中步骤(3)中所述的流动相为甲醇:乙 腈:水:磷酸的体积比为32:3:64.5:0.5的混合溶剂。
7、 一种检测注射用红花黄色素的方法，其中所述的红花黄色素系从红花中提取、 分离、纯化得到的总黄酮，其包括如下步骤(1)红花黄色素的检测，用薄层色谱法或者紫外分光光度法检测出注射用红花黄 色素中的红花黄色素； (2) 总黄酮的含量测定，用紫外分光光度法，以羟基红花黄色素A为对照品， 检测波长为360nm，测定出注射用红花黄色素中的总黄酮含量；(3) 羟基红花黄色素A的含量测定，用高效液相色谱法，以羟基红花黄色素A 为对照品，用十八垸基硅垸键合硅胶为固定相，用甲醇:乙腈:水:磷酸的体积 比为32:3:64.5:0.5的混合溶剂为流动相，检测波长为360nm，理论塔板数按 羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000，测定出注射用红花黄色素中的羟 基红花黄色素A含量。
8、 根据权利要求7所述的方法，其中步骤(1)采用薄层色谱法检测注射用红花黄 色素中的红花黄色素，薄层色谱是以聚酰胺为吸附剂，水:乙醇:甲酸:乙酰丙酮 的体积比为5:1.5:1:0.5的混合溶剂为展开剂，羟基红花黄色素A为对照品。
9、 根据权利要求7所述的方法，其中步骤(1)采用紫外分光光度法检测注射用红 花黄色素中的红花黄色素，在221 227nm波长处有最大吸收峰。
10、 据权利要求7-9所述的方法，其中步骤(2)中总黄酮含量不得少于 38.25mg，步骤(3)中羟基红花黄色素A含量应为31.5 38.5mg。
全文摘要
本发明涉及一种测定红花黄色素含量的方法，具体地说，通过对红花黄色素产品中红花黄色素鉴别、总黄酮含量检测以及羟基红花黄色素A含量检测的步骤，可以有效地评价红花的有效部位红花黄色素，可以控制红花黄色素或者红花黄色素药用制剂的中间体质量，进而能够有效地控制红花黄色素药品制剂质量，确保制剂安全、有效和可控。本发明方法还具有方法简便、快捷、有效，准确性和专属性高的优点。
文档编号G01N30/02GK101339174SQ20081013529
公开日2009年1月7日 申请日期2008年8月11日 优先权日2008年8月11日
发明者敏 卢, 叶凤起, 张建宇, 彭黎明, 林德君, 陆仙芸, 黄海燕 申请人:浙江永宁药业股份有限公司
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