专利名称：一种测定维生素b12含量的色谱方法
技术领域：
本发明涉及保健食和药品测试领域，尤其涉及測定保健食品和药品中微量维生素B12含量的色谱方法。
背景技术：
维生素B12，是人体必需的微量营养成分之一，若摄取不足，则可能引起恶性贫血，骨髓变性，舌炎，神经系症状，四肢僵硬，易受刺激，困倦，精神不振等。为补充人体所需要的维生素B12，目前许多保健食品添加维生素B12，但维生素B12在食品和一些基质成分复杂的保健品中含量很低，这对维生素B12的測定造成很大困难。目前维生素B12的測定方法已有微生物分析法、分光光度法和色谱法。微生物法不能准确区分维生素B12及其类似物，測定结果不精确，且费时费力，操作复杂，对人员技术要求高；分光光度法不适合复杂基质的样品，因为有很多组分光谱峰重叠，不是简单的几次求导就能区分开来的；目前建立的色谱法主要是应用高效液相色谱法(HPLC)，采用甲醇-水体系为流动相，对维生素B12进行检测，检测出现维生素B12组分无法出峰或出峰不明显无法达到測定要求的现象。较微生物法和分光光度法相比，已有的HPLC方法在一般检测过程中提高了灵敏度和准确度，但对于一些组分复杂且维生素B12含量低的保健品，t匕如只有几个ppm，进行测定时，需要对维生素B12进行提前富集，若直接进行采样测定则导致无法找到对应峰或出峰很�。馗葱圆桓撸佣锊坏郊觳庖�。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定保健食品中维生素B12的色谱方法，通过选择新型流动相和与之配套的其他检测条件，实现直接对复杂基质保健食品和药品中微量维生素B12含量的准确测定和计算。本发明是这样实现的:一种测定保健食品中维生素B12的色谱方法，其特征在于包括以下步骤:(1)流动相制备:称取一定量的磷酸ニ氢钾，置于容量瓶中，加去离子水溶解后，加85%磷酸配制浓度为0.04 M、pH为3.5±1.5的磷酸钾盐缓冲溶液，将上述缓冲溶液与甲醇按照缓冲溶液:甲醇=69:31的体积比的混合均匀，制成流动相；(2)对照品溶液制备:采用USP标准品作为维生素B12对照品，精密称定一定量的维生素B12对照品，用流动相溶解，配制成浓度为0.01 mg/mL的储备液，毎次试验前用流动相稀释储备液，配制成浓度为I U g/ml的标准工作溶液；(3)供试样品溶液制备:取适量待测样品，研成细粉，精密称定约含有25 Ug维生素B12的样品粉末，置于50mL棕色容量瓶中，精密加入25 mL流动相溶解，用カ震�。崛�2分钟，用0.45 um滤膜过滤；(4)色谱条件设定:
a.色谱柱:采用反相 C18 色谱柱,5 V- m , 250 mm X 4.6 mm ；b.流速:0.5-1.5 mL/min ；c.检测器及检测波长:ニ极管阵列检测器，波长为546 nm ；d.进样量:70-150 uL；e.柱温:25-35 ° C ; (5)进样检測:通过供试样品与对照品的保留时间和溶液峰面积关系，按如下方程计算供试样品中维生素B12的含量:《 #= C对XA样X 25/ A对Xm样，其中co#为供试样品中维生素B12的含量，单位为U g/g 为对照品标准浓度 メ w为对照品标准溶液峰面积W#为供试样品溶液峰面积为供试样品的重量，单位为g。本发明所述的流动相也可应用磷酸钠盐和其他基质配制缓冲溶液。本发明通过选择新型流动相和与之配套的其他检测条件，实现直接对复杂基质保健食品中微量维生素B12含量的准确测定和计算，检测结果色谱峰形好，抗干扰能力強，满足实际測定要求。
图1原有HPLC方法对照品色谱图。图2原有HPLC方法供试样品色谱图。图3本发明对照品色谱图。图4本发明供试样品色谱图。
具体实施例方式參照附图，一种测定保健食品中维生素B12的色谱方法，其特征在于包括以下步骤:(I)流动相制备:称取一 定量的磷酸ニ氢钾，置于容量瓶中，加去离子水溶解后，加85%磷酸配制浓度为0.04 M、pH为3.5±1.5的磷酸钾盐缓冲溶液，将上述缓冲溶液与甲醇按照缓冲溶液:甲醇=69:31的体积比的混合均匀，制成流动相；(2)对照品溶液制备:采用USP标准品作为维生素B12对照品，精密称定一定量的维生素B12对照品，用流动相溶解，配制成浓度为0.01 mg/mL的储备液，每次试验前用流动相稀释储备液，配制成浓度为I U g/ml的标准工作溶液；(3)供试样品溶液制备:取适量待测样品，研成细粉，精密称定约含有25 Ug维生素B12的样品粉末，置于50mL棕色容量瓶中，精密加入25 mL流动相溶解，用力震�。崛�2分钟，用0.45 Pm滤膜过滤；(4)色谱条件设定:a.色谱柱:采用反相C18色谱柱，5 V- m , 250 mm X 4.6 mm ；b.流速:0.5-1.5 mL/min ；c.检测器及检测波长:ニ极管阵列检测器，波长为546 nm ；d.进样量:70-150 u L ；e.柱温:25-35。C ; (5)进样检测:通过供试样品与对照品的保留时间和溶液峰面积关系，按如下方程计算供试样品中维生素B12的含量:《样=C对XA样X25/ A对Xm样，其中《样为供试样品中维生素B12的含量，单位为y g/g 为对照品标准浓度#为对照品标准溶液峰面积#为供试样品溶液峰面积; #为供试样品的重量，单位为g。所述的流动相也可应用磷酸钠盐和其他基质配制缓冲溶液。具体实施时，原有HPLC方法对照品在保留时间t=10.2min附近的峰为维生素B12測定峰，供试样品在保留时间t=10.2min附近没有维生素B12測定峰；本发明对照品和供试样品在保留时间t=6.5 min附近都出现明显的维生素B12測定峰，可以顺利而有效地实现測定。本发明除采用C18柱外，也可以采用类似的反相柱。下面结合具体实施例对本发明作进ー步的说明:
实施例:样品中维生素B12含量的測定:
(I)流动相准备:称取5.44 g KH2PO4,置于I L容量瓶中，加去离子水溶解后，用85%磷酸配制浓度为0.04 M、pH为3.5±1.5的磷酸钾盐缓冲溶液，量取310 mL甲醇和690 mL上述缓冲溶液混匀，用0.45 um微孔滤膜过滤、脱气。(2)对照品溶液准备:采用USP标准品作为维生素B12对照品。精密称定一定量的维生素B12对照品，用流动相溶解，配制成浓度为0.01 mg/mL的储备液；每次试验前用流动相稀释储备液，配制成浓度为I U g/ml的标准工作溶液。(3)供试样品处理:取不少于20片的样品，研成细粉，精密称定约含有25 y g维生素B12的样品粉末，置于50mL棕色容量瓶中，精密加入25 mL流动相溶解，用カ震�。崛�2分钟，用0.45 um滤膜过滤。(4)进样检测:
对照品和供试样品色谱图如图3和图4所不，对照品和供试样品保留时间在t=6.5 min附近的峰为维生素B12測定峰。通过供试样品与对照品的保留时间和溶液峰面积关系，按如下方程计算供试样品中维生素BI2的含量:《样=C对XA样X25/ A对Xm样，其中《样为供试样品中维生素B12的含量，单位为y g/g 为对照品标准浓度 メ#为对照品标准溶液峰面积 メ;if为供试样品溶液峰面积为供试样品的重量，单位为g。(5)对照品和供试样品色谱图如图3和图4所不，对照品和供试样品保留时间在t=6.5 min附近的峰为维生素B12测定峰。多次实验证明该方法的线性范围为:0.053 u g-0.16 ii g，方法检出限为:
0.0il u g，加标回收率为:82%-96%。事实证明本发明可以准确测出相关样品维生素B12达到測定要求的測定峰，满足检测的需要，并且色谱图峰形好，而未用此方法处理的样品无法找到測定峰或出峰很�。薹觳獬鑫谺12的含量。本发明不仅限于保健品、药品、膳食补充剂，也可以用于生物及其制品中微量维生素B12的測定，测定证实本发明灵敏度高、选择性好、抗干扰 能力強。
权利要求
1.一种测定保健食品中维生素B12的色谱方法，其特征在于包括以下步骤: (1)流动相制备:称取一定量的磷酸ニ氢钾，置于容量瓶中，加去离子水溶解后，加85%磷酸配制浓度为0.04 M、pH为3.5±1.5的磷酸钾盐缓冲溶液，将上述缓冲溶液与甲醇按照缓冲溶液:甲醇=69:31的体积比的混合均匀，制成流动相； (2)对照品溶液制备:采用USP标准品作为维生素B12对照品，精密称定一定量的维生素B12对照品，用流动相溶解，配制成浓度为0.01 mg/mL的储备液，毎次试验前用流动相稀释储备液，配制成浓度为I U g/ml的标准工作溶液； (3)供试样品溶液制备:取适量待测样品，研成细粉，精密称定约含有25u g维生素B12的样品粉末，置于50mL棕色容量瓶中，精密加入25 mL流动相溶解，用カ震�。崛�2分钟,用0.45 u m滤膜过滤； (4)色谱条件设定: a.色谱柱:采用反相C18色谱柱，5μ m , 250 mm X 4.6 mm ；b.流速:0.5-1.5 ml ,/mi n ； c.检测器及检测波长:ニ极管阵列检测器，波长为546nm； d.进样量:70-150u L ； e.柱温:25-35° C ； (5)进样检測: 通过供试样品与对照品的保留时间和溶液峰面积关系，按如下方程计算样品中维生素B12的含量:《样=C对XA样X25/ A对Xm样，其中《样为待测样品中维生素B12的含量，单位为y g/g 为对照品标准浓度 A对为对照品标准溶液峰面积 A样为样品溶液峰面积M样样为样品的重量，单位为g。
2.根据权利要求1所述的ー种测定维生素B12含量的色谱方法，其特征在于:所述的流动相也可应用磷酸钠盐和其他基质配制缓冲溶液。
全文摘要
一种测定保健食品中维生素B12的色谱方法，包括以下步骤(1)流动相制备；(2)对照品溶液制备；(3)供试样品溶液制备；(4)色谱条件设定；(5)进样检测。本发明通过选择新型流动相和与之配套的其他检测条件，实现直接对复杂基质保健食品中微量维生素B12含量的准确测定和计算，检测结果色谱峰形好，抗干扰能力强，满足实际测定要求。
文档编号G01N30/89GK103091442SQ201210450129
公开日2013年5月8日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者盛洁, 钟瑛瑛 申请人:江苏艾兰得营养品有限公司
专业数控铣床产品供应商
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