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专利名称：用于高灵敏度荧光分析的检测系统和方法
技术领域：
本发明涉及在荧光分析中用于测量荧光信号的检测系统。该系统包括探针，其具有结合有荧光标记的传感表面，以及安装在衬底传感表面的近侧的光源和检测器。本发明还涉及用于在液体样品中检测被分析物的方法，其使用具有小表面的探针和具有多个结合分子及多个荧光标记的聚合物。本发明还涉及一种荧光标记组合物，其包括具有多个结合分子和多个荧光标记的交联多糖主链分子。
背景技术：
在免疫分析系统的研制中，需要满足许多性能要求。分析需要足够灵敏，以在亚皮克毫微克范围的极低水平下检测被分析物。总的分析时间需要为15分钟或更少，以在护理情形下提供及时的结果用于病人管理，或满足批量分析者的处理量需要。在一些情况下，同时用相同的样品进行多重分析的被分析物面板是有利的，以最小化结果的周转时间和测试成本。许多免疫分析使用荧光标记，因为这类标记有许多实用性的优点。和酶相比，荧光标记稳定得多，并且不需要其它底物试剂。对于多重分析面板，由于每个结合区域可以依次经受荧光激发和放射测量，不受相邻的结合区域干扰，荧光标记可以在同一反应室中使用离散的结合区域。然而，采用荧光标记的分析灵敏度低于基于酶的分析，这主要是由于酶能够催化转化底物，以随着时间的推移积聚大量的产物分子。芳基磺酸酯花青荧光染料被描述于Mujumdar等(1993) Biocon jugate Chemistry,4 :105-111 ；Southwick ^ (1990)Cytometry, 11 :418-430 ；和美国专利号5，沈8，486。每一篇参考文献都描述了 Cy5，并且其可以从宾夕法尼亚州匹兹堡的 Biological Detection Systems公司买到，商品名为Fluorolink Cy5 。该芳基磺酸酯花青荧光染料具有高消光系数(通常为130，000升/摩尔至250，000升/摩尔)，优良的量子产率，在大多数生物材料和塑料的自体荧光波长范围以外(500纳米至750纳米)的荧光发射谱，优良的溶解性，以及低非特异性结合特性。尽管有这些优异性能，芳基磺酸酯花青荧光染料也存在某些限制。特别是，这些染料的斯托克斯频移相对较窄，其导致该染料的激发和发射谱之间的明显重叠。当这些染料分子在受激发时彼此位置接近时，该激发和发射谱的重叠可以引起荧光的自熄灭。这种自熄灭限制了可以结合至单个抗体分子用于免疫分析的芳基磺酸酯染料分子的数目。在示范性的芳基磺酸酯花青荧光染料Cy5的情况下，斯托克斯频移是17纳米(其为650纳米的激发波长和667纳米的发射波长之差)。当两至四个Cy5分子被结合至单个抗体分子时，获得最佳的荧光产率。当超过四个染料分子被结合至单一抗体分子时，该荧光信号输出迅速下降。这种不能结合超过四个染料分子至单一的抗体分子的特性明显限制了使用Cy5-标记的抗体及其它结合物质的免疫分析的灵敏度。需要有改善的光学探测系统和改善的方法，用于通过荧光免疫分析以高灵敏度检测被分析物。该系统和方法应易于由用户操作，并提供高特异性的信号和最小的背景噪声。

发明内容
概述本发明涉及一种荧光检测系统，其用于测量探针梢端上的荧光信号。该系统包括 (a)长度比宽度的纵横比至少为5比1的探针，该探针具有远端和近端，该近端具有和荧光标记结合的传感表面；(b)用于直接发射激发光至该探针的传感表面的光源；(c)指向该传感表面的会聚透镜；和(d)用于检测该发射荧光的光学探测器；其中该会聚透镜会聚该发射荧光并将其引导至该光学探测器。本发明还涉及用于通过荧光免疫分析检测被分析物的方法。在一个实施方式中 (三步结合)，该方法包括步骤(a)获得一探针，其具有被固定在该探针梢端上的第一抗体，其中该梢端表面的直径< 5毫米；(b)将该探针梢端浸入包含具有被分析物的样品溶液的样品容器中，在该样品容器中上下移动该探针梢端并水平流动该样品溶液；(c)将该探针梢端浸入包含试剂溶液的试剂容器，该试剂溶液包括和一结合配对的第一成员结合的第二抗体分子，在该试剂容器中上下移动该探针梢端并水平流动该试剂溶液；(d)将该探针梢端浸入含洗液的洗涤容器中；(e)将该探针梢端浸入含有扩增溶液的扩增容器中，该扩增溶液包括分子量至少为约一百万道尔顿，并且和该结合配对的第二成员的至少5个分子和至少25个荧光标记结合的聚合物，在该扩增容器中上下移动该探针梢端并水平流动该扩增溶液，以在该探针梢端上形成该被分析物，该第一抗体，该第二抗体，以及该结合配对的第一和第二成员间的免疫复合体；(f)将该探针梢端浸入含第二洗液的第二洗涤容器； 和(g)通过检测该探针梢端上的荧光信号检测所形成的免疫复合体；其中该第一抗体和该第二抗体是针对该被分析物的抗体。本发明的方法实现了高灵敏度，这是由于独特地组合了(i)采用具有小传感表面面积的用于结合被分析物分子的探针，(ii)在反应容器中上下移动该探针梢端并水平流动该反应溶液，和(iii)采用和多重结合分子和多重荧光标记结合的高分子量聚合物。本发明还涉及荧光标记组合物，其包括(a)分子量至少一百万道尔顿的交联 Ficoll, (b)至少5个结合分子，和(c)至少25个荧光染料分子，其中这些结合分子和荧光染料分子附着于该交联Ficoll。


图1显示了该光学探测系统的第一实施方式。图2显示了该光学探测系统的第二实施方式。图3显示了该光学探测系统的第三实施方式。图4显示了该光学探测系统的第四实施方式。图5显示了该光学探测系统的第五实施方式。图6显示了该光学探测系统的第六实施方式。图7显示了用于检测被分析物的两步结合方法。图8显示了一光学检测系统，其中光源和检测器两者均被安装在该探针的传感表面的相对侧。图9显示了该光学检测系统的另一视图，其中该探针被浸入被分析物溶液。
图10显示了制备交联Ficoll 400的流程图。图11显示了制备Cy5_抗体-交联Ficoll 400的流程图。图12显示了通过kpharose 4B CL色层分离法进行的SPDP标记的交联Ficoll 400的洗脱图形。图13显示了用于检测A蛋白的免疫分析形式。Ab:抗体，Ag:抗原(A蛋白)，Sa: 链霉亲和素，B 生物素，F 荧光标记。详细说明定义除非在下文定义，权利要求和说明书中使用的术语将根据本领域技术人员所理解的通�：褰薪馐�。此处使用的“约”指在所列举值的士 15%以内。此处使用的“被分析物结合”分子指能参与和被分析物分子的特异性结合反应的任何分子。其实例包括，但不限于，(i)抗原分子，其用于检测特异性针对该抗原的抗体的存在；(ii)抗体分子，其用于检测抗原的存在；(iii)蛋白质分子，其用于检测该蛋白质的结合配偶体的存在；(iv)配位体，其用于检测结合配偶体的存在；或(ν)单链核酸分子，其用于检测核酸结合分子的存在。形状的的“纵横比”指其较长尺寸与其较短尺寸的比率。“结合分子”指能够结合另一个感兴趣的分子的分子。此处使用的“结合配对”指彼此吸引并特异性结合的两个分子。结合配对的例子包括，但不限于，抗原和针对该抗原的抗体，配位体及其受体，核酸的互补链，生物素和抗生物素蛋白，生物素和链霉亲和素，凝集素和糖类。优选的结合配对是生物素和链霉亲和素， 生物素和抗生物素蛋白，荧光素和抗荧光素，洋地黄毒苷/抗洋地黄毒苷(digioxigenin/ anti-digioxigenin)。生物素和抗生物素蛋白包括生物素衍生物和抗生物素蛋白衍生物， 如链霉亲和素，其可在使用复合物结合序列的分析规程被用作中间结合物质。例如，抗体可以用生物素标记(“生物素酰化”)，并被用于和预先固定在固相表面上的目标物质结合。根据本发明的利用抗生物素蛋白或链霉亲和素的荧光组合物即可被用于引入该荧光标记。此处使用的“被固定”指试剂被固定在固体表面上。当试剂被固定至固体表面时， 其可以被非共价或共价地结合至该表面。此处使用的“整体式衬底”指具有一个折射指数的单块固体材料，如玻璃，石英，或塑料。此处使用的“数值孔径”指表征角度范围的无量纲数，该系统可以在该范围上接收或发出光。此处使用的“光学纤维”是可沿着其长度传送光的玻璃或塑料纤维。光学纤维通常为圆形横截面的绝缘波导管，其由绝缘材料(芯材)及围绕该绝缘材料的另一种具有更低折射指数的绝缘材料(包层)组成。此处使用的“探针”指在传感侧包覆有被分析物结合分子的薄膜层的衬底。探针具有远端和近端。该近端(在此申请中也称为探针梢端)具有用被分析物结合分子的薄层包覆的传感表面。荧光检测系统
本发明涉及一种荧光检测系统，其用于测量探针梢端上的荧光信号。发明人已经发现，通过将光源和检测器两者都安装在该探针的传感表面的近侧，进入检测光学器件的不希望的反射被降低，探测效率被提高。该系统包括(a)长度比宽度的纵横比至少为5比1的探针，该探针具有第一端和第二端，该第二端具有和荧光标记结合的传感表面；(b)用于直接发射激发光至该探针的传感表面的光源；(c)指向该传感表面的会聚透镜；和(d)用于检测该发射荧光的光学探测器；其中该会聚透镜会聚该发射荧光并将其引导至该光学探测器。该探针可以为整体式衬底或光学纤维。该探针可以为任何形状，如杆形，圆柱形， 圆形，正方形，三角形等，其长度比宽度的纵横比至少为5比1，优选为10比1。因为在免疫分析期间该探针被浸在样品溶液和一种或多种分析溶液中，需要有纵横比至少为5比1的长探针，使该探针的梢端能够浸入该溶液。在该长探针被转移至不同的反应室时也可以进行多相分析。避免了该分析期间分配和吸取试剂和样品。该探针的传感表面被包覆以被分析物结合分子，并与荧光标记结合。任何可以发射适当的该荧光标记的激发光的光源均适用于本发明。优选的光源是可以发出适于荧光标记的波长的光的激光器。例如，该激光器中心波长对于Cy5荧光染料优选为649纳米。适宜的用于检测发射光的光学探测器是光电倍增管(PMT)，电荷耦合装置 (CCD)，或光电二极管。包括会聚透镜的该光源和该光学探测器被安装在该探针梢端表面(传感表面)的同一侧。如果该传感表面朝下，它们都被安装在该梢端表面以下。如果该传感表面朝上，它们都被安装在该梢端表面以上。它们离该传感表面比该探针的另一端更近。该传感表面始终在该会聚透镜的数值孔径之内。该探针可以是，但不一定是以这些会聚透镜中央对准。图1显示了第一实施方式。光学透明的杆(探针)由玻璃或石英制成。该杆的下端被用作传感表面。荧光标记被结合至该传感表面。为检测该荧光，该杆的传感端被浸入具有透明底部的容器中，其含有为了荧光发射已优化的缓冲溶液。该透明底部的材料可以选自塑料，玻璃或石英。光学探测器和激发激光器被安装在该容器的同一侧，并且这些会聚透镜在该传感表面下。该激光器经过对准，以使该激光束以入射角α投射在该杆远端的表面上，α大于该杆的数值孔径的角度θ。因为该杆的折射指数比空气大得多，更接近该缓冲溶液，大部分入射激光将透过该杆。较少量的激光在该传感表面被反射。一些激光被结合入该杆，然后从该杆的另一端反射回来。当α > θ时，该反射光离开该杆的传感表面以形成环形的光带。此环的中间光强低得多。由于这些会聚透镜被置于该环中央，进入该检测光学器件的不希望的反射被降低。为进一步减少此种反射，该杆的上端可以为锥形并砂磨至一定粗糙度。为了检测在该传感表面上的该发射光，可以用光电倍增管或CCD。该杆的传感表面和这些会聚透镜之间的距离是可调节的，以实现最佳探测效率。图2显示了第二实施方式，其中该杆在容器中包含的空气中测量，而非在缓冲溶液中测量。该激光器和该检测器的结构类似于第一实施方式，其中光学探测系统和激发激光器被安装在该杆的同一侧，并且这些会聚透镜在该传感表面下。该激光器经过对准，以使该激光束以入射角α投射在该杆的传感表面上，α被设定为大于该杆的数值孔径的角度 θ。一些入射的激光将透过该杆。大部分激光在该传感表面被反射。剩余的激光被结合入该杆，然后从该杆的上端被反射回来。当α > θ时，该反射光离开该杆的传感表面以形成环形的光带。该环中间的光强低得多。由于这些会聚透镜被置于该环中央，避免了进入该检测光学器件的不希望的反射。为进一步减少此种反射，该杆的上端可以为锥形并砂磨至一定粗糙度。为了检测在该传感表面上的该发射光，可以用光电倍增管或CCD。该杆的传感表面和这些会聚透镜之间的距离是可调节的，以实现最佳探测效率。图3显示了第三实施方式，用非透明的杆替换图1的实施方式中的透明杆。该非透明杆的材料可能是塑料，陶瓷，和金属。该杆的下端被用作传感表面。为了检测该荧光， 该杆的传感表面被浸入具有透明底部的容器中，该容器包含为了荧光性能已经优化的缓冲溶液。该透明底部的材料可以选自塑料，玻璃或石英。光学探测系统和激发激光器被安装在该杆和该容器的同一侧，并且这些会聚透镜在该传感表面下。该激光器经过对准，以使该激光束以入射角α投射在该杆的传感表面上。因为该杆是非透明的，该激光束在该传感表面被反射和吸收。优选该杆的材料对于该激发激光发射最小限度的荧光。为了检测在该传感表面上的该发射光，可以使用光电倍增管或CCD。在该杆的传感表面和这些会聚透镜之间的距离是可调节的，以实现最佳探测效率。图4显示了第四实施方式，其具有非透明的杆，其在容器中所含空气中而非缓冲溶液中进行测量。该非透明杆的材料可能是塑料，陶瓷，和金属。该杆的下端被用作传感表面。光学探测系统和激发激光器被安装在该容器的同一侧，并且这些会聚透镜在该传感表面下。该激光器经过对准，以使该激光束以入射角α投射在该杆的传感表面上。因为该杆是非透明的，该激光束在该传感表面被反射和吸收。优选该杆的材料对于该激发激光发射最小限度的荧光。为了检测在该传感表面上的该发射光，可以使用光电倍增管或CCD。在该杆的传感表面和这些会聚透镜之间的距离是可调节的，以实现最佳探测效率。图5显示了第五实施方式，其具有涂覆在该杆的传感表面上的镜状薄膜。该杆可以是透明的或非透明的。该镜状薄膜涂层被用于反射光，既可以是激发光也可以是发射光。 该镜涂层可以采用铝，金或银。SiO2的第二薄膜被任选地涂覆在该第一薄膜上。该非透明杆的材料可以是塑料，陶瓷，或金属。该透明杆的材料选自玻璃，石英，或塑料。荧光标记被结合至该传感表面。为了检测荧光，该杆的传感端被浸入具有透明底部的容器中，该容器包含为了荧光性能已经优化的缓冲溶液。该透明底部的材料可以选自塑料，玻璃或石英。光学探测系统和激发激光器被安装在该容器的同一侧，并且这些会聚透镜在该传感表面下。该激光器经过对准，以使该激光束以入射角α投射在该杆的传感表面上。因为该杆的传感表面被第一镜状薄膜覆盖，该激光束以反射角α被反射。为了检测在该传感表面上的该发射光，可以使用光电倍增管或CCD。在该杆的传感表面和这些会聚透镜之间的距离是可调节的，以实现最佳探测效率。图6显示了第六实施方式，其在该杆的传感表面上使用镜状薄膜涂层，但是测量在空气中完成。该杆可以是透明的或非透明的。该镜状薄膜涂层被用于反射光，既可以是激发光也可以是发射光。该镜涂层可以使用铝，金或银。另一 Sio2W薄层被任选地涂覆在该第一镜状薄膜上。该非透明杆的材料可以是塑料，陶瓷，和金属。该透明杆的材料选自玻璃，石英，或塑料。荧光标记被结合至该传感表面。为了检测该荧光，该杆的传感端，光学探测系统和激发激光器被安装在该杆的传感表面的同一侧，并且这些会聚透镜在该传感表面下。该激光器经过对准，以使该激光束以入射角α投射在该杆的传感表面上。因为该杆的传感表面被镜状薄膜覆盖，该激光束被反射。为了检测在该传感表面上的该发射光，可以用光电倍增管或CCD。该杆的传感表面和这些会聚透镜之间的距离是可调节的，以实现最佳探测效率。尽管图2，4，和6示范了把激光器和光学探测器安装在探针梢端以下的方式，应当理解该探针可以被上下倒转，且该激光器和该光学探测器可以被安装在该传感表面以上， 以检测该荧光信号。用荧光免疫分析检测被分析物本发明还涉及用于在液体样品中通过荧光免疫分析检测被分析物的方法。发明人已经发现以下步骤的组合使检测的灵敏度水平增加至皮克/毫升(i)使用具有小传感表面面积的用于结合被分析物分子的探针，( )在反应容器中上下移动该探针梢端并水平流动该反应溶液，和(iii)使用结合了至少5个结合分子和至少25个荧光标记的高分子量聚合物。图7示范了该方法的一个实施方式。在此实施方式中(两步结合)，该方法包括步骤(a)获得一探针，其具有被固定在该探针梢端(传感表面)上的第一抗体，其中该梢端表面的直径< 5毫米；(b)将该探针梢端浸入包含具有被分析物的样品溶液的样品容器中；(c)在该样品容器中上下移动该探针梢端并水平流动该样品溶液，以使该被分析物和该第一抗体结合；(d)将该探针梢端浸入包含试剂溶液的试剂容器，该试剂溶液包括分子量至少一百万道尔顿，和至少5个第二抗体分子以及至少25个荧光标记结合的聚合物；(e) 在该试剂容器中上下移动该探针梢端并水平流动该试剂溶液，以在该探针梢端上形成该被分析物，该第一抗体，该第二抗体的免疫复合体；(f)将该探针梢端浸入含洗液的洗涤容器中，并通过检测该探针梢端上的荧光信号检测所形成的免疫复合体；其中该第一抗体和该第二抗体是针对该被分析物的抗体；在上述方法中，可以在结合步骤(c)之后加入任选的洗涤步骤。因为由于结合表面面积小，携带溶液的量极少，可能不需要此额外的洗涤步骤。在另一个实施方式中(两步结合)，该方法包括步骤a)获得一探针，其具有被固定在该探针的梢端上的第一抗体，其中该梢端表面的直径< 5毫米；(b)将该探针梢端浸入一样品容器中，该样品容器含有(i)具有被分析物的液体样品和(ii)包括分子量至少为约一百万道尔顿，并与至少5个第二抗体分子以及至少25个荧光标记结合的聚合物的试剂溶液；(c)在该样品容器中上下移动该探针梢端并水平流动该试剂溶液，以在该探针梢端形成该被分析物，该第一抗体，和该第二抗体的免疫复合体；(d)将该探针梢端浸入含洗液的洗涤容器；和(e)通过检测该探针梢端上的荧光信号检测所形成的免疫复合体；其中该第一和第二抗体是针对该被分析物的抗体。在又一个实施方式中(三步骤结合)，该方法包括步骤(a)获得一探针，其具有被固定在该探针梢端上的第一抗体，其中该梢端表面的直径< 5毫米；(b)将该探针梢端浸入包含具有被分析物的样品溶液的样品容器中，在该样品容器中上下移动该探针梢端并水平流动该样品溶液；(c)将该探针梢端浸入包含试剂溶液的试剂容器，该试剂溶液包括和一结合配对的第一成员结合的第二抗体分子，在该试剂容器中上下移动该探针梢端并水平流动该试剂溶液；(d)将该探针梢端浸入含扩增溶液的扩增容器，该扩增溶液包括分子量至少为约一百万道尔顿，并和至少5个该结合配对的第二成员的分子以及至少25个荧光标记结合的聚合物，在该扩增容器中上下移动该探针梢端并水平流动该扩增溶液，以在该探针梢端上形成该被分析物，该第一抗体，该第二抗体，和该结合配对的第一和第二成员之间的免疫复合体；(e)将该探针梢端浸入含第二洗液的第二洗涤容器中；和(f)通过检测该探针梢端上的荧光信号检测所形成的免疫复合体；其中该第一抗体和该第二抗体是针对该被分析物的抗体；在上述方法中，可以在结合步骤(b)和(C)之后加入任选的洗涤步骤。因为结合表面面积�。芤旱牧考伲梢圆恍枰硕钔獾南吹硬街�。将试剂固定至该固相(该探针梢端的传感表面)的方法在免疫生物化学中是常见的，其涉及该固相和试剂之间共价的，疏水性的或静电键的形成。被分析物结合分子可以被直接固定化在该传感表面上。或者，被分析物结合分子可以通过结合配对被间接固定在该传感表面上。例如，可以先通过对该固体表面的吸附或通过和该固体表面上涂覆的氨基丙基硅烷的共价结合固定抗荧光素，然后用荧光素标记的该被分析物结合分子可以通过荧光素和抗荧光素的结合(结合配对)结合至该固体表面。本发明的方法实现了高灵敏度，这是由于独特地组合了(i)采用小传感表面面积的用于结合被分析物分子的探针，( )在反应容器中上下移动该探针梢端并水平流动该反应溶液，和(iii)采用与多重结合分子和多重荧光标记结合的高分子量聚合物。本发明的第一要素是使用具有小梢端的用于结合被分析物的探针。该梢端具有较小的表面面积，其直径< 5毫米，优选< 2毫米或< 1毫米。该探针梢端的小表面赋予它若干优点。在固相免疫分析中，具有小表面面积是有利的，因为其具有更少的非特异性结合， 并因此产生更低的背景信号。进一步地，由于该梢端的表面面积小，携带在该探针梢端上的试剂或样品也极小。此特征使该探针梢端便于洗涤，由于洗液具有较大的体积，其在该洗液中导致的污染可以忽略。该探针梢端的小表面面积的另一个方面是其结合量小。因此，当该探针梢端被浸入试剂溶液中时，该试剂的结合不会耗损大量该试剂。该试剂的浓度被有效地维持不变。对洗液污染可忽略不计以及试剂消耗少可以使该试剂溶液，该扩增溶液，以及该洗液被重复使用许多次，例如2-8次。然而，在该探针梢端和表面面积的结合反应是缓慢的。当该探针梢端被浸入溶液时，结合表面面积和溶液体积的比率�。虼诵枰さ呐嘤奔洌拱蟹肿永┥⒌礁锰秸氲拇斜砻�。本发明提高灵敏度的第二要素是引起该溶液横向流动(轨道流)经过该探针梢端，其通过将靶分子的配偶体固定化至固相加速其捕获。例如，该反应容器可以被装在轨道振荡器上，并且该轨道振荡器以至少50rpm的速度旋转，优选至少200rpm，更优选至少 500rpm,如500-1，OOOrpm0另外，该探针梢端以0. 01至10毫米/秒的速度垂直于该轨道流的平面上下移动，以在该探针梢端以上和以下引起额外的溶液混合。将低背景的小表面和为了迅速捕获靶分子的流动的组合产生了高特异性的分析信号和低背景噪音，它们是分析灵敏度的决定因素。本发明提高灵敏度的第三要素是使用以多重结合分子和多重荧光染料标记的高分子量聚合物。荧光染料作为免疫分析中的标记具有许多实用性的优点；主要是它们很稳定并且易于和结合蛋白相连。荧光染料的主要限制在于它们不能形成用于灵敏分析的足够的荧光信号。因此，在聚合物上具有多重荧光染料标记以增加荧光信号很重要。许多聚合物(如右旋糖酐和Ficoll和核酸聚合物)均适合作为染料载体。荧光标记可以直接附着于该聚合物，或者可以通过结合分子(如抗体或链霉亲和素)被间接附着于该聚合物。当该结合分子是多肽或蛋白质(如抗体)时，该荧光标记可以采用科学和专利文献中所述的常规的结合化学作用通过各种部分与之共价结合，包括二硫化物，羟苯基，氨基，羧基，吲哚，或其它官能团。另外，抗体可以用已知的技术(见Wilchek和Bayer，(1988) ANAL. BIOCHEM. 171 1-32)进行生物素酰化并且通过抗生物素蛋白/链霉亲和素分子连接该荧光标记。该荧光标记与多核苷酸的共价结合可以用常规的结合化学作用通过各种部分实现，包括醛，酮，异硫氰酸酯，亚氨酸酯，肌苷，酰基和烷基，而许多参考文献也教导了用生物素的衍生。(Leary 等(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 :4045-4049 ；W086/02929 ；EP 063879 ；Langer 等(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 :6633-6637 ；禾口 EP 2009996)。美国专利号5，268, 486 ；5, 650，334描述了将芳基磺酸酯花青荧光染料标记结合至抗体及其它蛋白的示范性的技术，其内容以参考方式被合并于此。由宾夕法尼亚州，匹兹堡的Biological Detection Systems公司出版的技术通报(标识为Cat. No. A25000)描述了将优选的Cy5荧光标记连接至抗体和核酸的技术。本发明的方法可以由此申请中如上所述的荧光检测系统进行检测，其中光源和检测器被安装在探针传感表面的同一侧(近侧)。另外，本发明的方法也可以由光源和检测器均安装在探针的传感表面的相对侧， 并且接近于该探针另一端的光学系统(图8-9)进行检测。在图8中，该探针可从该检测系统移除。激光被直接接入该探针的一端。该探针可以相对于该光学探测系统以χ-γ-ζ方向移动。此种运动可以在该探针和该光学探测系统之间精确对准。该探针梢端可以被浸入标准微量滴定板的孔中。该板被安装在轨道振荡器上。该探针梢端和该样品溶液在该孔中的相对运动可加快分析速度。如图9的放大图所示，探针的梢端被直接浸入被分析物样品，用于结合分析。该联接端从该光学探测系统被卸下。光电倍增管(PMT)被用作光电探测器。该探针可以由整体式衬底或光学纤维构成。如果该探针是光学纤维，则该纤维探针的联接端可以被涂覆以抗反射涂层，以增加联接效率。在一个实施方式中，一偏振过滤器被置于该激光器的前端，并且一垂直偏振的第二偏振过滤器被置于该PMT的前端。采用两个偏振过滤器，不希望的激光反射被最小化。在另一个实施方式中，该偏振过滤器可以被带通过滤器取代，其只允许该荧光波长通过。 该探针的芯直径大于0. 1毫米，但不超过5毫米，优选不超过2毫米，或1毫米。优选的数值孔径在0. 15和0. 50之间。含多个结合分子和荧光标记的高分子量支链多糖。本发明还涉及荧光标记组合物，其包括(a)分子量至少为一百万道尔顿的交联 Ficoll, (b)至少5个结合分子，和(c)至少25个荧光染料分子，其中这些结合分子和荧光染料分子与该交联Ficoll相连。该组合物优选包括5-50或5-100个结合分子和25-100 或25-500个荧光染料分子。在一个实施方式中，该荧光染料分子被直接与该交联Ficoll相连。在另一个实施方式中，该荧光染料分子通过结合分子(如抗体分子或链霉亲和素)被间接与该交联 Ficoll相连。为了最小化荧光熄灭，这些荧光染料分子在沿着该交联Ficoll的被间隔开的位置与其相连此荧光标记组合物是用于本发明上述方法的优选组合物。
Ficoll是商业上可获得的，其分子量为70K和400K道尔顿。Ficoll具有作为高分子载体的优点。将荧光蛋白质进行交联在提高分析灵敏度方面的一个问题是非特异性的背景信号会增加。以相同比例增加的特异性分析信号和背景信号会导致相同的信号和背景比率，而没有灵敏度改善。多糖总体上对于许多通常被应用于免疫分析的固相材料展现的非特异性结合可以被忽略。因此，在最小化对于该固相的非特异性结合时，Ficoll高分子载体增加了特异性结合的信号，由此增加信号和背景的比率，增强灵敏度。相对于其它多糖右旋糖酐，Ficoll是有利的。由于右旋糖酐为直链，几乎没有分支点，其分子量分布极为多分散(polydisperse)。在将蛋白质连接到多糖载体的过程中，起始材料具有限定的，窄的分子量范围时，可获得可重复的结果。Ficoll的支链结构使其对于化学裂解或机械剪切有一定耐受度，并因此最小化对其分子量的影响。Ficoll的支链结构的另一个方面是其可以最小化该聚合物和用于免疫分析的固相材料的相互作用；因此相比于其它多糖，非特异性结合较少。Ficoll 400(分子量)是多分散的(polydisperse)并且大多数该材料实际上分离为比IgG小得多的分子。理想的多糖载体的分子量应大于一百万道尔顿，其在kpharose 4BCL柱的空隙体积或其附近洗出。极少Ficoll 400制品表现为这种实际上有用的高分子
量聚合物。本发明的一个方面是制备Ficoll的交联衍生物，以形成高分子量聚合物。Ficoll 的交联进一步增加该聚合物内的支化程度。本发明的这个方面的优点在于，通过控制该交联化学作用，可以在很宽的分子量范围内制备Ficoll聚合物。可以实现分子量大于一百万道尔顿的交联Ficoll，并且这些聚合物保持可溶解。这种聚合物能够进一步衍生，用于结合荧光染料和蛋白质；这些结合后的聚合物在固相结合分析中显示可以放大信号，并且最令人惊讶的是，对于该固相的低非特异性结合。这些性能特征是Ficoll 400或其它多糖的商业制品不可预期的。该交联的Ficoll组合物应具有以下特征(a)可溶性大于2. 5，5或10毫克/毫升；(b)平均水动力直径大于100，150，或200纳米；(c)分子量大于1，2，5，或IOMD和(d) 每Ficoll有至少25个用于连接结合分子和/或荧光染料分子的官能团。Ficoll的胺衍生物是商业上可获得的，其能够交联。图10显示了制备交联Ficoll 的流程图。许多荧光发生团是商业上可获得的，如NHS衍生物，其允许和蛋白质(如链霉亲和素或抗体)的氨基结合。Cy5和Alexa Fluor 647是良好的例子。然后该被荧光标记的蛋白质通过使用沿用已久的马来酰亚胺/巯基蛋白质结合步骤或其它交联方法被结合至氨基Ficoll。图11显示了抗体结合至交联Ficoll的流程图。交联Ficoll可以作为Cy5抗FITC的大分子载体，这种结合，与单体的Cy5抗FITC 相比较，可以增加免疫分析灵敏度。以下实施例进一步示范了本发明，其不应被解释为将本发明的范围限制为其中所述的特定步骤。
具体实施例方式实施例1交联Ficoll 400的制备
图10显示了制备交联Ficoll 400的流程图。向2毫升经过胺化，使每Ficoll 400 kD含88个胺(Skold Technology)的 Ficol 1400 (Sigma/Aldrich)的 20 毫克 / 毫升的 PBS 溶液添加 10 微升 SPDP (6-[3-[2-吡啶二硫基]丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯，Invitrogen)的50毫克/毫升的DMF(N，N- 二甲基甲酰胺)溶液。该SPDP与Ficoll的分子结合率(MCR)为15。在室温下使该混合物反应 1小时，随后渗析。通过标准方法估算的硫醇结合为5.5/Ficoll 400kD。为了去保护SPDP标记的Ficoll 400上的硫醇，向20毫克在1毫升PBS中的溶液添加30微升DTT ( 二硫苏糖醇，Thermo Scientific)的38毫克/毫升的PBS溶液，并使其在室温下反应两小时。在PD 10柱上纯化该SH-Ficoll。将SMCC (4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷羧酸琥珀酰亚胺酯)通过如下两种制备反应连接至胺化的Ficoll 400(88个胺汗化011) 1.)将10毫克胺化的Ficoll 400在 1毫升PBS中的溶液和25微升SMCC (Pierce Chemical)的10毫克/毫升的DMF溶液混合，使 SMCC/Ficoll的MCR为30。该混合物在室温下反应两小时，随后在PD 10柱(GEHealthcare) 上纯化。2.)将10毫克胺化的Ficoll 400在1毫升PBS中的溶液和12. 5微升SMCC的10 毫克/毫升的DMF溶液混合，使SMCC/Ficoll的MCR为15。该混合物在室温下反应2小时， 随后在PD 10柱上纯化。为了交联该SH-Ficoll 400和SMCC-Ficoll 400，进行了两种制备反应1.)将10 毫克SH-Ficoll 400在1毫升PBS中的溶液和10毫克SMCC-Ficoll 400在1毫升PBS中的溶液(30MCR)混合。2.)将10毫克SH-Ficoll 400在1毫升PBS中的溶液和10毫克 SMCC-Ficoll 400在1毫升PBS中的溶液(15MCR)混合。将混合物在30°C反应过夜。为了提供抗体和该交联Ficoll 400的连接位点，随后将残余的胺与过量的SPDP 反应。将20毫克交联Ficoll 400和75微升SPDP的50毫克/毫升的DMF溶液混合。该混合物在室温下反应1小时，随后相对于PBS渗析。然后将该SPDP标记的交联Ficoll 400制备反应物在kpharose 4B CL(GE Healthcare)柱上分离。结果表明该交联Ficoll是比天然的Ficoll 400大得多的聚合物， 并且交联的程度取决于SMCC的MCR。用30的SMCC MCR获得了高分子量聚合物，其在4B CL 的空隙体积处或其附近，组分40-50被洗出，其峰大致位于组分45(图12)；它们是用于在之后和结合蛋白及荧光染料载体结合的优选的聚合物。作为对比，空隙组分为组分32，该非交联的SPDP-Ficol 1高度分散，并且在组分50-120被洗出，其峰大致在组分98。实施例2. Cy5-抗体-交联Ficoll结合物的制备图11显示了制备Cy5_抗体-交联Ficoll 400的流程图。将抗FITC (Biospacific)在pH为9. 5的1毫升0. IM碳酸钠溶液中的3. 2毫克/ 毫升溶液和10. 6微升Cy5-NHS (N-羟基琥珀酰亚胺，GE Healthcare)的10毫克/毫升DMF 溶液混合，并使其在30°C反应1/2小时。然后在PD 10柱上纯化该混合物。将该Cy5_抗FITC在1毫升PBS中的1. 5毫克/毫升溶液和1. 9微升SMCC的5 毫克/毫升的DMF溶液混合，并在室温下反应1小时，随后在PD 10柱上纯化。通过向0. 7毫克交联Ficoll 400-SPDP在1毫升PBS中的溶液加入30微升38 毫克/毫升的DTT，并在室温下反应1小时，随后用PD 10柱纯化该交联Ficoll，来将交联 Ficoll400-SPDP上的硫醇去保护。
将该Cy5_抗FITC-SMCC与交联Ficoll 400-SH混合，并在室温下反应过夜。然后加入10微升12. 5毫克/毫升的NEM(N-乙基马来酰亚胺，Aldrich)，并在室温下反应小时。然后在kpharose 4B CL柱上纯化该结合物。实施例3. Cy5-抗体右旋糖酐结合物的制备制备Cy5_抗体右旋糖酐(直链)结合物(描述于美国专利5，650，334)，用于对比研究。将抗FITC (Biospacific)在pH为9. 5的1毫升0. IM碳酸钠溶液中的3. 2毫克/ 毫升溶液和10. 6微升Cy5-NHS (GE Healthcare)的10毫克/毫升DMF溶液混合，并使其在 30°C反应1/2小时。然后在PD 10柱上纯化该混合物。将该Cy5_抗FITC在1毫升PBS中的1. 5毫克/毫升溶液和1. 9微升SMCC的5 毫克/毫升的DMF溶液混合，并在室温下反应1小时，随后在PD 10柱上纯化。为了硫醇化右旋糖酐，将150微升的34毫克/毫升的6-[3-[2_吡啶二硫基]-丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯(LC-SPDP) (Pierce#21651)的DMF溶液加入5毫升含20毫克/ 毫升氨基右旋糖酐(Molecular Probes, #D_7145，130 胺 / 右旋糖酐，2000kD Μ. W.)，pH 为 7. 4的PBS溶液。在室温(RT)下进行反应30分钟，然后将该混合物在RT相对于PBS渗析过夜。在该反应期间，氨基右旋糖酐中超过95%的胺被LC-SPDP标记。然后该LC-SPDP-右旋糖酐4B CL柱上被纯化。为去除低分子量右旋糖酐组分，仅收集空隙峰的组分。将6. 15毫升pH7. 4，浓度为2. 6毫克/毫升的Cy5_抗FITC的PBS溶液和156微升2. 7毫克/毫升的SMCC(Pierce#22320)的DMF溶液混合，并使其在RT反应30分钟。通过在PD 10柱上纯化去除未反应的SMCC。通过将156微升的0. 5M 二硫苏糖醇加入5. 2毫升的3. 1毫克/毫升 LC-SPDP-右旋糖酐，并在RT培育15分钟，来还原该LC-SPDP-右旋糖酐。然后在 PD-IO (Pharmacia#17-0851-01)柱上纯化该右旋糖酐。通过将该被还原的LC-SPDP-右旋糖酐和SMCC-抗-FITC混合并在RT培育过夜， 获得结合物。加入NEM(Sigma#12828-7)至1. OmM的最终浓度，以停止该反应。然后将该结合物加样至kpharose 4B CL柱，并且收集在空隙体积洗出的组分。实施例4.肌钙蛋白I分析材料反应盘由PMMA塑料制成，在其底部上固定有苯甲酮牛血清白蛋白(BSA)-生物素， 其制备如下。然后将每盘100微升苯甲酮BSA-生物素在10微升/毫升的条件下通过紫外线-固化60分钟来固定。用异双功能连接试剂，S-乙酰基硫代乙醇酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SATA， Pierce#26102)，和SMCC(Pierce#22320)制备链霉亲和素-单克隆抗iTnI结合体(SA-抗 TnI)。将十五(15)摩尔过量的SATA (以5毫克/毫升溶解于DMF中)与1毫克pH为7. 4， 0. 74毫克/毫升的抗-TnI (BioDesign)的PBS溶液在室温下反应3小时。另外将15摩尔过量的SMCC (以5毫克/毫升溶解于DMF中)与1. 1毫克的链霉亲和素在PBS中的1. 1毫克/毫升溶液在室温下反应3小时。用PD 10柱从抗Tnl/SATA和链霉亲和素/SMCC反应混合物中去除未反应的连接物。将纯化的抗TnI-SATA和链霉亲和素-SMCC以1 3的蛋白摩尔比率混合。通过加入IM羟胺开始该结合反应直至IOOmM的最终浓度，并在4°C培育18小时以上。通过在该反应混合物中加入IOOmM的NEM至ImM的最终浓度停止该反应，并在室温下培育15分钟。NEM培育后，用kphacryl S 300柱(GE Healthcare)纯化混合物。将40微升25微克/毫升的SA-抗-TnI加入每个盘并在室温下培育1小时。分析缓冲液为PBS，BSA, 0. 吐温20，pH为7. 4。然后洗涤该盘3次。用荧光素标记亲合力纯化的山羊抗-TnI肽3 (Biospacif ic)如下将1毫克抗体的1. 8毫升PBS溶液和64微升荧光素-NHS (Invitrogen)的2毫克/毫升DMF溶液混合并在室温下反应2小时，随后在PD 10柱上纯化。实施例5. Cy5_抗FITC对Cy5_抗FITC-交联Ficoll在肌钙蛋白I免疫分析中的比较将40微升样品体积的0，10和50纳克/毫升的肌钙蛋白I加到盘中，并在室温下培育1小时。在分析缓冲液中洗涤这些盘三次。向每个盘加入40微升10微克/毫升荧光黄标记的抗TnI肽3，并在室温下培育25分钟，随后三次洗涤。将40微升10微升/毫升抗体的Cy5-抗FITC或Cy5-抗FITC-交联的(cx)Ficoll加入这些盘并在室温下培育25分钟，随后三次洗涤。接着测量每个盘表面上的Cy5荧光。(表1)。表1:分析结果
权利要求
1.用于在荧光分析中测量荧光信号的检测系统，包括长度比宽度的纵横比至少为5比1的探针，该探针具有远端和近端，该近端具有和荧光标记结合的传感表面；用于直接发射激发光至该探针的传感表面的光源； 朝向该传感表面的会聚透镜；和用于检测该发射荧光的光学探测器；其中这些会聚透镜会聚此发射荧光并将其引导至该光学探测器。
2.根据权利要求1的系统，其中该探针梢端表面的直径等于或小于5毫米。
3.根据权利要求1的系统，其中该探针是透明的。
4.根据权利要求3的系统，其中该探针的远端是锥形和/或粗糙的，以减少不希望的反射。
5.根据权利要求3的系统，其中该光源被对准，以使该光束以大于此探针的数值孔径角度的入射角投射在在该梢端表面上。
6.据权利要求1的系统，其中该探针是非透明的整体式的杆。
7.根据权利要求1的系统，其中该传感表面被覆盖以选自铝，金，或银的膜，该膜厚度为约50纳米至约500微米。
8.根据权利要求1的系统，进一步包括含溶液的容器，其中该探针的近端被浸入该溶液中，并且该光源和会聚透镜被安装在该容器的底部上。
9.在液体样品中检测被分析物的方法，包括步骤获取一探针，其具有被固定在该探针梢端的第一抗体，其中该梢端表面的直径< 5毫米；将该探针梢端浸入含液体样品的容器中，该液体样品含有被分析物； 在该样品容器中上下移动该探针梢端并在该样品容器中水平流动该试剂溶液，以将该被分析物和该第一抗体结合；将该探针梢端浸入含试剂溶液的试剂容器中，该试剂溶液包括分子量至少为一百万道尔顿，并且和至少5个第二抗体分子和至少25个荧光标记结合的聚合物；在该样品容器中上下移动该探针梢端并在该样品容器中水平流动该试剂溶液，以在该探针梢端上形成该被分析物，该第一抗体，和该第二抗体之间的免疫复合体； 将该探针梢端浸入含洗液的洗涤容器中，和通过检测该探针梢端上的荧光信号检测该形成的免疫复合体； 其中该第一抗体和该第二抗体是针对该被分析物的抗体。
10.在液体样品中检测被分析物的方法，包括步骤获取一探针，其具有被固定在该探针梢端的第一抗体，其中该梢端表面的直径< 5毫米；将该探针梢端浸入样品容器中，该样品容器包含(i)具有被分析物的液体样品和(ii) 包括分子量至少为一百万道尔顿，并且和至少5个第二抗体分子和至少25个荧光标记结合的聚合物的试剂溶液；在该样品容器中上下移动该探针梢端并在该样品容器中水平流动该试剂溶液，以在该探针梢端上形成该被分析物，该第一抗体，和该第二抗体的免疫复合体；将该探针梢端浸入含洗液的洗涤容器中；和通过检测该探针梢端上的荧光信号检测该形成的免疫复合体；其中该第一抗体和该第二抗体是针对该被分析物的抗体。
11.在液体样品中检测被分析物的方法，包括步骤(a)获取一探针，其具有被固定化在该探针梢端的第一抗体，其中该梢端表面的直径 <5毫米；(b)将该探针梢端浸入样品容器中，该样品容器含有具有被分析物的样品溶液，在该样品容器中上下移动此探针梢端并水平流动该样品溶液；(c)将该探针梢端浸入含试剂溶液的试剂容器中，该试剂溶液包括和一结合配对的第一成员结合的第二抗体分子，在该试剂容器中上下移动该探针梢端并水平流动该试剂溶液；(d)将该探针梢端浸入含扩增溶液的扩增容器中，该扩增溶液包括分子量至少为一百万道尔顿，并且和该结合配对的至少5个第二成员以及至少25个荧光标记结合的聚合物，在该扩增容器中上下移动该探针梢端并水平流动该扩增溶液，以在该探针梢端上形成该被分析物，该第一抗体，该第二抗体，和该结合配对的第一和第二成员的免疫复合体；(e)将该探针梢端浸入含第二洗液的第二洗涤容器中；和(f)通过检测该探针梢端上的荧光信号检测形成的免疫复合体，其中该第一抗体和该第二抗体是针对该被分析物的抗体。
12.根据权利要求9，10，或11的方法，其中该梢端表面的直径小于约2毫米。
13.根据权利要求11的方法，其中该结合配对的第一成员是生物素，并且该结合配对的第二成员是链霉亲和素。
14.一种组合物，包括分子量至少为一百万道尔顿的交联Ficoll，至少5个结合分子，和至少25个荧光染料分子，其中该结合分子和该荧光染料分子被连接至该交联Ficoll。
15.根据权利要求14的组合物，其中该荧光染料分子通过这些结合分子被间接连接至交联 Ficoll。
16.根据权利要求14的组合物，其中该结合分子是抗体分子或链霉亲和素。
17.根据权利要求14的组合物，其中该荧光染料分子是芳基磺酸酯花青染料。
18.根据权利要求17的组合物，其中该芳基磺酸酯花青染料是Cy5。
全文摘要
本发明涉及在荧光分析中用于测量荧光信号的检测系统。该系统包括探针，其具有结合有荧光标记的传感表面，以及安装在衬底传感表面的近侧的光源和检测器。本发明还涉及用于在液体样品中检测被分析物的方法，其使用具有小表面面积(≤5毫米)和具有多个结合分子和多个荧光标记的探针梢端。通过水平流动反应溶液并且在反应容器中上下移动该探针梢端加速该结合反应。本发明还涉及一种荧光标记组合物，其包括具有多个结合分子和多个荧光标记的交联Ficoll分子。
文档编号G01N21/64GK102341696SQ201080010177
公开日2012年2月1日 申请日期2010年3月2日 优先权日2009年3月3日
发明者夏明 , 曹二华, 罗伯特·F·祖克, 谭洪, 谭玉山, 陈骏 申请人:万迈医疗仪器有限公司