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专利名称：Ubc13蛋白质作为植物内参蛋白的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体地涉及Ubcl3蛋白质作为植物内参蛋白的应用。
背景技术：
蛋白质泛素化是一种重要的蛋白质翻译后修饰过程，这一过程参与调控蛋白质的功能及命运。泛素是一种76个氨基酸组成的小的修饰蛋白，它可以以个体形式或者以泛素聚合物的形式被连接到另一个泛素或者目标蛋白的赖氨酸残基上，前一种修饰形式称为单泛素化而后一种称为多聚泛素化。泛素表面含有几个可以用来连接其它泛素从而形成多聚泛素链的赖氨酸残基。不同的多聚泛素连接模式修饰的目的蛋白被赋以不同的功能，这些功能涉及的很广，从调控被修饰蛋白质的降解到改变它们参与的生物学途径。Ubcl3 (又称作UBE2N)是一种泛素连接酶(E2)，并且是迄今为止唯一已知的催化泛素第63位赖氨酸连接多聚泛素化链形成的泛素连接酶。Ubcl3通常需要与Mms2或者UevlA形成一个异源二聚体来行使其多聚泛素连接酶的功能。在动物细胞中，Ubcl3/Mms2和Ubcl3/UevlA两种异源二聚体分别以不同的模式催化目标蛋白的泛素化从而介导多种不同的信号通路，这些通路包括DNA损伤修复，p53和细胞周期检验点调控，细胞周期，炎症反应信号转导，骨髓生成， 免疫受体信号转导以及细胞内吞。发明内容
本发明的目的是Ubcl3蛋白质作为植物内参蛋白的应用。
进而,本发明的再一目的是提供人类Ubcl3蛋白质单克隆抗体4E11在western杂交检测中识别植物中的Ubc 13蛋白质的应用。
根据本发明的技术方案，所述植物Ubcl3蛋白可以为申请日之前所有已知的植物源Ubcl3蛋白质，例如其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。MANSNLPRRI IKETQRLLSE PAPGISASPS EDNMRYFNVM ILGPTQSPYE GRGVFKLELF 60LPEEYPMAAP KVRFLTKIYH PNIDKLGRIC LDILKDKffSP ALQIRTVLLS IQALLSAPNP 120DDPLSENIAK HffKSNEAEAV DTAKEffTRLY ASGA 154
本发明使用的人类Ubcl3蛋白质单克隆抗体4E11可以购自英俊(invitrogen)公司，商品名称Mouse anti_Ubcl3,货号37_1100。
根据本发明的具体实施方式
，利用人类Ubcl3蛋白质单克隆抗体(4E11)对拟南芥(哥伦比亚O型)组织全蛋白提取物以及水稻(日本晴)组织全蛋白提取物中的Ubcl3蛋白质进行检测。首先提取拟南芥(哥伦比亚O型)和水稻(日本晴)全组织总蛋白，然后通过 SDS-PAGE电泳对两种全蛋白进行分离并且通过western杂交技术利用人类Ubc 13蛋白质单克隆抗体对两种蛋白样本中的Ubcl3蛋白质进行检测。
人类Ubcl3蛋白质单克隆抗体4E11是一种可以作为植物western杂交内参的蛋白质。拟南芥是一种被作为模式植物而广泛地应用到植物生物学研究中的小型的开花植物。拟南芥属于双子叶十字花科植物，同一科的成员还有卷心菜以及萝卜等。拟南芥虽然不是农作物，但是因为自身的重要优势为遗传学以及分子生物学的领域的基础研究提供了重要帮助。同样作为模式植物，水稻虽然生长周期较拟南芥要长，种植环境也比较复杂，但水稻的种子——大米，作为当前世界主要的农作物，在作物产量及品质等方面的研究价值是拟南芥所不能比拟的。水稻属于一年生单子叶草本植物，从生长特点到生理结构等与拟南芥所代表的双子叶植物也存在一定的区别。因此，水稻也成为了人们研究植物生理学以及分子细胞生物学的重要模式植物。
本发明通过对拟南芥以及水稻的表达芯片数据库进行检索，发现Ubcl3基因在拟南芥和水稻中稳定高表达。同时本发明还通过了 western杂交,在以考马斯亮蓝染色蛋白样本为参照的情况下，利用人类Ubcl3蛋白质单克隆抗体，对不同信号处理的水稻总蛋白样本中Ubcl3表达量进行检测，发现Ubcl3的蛋白水平在不同处理的样本间保持着很好的一致性。
本发明利用人类Ubcl3蛋白质单克隆抗体(4E11)可以很好地在western杂交检测中识别植物中的Ubcl3蛋白质。并且由于Ubcl3蛋白质在植物中具有看家基因的特点， 人类Ubcl3蛋白质单克隆抗体(4E11)可以作为不同植物中通用的western杂交内参识别抗体。这是第一个可以作为跨植物western杂交内参蛋白识别的单克隆抗体。


图I人类Ubcl3蛋白质单克隆抗体4E11识别拟南芥(哥伦比亚O型)总蛋白以及水稻(日本晴)总蛋白中的Ubcl3蛋白，图中I和2泳道标注的分别为拟南芥幼苗时期全组织和成年植株叶片组织总蛋白，3和4泳道标注的分别为水稻萌发时期全组织和成年时期叶片组织的总蛋白，17kD位置是4E11识别的Ubc 13蛋白。
图2人类Ubcl3蛋白质单克隆抗体4E11识别水杨酸和甲基茉莉酸酯处理情况下拟南芥总蛋白中的Ubcl3蛋白。总蛋白上样量均为20微克。
图3人类Ubcl3蛋白质单克隆抗体4E11识别水杨酸，甲基茉莉酸酯和脱落酸处理情况下水稻总蛋白中的Ubcl3蛋白。总蛋白上样量均为20微克。
具体实施方式
实施例I利用人类Ubcl3蛋白质单克隆抗体4E11识别植物中的Ubcl3蛋白质的方法
(I)从拟南芥(哥伦比亚O型)以及水稻(日本晴)组织中提取总蛋白质
在研钵中用液氮辅助将植物样本磨成粉末，并将磨好的植物样本转到加有蛋白质裂解液的I. 5ml EP管中混勻(每Iml蛋白质裂解液中加入O. 5mg研磨好的植物样本粉末)。蛋白质裂解液的成分如下50mM Tris-HCl pH=8. 0,0. 3M NaCl,2mM EDTA, 10%甘油,O. l%TritonX-100, IOmM PMSF, 3mM DDT 以及蛋白酶抑制剂(罗氏)。
将混匀的蛋白质样本置于4摄氏度离心机中，14000转每分钟离心15分钟。取上清转入新的I. 5ml EP管中，再次4摄氏度14000转每分钟离心15分钟。最后将上清转到新的I. 5mlEP管中，至此植物样本总蛋白提取完成。
(2)植物蛋白样本SDS-PAGE电泳分离
取植物总蛋白样本50ul，加入IOul 6X SDS上样缓冲液(缓冲液配方 O. 75MTris-HCl pH=6. 5，60%[质量体积比]甘油，24%[质量体积比]SDS，0. 03%[质量体积比]溴酚蓝)混匀，100摄氏度煮5分钟。冷却后将样本14000转每分钟离心2分钟(将蒸发到管盖上的样本收集到管底)。
浓度为12%SDS-PAGE 胶配置分离胶:12% 预制胶，O. 375M Tris-HCl pH=8. 8， O. 1%SDS, O. 1% 过硫酸铵以及 O. 04%TEMED ;浓缩胶5. 1% 预制胶，O. 1875MTris_HClpH=6. 8， O. 1%SDS, O. 1% 过硫酸铵以及 O. l%TEMEDo
蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定使用Bio-Rad Dc Protein Assay Reagent,标准曲线用0mg/ml，2mg/ml, 4mg/ml, 6mg/ml, 8mg/ml, lOmg/ml BSA水溶液作为标准品测定并绘制。
每个样本取20ug煮好的总蛋白样本上样，恒压100V电泳90分钟
(3) Western杂交详细步骤
电转液成分甘氨酸14. 41g/L, Tris 3. 03g/L, 800ml水，200ml甲醇，配好后4摄氏度预冷。PVDF膜使用前用甲醇浸泡10分钟，滤纸用预冷的电转液浸泡。按如下顺序组装转膜装置正极板，海绵，三张滤纸，PVDF膜，电泳完成的胶，三张滤纸，海绵，负极板。将装好的转膜装置放入电转槽，4摄氏度100V转90分钟。
封闭将转好的PVDF膜置于5%脱脂奶粉溶解到磷酸缓冲液(PBS)中，并置于滚动摇床上室温封闭 I 小时。PBS 配方=KCl 0. 2g, KH2PO4O. 2g, NaCl 0. 8g, Na2HPO4 · 12H20 3g。
一抗杂交将人类Ubcl3蛋白质单克隆抗体(4E11)以I :5000溶在含有5%脱脂牛奶的PBS溶液中。将封闭完成的PVDF膜转入一抗溶液中，置于滚动摇床上室温孵育一小时。
二抗杂交将一抗孵育完毕的PVDF膜放入PBST中(PBS缓冲液加入0. 1%吐温 20)，在摇床上清洗10分钟，重复3次。将羊抗鼠IgG-HRPCSanta Cruz，sc2005)以I :5000 溶在5%脱脂牛奶的PBS溶液中。将冲洗干净的PVDF膜放入二抗溶液中，室温孵育I小时。
显影二抗杂交结束后，将PVDF膜按照3d中的方法清洗3遍。将SuperSignal (Thermo, 34080)中的两种溶液I :1混合，均匀的洒在PVDF膜上，反应2分钟，之后置于 LAS-4000 (FUJIFILM)中显影。
权利要求
1.Ubcl3蛋白作为植物内參蛋白的应用。
2.人类Ubcl3蛋白质单克隆抗体4E11在western杂交检测中识别植物中的Ubcl3蛋白质的应用。
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，具体地涉及Ubc13蛋白质作为植物内参蛋白的应用。本发明利用人类Ubc13蛋白质单克隆抗体(4E11)可以很好地在western杂交检测中识别植物中的Ubc13蛋白质。并且由于Ubc13蛋白质在植物中具有看家基因的特点，人类Ubc13蛋白质单克隆抗体(4E11)可以作为不同植物中通用的western杂交内参识别抗体。这是第一个可以作为跨植物western杂交内参蛋白识别的单克隆抗体。
文档编号G01N33/68GK102977199SQ20121049918
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年8月14日
发明者萧伟, 臧越鹏 申请人:首都师范大学