专利名称：一种筛选中药药效相关成分的方法及模型建立方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选中药药效相关成分的方法及模型建立方法。
背景技术：
中药是中医临床预防及治疗疾病的重要物质基�。哂卸喑煞�、多靶点和多途径整体的特点。然而中药成分复杂，挖掘和阐释中药活性物质成分是研发安全有效、质量可控的现代中药的基�。墙沂局幸┛蒲诤�、指导临床合理用药的前提。长期以来，中药药效活性成分研究的主流模式主要是借鉴国外对天然产物活性成分研究的基本策略[1_3]。这样的研究模式对一些中药药效活 性成分的阐明起到了积极作用，如青蒿素的发现M。然而传统方法需要将所有部分逐一提取、分离得到单体，再做药效活性筛选，不仅实验周期长，成本高，而且还会出现活性成分易丢失，纯度与活性背离的问题[5]。日本科学家曾在过去数十年里试图从中草药中提取药效活性成分，但未获得成功[6]。靶细胞提取或脂质体色谱固定相已用于药物成分的初步筛�。秆〉某煞质欠裎嬲幕钚猿煞只褂写徊教教�。近年来，针对体外抗氧化活性筛选模型，建立了高效液相色谱在线筛选方法[8’9]，该方法直观、快速，但需要改装仪器和柱后反应通道，且药理学模型特殊(仅用于抗氧化活性成分的筛选)，限制了该方法的广泛应用。上述中药药效活性成分的筛选方法也不能体现多成分对药效指标综合作用的特点。通过高效液相色谱指纹图谱与药效指标进行关联确定可能的药效相关成分亦有报道，这些方法均采用相对峰面积代替成分含量进行筛选[1(U1]。由于色谱指纹图谱的相对峰面积不能反映这些成分实际含量，因此筛选结果有待商榷。对于中药这种复杂体系，寻找简便、快速、准确且通用的中药药效相关成分的筛选方法一直是中药现代化的关键科学问题之一。随着计算机信息技术的迅猛发展，一些先进方法已应用于中医药研究领域，不仅加速了中药药效活性成分的发现和辨识，而且也减少了盲目性和偶然性，为中药活性成分的筛选提供了先进的技术手段。参考文献[I]李萍，齐炼文，闻晓东，盛亮洪.中药效应物质基础和质量控制研究的思路与方法[J] ·中国天然药物，2007，5 (I) : 1-9.[2]熊清平，张强华，石莹莹.基于代谢组学的中药药效物质基础研究思路与方法[J],现代中药研究与实践，2011，25 (6) :97-99.[3] Li HJ, Jiang Y, Li P. Chemistry, bioactivity and geographicaldiversity of steroidal alkaloids from the Liliaceae family[J]· Natural ProductReports, 2006, 23(5) : 735-752.[4]Michelle Grayson. Traditional asian medicine[J]. Nature, 2011, 480:S81.[5]刘庆山，张梓倩，方亮，江一帆，尹小英.高通量技术与网络药理学在中药活性成分筛选中的应用[J].中国中药杂志，2012，37 (2) :134-137.
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发明内容
针对上述现有技术，为了解决现有筛选中药药效相关成分时间周期长，成本高，通用性较差且可靠性有待考察的问题，本发明提供了一种能够快速、简单、准确且通用性较好的筛选中药药效相关成分的方法，该法能够有效确定药效相关成分，并能体现多成分对药效指标综合作用的特点。本发明是通过以下技术方案实现的一种筛选中药药效相关成分的方法，步骤如下(I)以所研究中药为对象，制备若干组化学成分浓度不同的供试品溶液；(2)选择部分化学成分配制成不同浓度的溶液进行HPLC分析和/或将同一供试品溶液以不同浓度进行HPLC分析，测定其浓度和峰面积，并考察峰面积与对应成分浓度的线性关系；(3)选择在浓度与峰面积的线性范围内的若干组供试品溶液，并测定各自的HPLC指纹图谱和对应药效指标;(4)在与峰面积呈线性关系的浓度范围内，采用线性回归分析方法得到各成分的峰面积与药效指标之间的相互关系，根据各成分标准化回归系数和/或t检验结果的大小和正负确定药效相关成分对药效指标的作用，从而筛选出中药药效相关成分。所述步骤(I)中通过对所研究中药的产地和/或提取工艺的变化来获得化学成分浓度不同的供试品溶液。优选的，选择产地和/或提取工艺中不同因素和水平进行正交实验，得到若干组化学成分浓度不同的供试品溶液。所述步骤(2)中选择部分化学成分制成对照品溶液进行HPLC分析的方法是选择部分化学成分配制成对照品混合溶液，并以该对照品混合液配制不同浓度的对照品溶液，然后进行HPLC分析，以各化学成分浓度为横坐标，以各成分对应的色谱峰面积为纵坐标，考察峰面积与对应成分浓度的线性关系，确定各成分浓度的线性范围。所述步骤(2)中将同一供试品溶液以不同浓度进行HPLC分析的方法是将同一供试品溶液制成供试液，分别以不同的进样量进行HPLC分析，选择全部或部分共有峰，以色谱分析的进样量作为所选择的共有峰所代表的化学成分的浓度单位，并以该浓度单位作为横坐标，以该共有峰对应的色谱峰面积为纵坐标，考察峰面积与对应成分浓度的线性关系，确定各成分浓度的线性范围。它还包括取若干已知对照品进行HPLC分析，从而对所研究中药图谱对应色谱峰进行定性分析的步骤。所述步骤(2)中的部分成分并不限定成分数量，只是为了研究问题的方便。为了体现各种成分对药效指标的综合作用，成分数量应大于I。所述步骤(4)还包括根据各成分与药效指标建立的数学表达式体现各成分对药效指标的综合作用，所述数学表达式为药效是各成分的浓度与其标准化回归系数的乘积之和。本发明的另一目的是提供一种筛选中药药效相关成分的模型建立方法，步骤如 下择取中药中多个化学成分，采用正交试验设计将各成分看作试验因素按不同浓度水平组合安排各次试验样品，然后在25°C室温下，采用高效液相色谱仪对正交试验设计的各次试验样品测定得到高效液相色谱(HPLC)指纹图谱。对各次试验样品测定对应药效指标。采用线性回归分析方法建立HPLC指纹图谱各色谱峰面积与药效指标之间的相互关系。在浓度线性范围内，用峰面积代替成分含量与药效指标计算的标准化回归系数是一致的。根据各成分标准化回归系数的大小及统计检验结果确定药效相关成分；根据各成分标准化回归系数的正负确定药效相关成分对药效指标的正向或负向作用；根据各成分与药效指标建立的数学表达式体现多成分对药效指标的综合作用。具体而言，所述模型建立方法是以下步骤(I)以所研究中药为对象，择取中药中所含多个(数量大于I个)已知的化学成分；(2)将这些化学成分配制成对照品混合溶液，然后进行HPLC分析，以各化学成分浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，考察色谱峰面积与对应成分浓度的线性关系，确定各成分浓度的线性范围。(3)将这些化学成分作为因素，在浓度线性范围内，采用正交试验设计将这些化学成分按不同浓度水平进行组合，得到各次试验样品。(4)在25°C室温下，采用高效液相色谱仪采集上述各次试验样品的原始高效液相色谱指纹图谱；(5)将上述所得的各次试验样品HPLC指纹图谱各色谱峰按照保留时间相近的原则进行色谱峰匹配；(6)将上述取得的各次试验样品进行药理学实验，测定相应的药效指标；(7)采用线性回归分析法将匹配后的各次试验样品HPLC指纹图谱色谱峰面积与对应药效指标进行关联建立数学模型(即采用线性回归分析建立数学模型)，计算各个成分对应的标准化回归系数；(8)根据各成分标准化回归系数的大小及统计检验结果确定与药效相关的成分；根据各成分标准化回归系数的正、负确定药效相关成分对药效指标的正向或负向作用；根据各成分与药效指标建立的数学表达式体现各成分对药效指标的综合作用。(9)对上述确定药效相关成分进行实验验证。
优选的，所述步骤(7)中，所述HPLC指纹图谱色谱峰面积是指在色谱峰面积与对应成分浓度线性关系良好(在浓度线性范围内)的条件下，基于色谱峰面积与药效指标计算的标准化回归系数和基于成分含量与药效指标计算的标准化回归系数是一致的。因此可以采用指纹图谱色谱峰面积代替成分含量与药效指标建立数学模型。优选的，所述步骤(7)中，所述数学模型中，用HPLC指纹图谱色谱峰面积代替成分含量与药效指标进行关联建立数学模型是通过数学证明得到的。本发明的方法简便、易行、可靠且通用性好，并能体现多成分对药效指标综合作用的特点，适于中药复杂体系的药效相关成分的筛选，为中药活性成分的发现和筛选提供技术数据支持。
图1-1为25°C的室温下，采用Agilent 1260型高效液相色谱仪取得的代表性黄芪 药材5个成分对照品混合液原始高效液相色谱(HPLC)指纹图谱。图1-2为正交试验设计(L16 (45)) 16次试验样品的原始HPLC指纹图谱经中药指纹图谱相似度评价系统2004A (国家药典委员会)按保留时间数据进行匹配后得到的各次试验样品的HPLC指纹图谱。图1-3为DPPH溶液与黄芪药材中5种成分溶液在400nm 600nm范围内紫外吸
收光谱。图1-4为黄芪甲苷及芒柄花素与DPPH自由基反应时间曲线。图2-1为黄芪药材与对照品HPLC图谱(I.毛蕊异黄酮苷2.毛蕊异黄酮3.芒柄花素)。图2-2为黄芪药材指纹图谱的共有峰图谱。图2-3为正交设计各次实验的HPLC指纹图谱。图2-4为黄芪样本的I1Ai1图一。图2-5为色谱峰的标准化回归系数一。图2-6为PLSR模型的VIP图一。图2-7为黄芪样本的I1Ai1图二。图2-8为色谱峰的标准化回归系数二。图2-9为PLSR模型的VIP图二。图2-10为黄芪药材部分色谱峰紫外光谱及一级质谱图(分别为图2-2中编号8、13、14、15、16、17、18所代表的色谱峰的紫外光谱和一级质谱图)。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。实施例I所用中药黄芪药材；所用药效指标清除DPPH自由基活性(DPPH自由基清除率)。虽然以中药黄芪和清除DPPH自由基活性药效指标为例，但本发明所述方法对所用中药及药效指标并无限制。I. I对照品溶液的配制精密称取黄芪药材中所含的4种化学成分山奈酚、槲皮素、毛蕊异黄酮及芒柄花素的标准品各约5mg、5mg、2mg和2mg,加甲醇溶解并分别定容于IOmL棕色容量瓶中，即得各个成分储备液；精密称取黄芪甲苷标准品约10mg，加甲醇溶解并定容于5mL棕色容量瓶中，即得其储备液。对照品溶液进样前用0.45 μ m微孔滤膜过滤。精密称取维生素C 10mg，加甲醇溶解并定容于IOmL棕色容量瓶中，即得维生素C储备液，作为阳性对照；精密称取维生素E 25mg,加甲醇溶解并定容于IOmL棕色容量瓶中，即得维生素E储备液(应立即在4°C温度下保存)，作为阳性对照。I. 2DPPH标准溶液的配制及DPPH自由基清除率的计算精密称取DPPH约5mg，用甲醇溶解并定容于50mL的棕色容量瓶当中，即得DPPH储备液。DPPH自由基清除率由式(I)计算得到
DPPH ■_ (%) = (VX100
\J⑴式⑴中[DPPH · ] t=40和[DPPH · ] t=0分别表示时间为40分钟和O分钟时的DPPH自由基的浓度。该浓度可以采用紫外分光光度法在515nm处通过吸光度A与DPPH自由基浓度的回归曲线(A=O. 0273 X [DPPH ·]+0. 0229，相关系数的平方R2=O. 9997)计算得到。由图1-3可见，DPPH自由基在515nm处有吸收峰，而其它成分不干扰DPPH吸光度的测定。DPPH标准曲线的测定方法如下将98. 4μ g · mPDPPH甲醇溶液依次稀释，得到6个不同浓度的DPPH 甲醇溶液(98. 4 μ g *mL S 49. 2 μ g *mL 1, 24. 6 μ g *mL \ 6. 15 μ g *mL 1, 3. 075 μ g *mL SI. 538 μ g .mL-1)，在515nm处测定上述各个浓度下的吸光度值(纯甲醇作为空白)，以DPPH浓度(μ g · mL—1)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。I. 3色谱条件色谱柱PhenomexSynergi Hydro-RP C18 (250mmX 4. 6mm, 4 μ m);流动相乙臆(A)-水(B)，梯度洗脱(0min，25%乙腈；20min，45%乙腈);DAD设定波长范围19(T400nm，色谱检测波长采用切换波长法(Omin, 254nm ；15. 8min, 203nm ；17min, 254nm);柱温25°C ;流速lmL/min ;进样量10 μ L,分析时间为28min。I. 4线性范围精密量取5种黄芪对照品储备液，加甲醇制成含槲皮素62. 8 μ g/mL、山奈酚56. 5 μ g/mL、黄苗甲苷880. O μ g/mL、芒柄花素27. 5 μ g/mL、毛蕊异黄酮29. I μ g/mL的混合溶液，作为混合对照品溶液。精密吸取混合对照品溶液O. lmL、0. 2mL、0. 5mL、ImL, I. 5mL和2mL，置于2mL容量瓶中，加甲醇定容，精密吸取10 μ L，进行HPLC分析，如图1_1所示。以对照品浓度X ( μ g/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，各对照品回归方程及线性范围如表1-1所示，5种成分在测定的浓度范围内，线性关系良好。表1-1黄芪药材所含的5种成分的线性回归结果
权利要求
1.一种筛选中药药效相关成分的方法，其特征是，步骤如下 (1)以所研究中药为对象，制备若干组化学成分浓度不同的供试品溶液； (2)选择部分化学成分配制成不同浓度的溶液进行HPLC分析和/或将同一供试品溶液以不同浓度进行HPLC分析，测定其浓度和峰面积，并考察峰面积与对应成分浓度的线性关系; (3)选择在浓度与峰面积的线性范围内的若干组供试品溶液，并测定各自的HPLC指纹图谱和对应药效指标； (4)在与峰面积呈线性关系的浓度范围内，采用线性回归分析方法得到各成分的峰面积与药效指标之间的相互关系，根据各成分标准化回归系数和/或t检验结果的大小和正负确定药效相关成分对药效指标的作用，从而筛选出中药药效相关成分。
2.如权利要求I所述的方法，其特征是，所述步骤(I)中通过对所研究中药的产地和/或提取工艺的变化来获得化学成分浓度不同的供试品溶液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是，选择产地和/或提取工艺中不同因素和水平进行正交实验，得到若干组化学成分浓度不同的供试品溶液。
4.如权利要求I所述的方法，其特征是，所述步骤(2)中选择部分化学成分制成对照品溶液进行HPLC分析的方法是选择部分化学成分配制成对照品混合溶液，并以该对照品混合液配制不同浓度的对照品溶液，然后进行HPLC分析，以各化学成分浓度为横坐标，以各成分对应的色谱峰面积为纵坐标，考察峰面积与对应成分浓度的线性关系，确定各成分浓度的线性范围。
5.如权利要求I所述的方法，其特征是，所述步骤(2)中将同一供试品溶液以不同浓度进行HPLC分析的方法是将同一供试品溶液制成供试液，分别以不同的进样量进行HPLC分析，选择全部或部分共有峰，以色谱分析的进样量作为所选择的共有峰所代表的化学成分的浓度单位，并以该浓度单位作为横坐标，以该共有峰对应的色谱峰面积为纵坐标，考察峰面积与对应成分浓度的线性关系，确定各成分浓度的线性范围。
6.如权利要求I所述的方法，其特征是，它还包括取若干已知对照品进行HPLC分析，从而对所研究中药图谱对应色谱峰进行定性分析的步骤。
7.如权利要求I所述的方法，其特征是，所述步骤(4)还包括根据各成分与药效指标建立的数学表达式体现各成分对药效指标的综合作用，所述数学表达式为药效是各成分的浓度与其标准化回归系数的乘积之和。
8.一种筛选中药药效相关成分的模型建立方法，其特征是，步骤如下所述方法是通过以下步骤建立的 (O以所研究中药为对象，择取中药中所含多个已知的化学成分； (2)将这些化学成分配制成对照品混合溶液，然后进行HPLC分析，以各化学成分浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，考察色谱峰面积与对应成分浓度的线性关系，确定各成分浓度的线性范围； (3)将这些化学成分作为因素，在浓度线性范围内，采用正交试验设计将这些化学成分按不同浓度水平进行组合，得到各次试验样品； (4)在25°C室温下，采用高效液相色谱仪采集上述各次试验样品的原始高效液相色谱指纹图谱；(5)将上述所得的各次试验样品HPLC指纹图谱各色谱峰按照保留时间相近的原则进行色谱峰匹配； (6)将上述取得的各次试验样品进行药理学实验，测定相应的药效指标； (7)采用线性回归分析法将匹配后的各次试验样品HPLC指纹图谱色谱峰面积与对应药效指标进行建立线性回归数学模型，计算各个成分对应的标准化回归系数； (8)根据各成分标准化回归系数的大小及统计检验结果确定与药效相关的成分；根据各成分标准化回归系数的正、负确定药效 相关成分对药效指标的正向或负向作用；根据各成分浓度与其标准化回归系数的乘积之和体现各成分对药效指标的综合作用； (9)对上述确定药效相关成分进行实验验证。
全文摘要
本发明公开了一种筛选中药药效相关成分的方法及模型建立方法，步骤如下以所研究中药为对象，制备若干组化学成分浓度不同的供试品溶液；选择部分化学成分进行HPLC分析，考察峰面积与浓度的线性关系；选择线性范围内的若干组供试品溶液，测定各自的HPLC指纹图谱和药效指标；在线性关系范围内，采用线性回归分析方法得到各成分的峰面积与药效指标之间的相互关系，根据各成分标准化回归系数和/或t检验结果的大小和正负确定药效相关成分对药效指标的作用，从而筛选出中药药效相关成分。本发明的方法简便、易行、可靠且通用性好，并能体现多成分对药效指标综合作用的特点，适于中药复杂体系的药效相关成分的筛选，为中药活性成分的发现和筛选提供技术数据支持。
文档编号G01N30/02GK102879486SQ201210324140
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月5日 优先权日2012年9月5日
发明者聂磊, 邓书鸿, 姜红, 宋丽, 段小菊, 张丹潞, 魏敏 申请人:山东大学
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