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专利名称：一种基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器的制备方法，属于材料制备技术领域。
背景技术：
有机磷农药广泛应用农业、工业、医药等领域，作为常用的除草剂、杀真菌剂、杀虫剂。中国农药中毒的数量也越来越多，资料显示75. 14%的农药中毒系由有机磷农药引起，有机磷农药具有烷基化作用，对动物有致癌、致畸和致突变作用，同时也对环境产生严重的污染。生物传感器具有快速、简便、灵敏及成本低等优点，因此在农药残留快速检测中得以广泛应用。石墨烯具有良好的生物相容性、独特的电学性能、明显的量子效应、大的比表面积、高稳定性以及强吸附特性，近年来引起世界各国化学、物理、材料学界人士的广泛关注，在科学基础研究及应用研究中倍受青睐。碳纳米管(CNTS)具有特殊的电学性质，其导电性既具有半导体性质又具有金属性质，使其能促进电子的传递。同时，碳纳米管特殊的吸附性、大比表面积效应、表面带有的各种功能基团及缺陷等诸多特性使它有利于酶和碳管之间的电子传递，对某些物质的电化学行为产生特有的催化效应。另一方面，碳纳米管独特的纳米结构起到了“分子导线”的作用，将电子传递到酶的氧化还原中心。本发明利用石墨烯复合材料的优异性能和碳纳米管独特的纳米结构，形成三维结构，有效结合石墨烯与碳纳米管的特性，增大了比表面积，可以大大提高酶的负载率；同时碳纳米管作为分子导线和桥梁，连接酶与石墨烯可以提高电子传递速度，制备出一种灵敏度高并且具有优良稳定性的 有机磷生物传感器，能进行大量样品的现场快速定量检测，可广泛应用到环境监测等方面。

发明内容
本发明的目的在于提供一种基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器的制备方法。本发明提出的一种基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器的制备方法，是用聚乙二醇功能化修饰石墨烯改善其分散性，再将其与羧基化的碳纳米管联用，形成三维网络结构。修饰到玻碳电极上，再将乙酰胆碱酯酶固定在电极上，制备电化学生物传感器，用于有机磷的快速电化学测定。其具体步骤如下
I)功能化石墨烯GO-PEG的制备200mg氧化石墨GO加入到IOmlDMF中，在50 120kHz超声处理I 5小时，得到稳定的G0/DMF分散液。再将40mlS0Cl2加入到该分散液中，在6(T80°C温度下，回流反应2Γ48小时，蒸馏除去多余的S0C12。然后将2gPEG加入到反应物中，在12(Tl50°C温度下，回流反应72 96小时，用乙醇、水洗至中性，真空60°C干燥，得到功能化石墨烯GO-PEG。(2)将O. 5g 2g碳纳米管和强氧化性酸100 500mL混合，在5(Tl20kHz超声或100r/min IO6 r/min的离心速度搅拌下处理I 80小时,然后加热到20 120°C,搅拌并回流反应I 80小时，经去离子水稀释洗涤微孔滤膜抽滤，至滤液为中性，在25 200°C温度下真空干燥I 48小时，得到羧基化的碳纳米管。(3)生物传感器的制备
a.玻碳电极的预处理首先将玻碳电极(Φ=3ι πι)用金相砂纸抛光,再依次用Ι.ΟμπκO. 3 μ m和O. 05 μ m的Al2O3悬浮液在麂皮上抛光至镜面，最后分别用1:1的HNO3溶液、无水乙醇和二次蒸馏水超声清洗干净，备用。b.修饰玻碳电极的制备将预处理好的玻碳电极在步骤(I)得到的O. 05M功能化石墨烯分散液中浸泡20-40分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的功能化石墨烯；再在碳纳米管分散液中浸泡20-40分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的碳纳米管，如此反复几次(如2-5次)，氮气气氛中，自然晾干。然后将乙酰胆碱酯酶固定在玻碳电极上，得到基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器，置于O. 10 mol/L PBS中于4°C保存备用，然后在电化学工作站上测试传感器的分析性能。本发明中，步骤(I)中所述石墨烯是指单层石墨片、多层石墨片或它们的混合物中任一种。本发明中，步骤(I)中所述聚乙二醇PEG分子量为200、400、600、1000、2000、4000
中的任一种。

本发明中，步骤(2)中所述碳纳米管包括化学气相沉积法、电弧放电法、太阳能法、模板法或激光蒸发法中的任一种制备的单壁或多壁碳纳米管或其以任意比例混合的混合物。本发明中，步骤(3)中所述功能化石墨烯和碳纳米管的吸附层数为1、2、3、4或5中的任一种。本发明中，步骤(3)中所述乙酰胆碱酯酶来源为家蝇、果蝇、电鳗等动物或植物中的任一种。本发明中，步骤(3)中所述乙酰胆碱酯酶的固定方法为吸附法、包埋法、共价键合法、交联法、电聚合法等中的任一种。本发明中，强氧化性酸是O.1 60%重量酸浓度硝酸、5 100%重量酸浓度硫酸、I / 100 50 / I摩尔比高锰酸钾和硫酸混合溶液、I / 100 50 / I摩尔比硝酸和硫酸混合溶液、I / 100 50 / I摩尔比高锰酸钾和硝酸混合溶液、I / 100 50 / I摩尔比过氧化氢和硫酸混合液、I / 100 50 / I摩尔比过氧化氢和盐酸混合液或I / 100 50 / I摩尔比过氧化氢和硝酸混合液中任一种或其多种组合。本发明提供传感器制备方法简单易行，将石墨烯与碳纳米管联用形成三维网络结构，有效结合了石墨烯与碳纳米管的特性，增大了比表面积，可以大大提高酶的负载率；同时碳纳米管作为分子导线和桥梁，连接酶与石墨烯可以提高电子传递速度。制备的纳米复合材料生物相容性好，利于生物酶的固定且制备方法成本低，简单快捷。因此，本发明具有重要的科学技术价值和实际应用价值。


图1为实施例1中基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器的工艺流程及结构示意图。图2为实施例1在含有有机磷农药(2μΜ)的O. 05Μ、ρΗ=7. 4的磷酸盐PBS缓冲溶液中基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器的循环伏安曲线图。图中，测试操作电压为-1. (Tl. 0V，扫描速率为50mv/so图3为实施例1在O. 05M、pH=7. 4的磷酸盐PBS缓冲溶液中依次加入4mM有机磷农药溶液的生物传感器的电流-时间曲线图。图中，酶电极电位为O. 5v，传感器的检测下限为 2mMo
具体实施例方式下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。下述实施例中，所用的工作电极是玻碳电极(Φ=3πιπι)。电化学测试所用的对电极是钼电极，参比电极为Ag/AgCl标准电极。电化学测试采用循环伏安法，操作电压为-1. (Tl. 0V,扫描速率为50mv/s，测试底液为O. 05M、pH=7. 4的磷酸盐PBS缓冲溶液。实施例1 :1)功能化石墨烯GO-PEG的制备200mg氧化石墨GO加入到IOmlDMF中，在70kHz超声处理3小时，得到稳定的G0/DMF分散液。再将40mlS0Cl2加入到该分散液中，在80°C温度下，回流反应48小时，蒸馏除去多余的S0C12。然后将2gPEG4000加入到反应物中，在120°C温度下，回流反应96小时，用乙醇、水洗至中性，真空60°C干燥，得到功能化石墨烯G0-PEG。(2)将O. 5g碳纳米管和强氧化性酸IOOmL混合，在120kHz超声波下处理5小时，然后加热到120°C，搅拌并回流反应72小时，经去离子水稀释洗涤微孔滤膜抽滤，至滤液为中性，在60°C温度下真空干燥48小时，得到羧基化的碳纳米管。(3)生物传感器的制备
a.玻碳电极的预处理首先将玻碳电极(Φ=3ι πι)用金相砂纸抛光,再依次用1. Ομπι和O. 3 μ m和O. 05 μ m的Al2O3悬浮液在麂皮上抛光至镜面，最后分别用1:1的HNO3溶液、无水乙醇和二次蒸馏水超声清洗干净，备用。b.修饰玻碳电极的制备将预处理好的玻碳电极在步骤(I)得到的O. 05M功能化石墨烯分散液中浸泡30分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的功能化石墨烯；再在碳纳米管分散液中浸泡30分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的碳纳米管，如此反复3次，氮气气氛中，自然晾干。然后再在乙酰胆碱酯酶的5%壳聚糖溶液中4°C下浸泡12小时，将乙酰胆碱酯酶固定在电极上，得到基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器，置于O. 10 mol/L PBS中于4°C保存备用。该传感器是以玻碳电极为基底，中间层是功能化石墨烯和碳纳米管形成的3维网状结构的混合物，最外层为酶的修饰电极(图1)。然后在电化学工作站上测试传感器的分析性能1)在含有有机磷农药(2 μ M)的
O.05Μ、ρΗ=7. 4的磷酸盐PBS缓冲溶液中测试基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器的循环伏安曲线(图2)。其中，测试操作电压为-1.0 1.(^，扫描速率为501^/8。2)在最佳测试条件下，在O. 05Μ、ρΗ=7. 4的磷酸盐PBS缓冲溶液中依次加入4mM有机磷农药溶液测试生物传感器的电流-时间曲线(图3)。其中，酶电极电位为O. 5v。实施例2
I)功能化石墨烯GO-PEG的制备200mg氧化石墨GO加入到IOmlDMF中，在70kHz超声处理3小时，得到稳定的G0/DMF分散液。再将40mlS0Cl2加入到该分散液中，在80°C温度下，回流反应48小时，蒸馏除去多余的S0C12。然后将2gPEG600加入到反应物中，在120°C温度下，回流反应72小时，用乙醇、水洗至中性，真空60°C干燥，得到功能化石墨烯G0-PEG。(2)将O. 5g碳纳米管和强氧化性酸IOOmL混合，在120kHz超声波下处理5小时，然后加热到120°C，搅拌并回流反应72小时，经去离子水稀释洗涤微孔滤膜抽滤，至滤液为中性，在60°C温度下真空干燥48小时，得到羧基化的碳纳米管。(3)生物传感器的制备
a.玻碳电极的预处理首先将玻碳电极(Φ=3ι πι)用金相砂纸抛光,再依次用1. Ομπι和O. 3 μ m和O. 05 μ m的Al2O3悬浮液在麂皮上抛光至镜面，最后分别用1:1的HNO3溶液、无水乙醇和二次蒸馏水超声清洗干净，备用。b.修饰玻碳电极的制备将预处理好的玻碳电极在步骤(I)得到的O. 05M功能化石墨烯分散液中浸泡30分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的功能化石墨烯；再在碳纳米管分散液中浸泡30分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的碳纳米管，如此反复2次，氮气气氛中，自然晾干。然后再滴涂乙酰胆碱酯酶的5%壳聚糖分散液I μ L，将乙酰胆碱酯酶固定在电极上，得到基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器，置于O. 10 mol/L PBS中于4°C保存备用。该传感器是以玻碳电极为基底，中间层是功能化石墨烯和碳纳米管形成的3维网状结构的混合物，最外层为酶的修饰电极。实施例3
I)功能化石墨烯GO-PEG的制备200mg氧化石墨GO加入到IOmlDMF中，在70kHz超声波处理3小时，得到稳定的G0/DMF分散液。再将40mlS0Cl2加入到该分散液中，在80°C温度下，回流反应48小时，蒸馏除去多余的S0C·12。然后将2gPEG1000加入到反应物中，在120°C温度下，回流反应72小时，用乙醇、水洗至中性，真空60°C干燥，得到功能化石墨烯G0-PEG。(2)将O. 5g碳纳米管和强氧化性酸IOOmL混合，在120kHz超声波下处理5小时，然后加热到120°C，搅拌并回流反应72小时，经去离子水稀释洗涤微孔滤膜抽滤，至滤液为中性，在60°C温度下真空干燥48小时，得到羧基化的碳纳米管。(3)生物传感器的制备
a.玻碳电极的预处理首先将玻碳电极(Φ=3ι πι)用金相砂纸抛光,再依次用1. Ομπι和O. 3 μ m和O. 05 μ m的Al2O3悬浮液在麂皮上抛光至镜面，最后分别用1:1的HNO3溶液、无水乙醇和二次蒸馏水超声清洗干净，备用。b.修饰玻碳电极的制备将预处理好的玻碳电极在步骤(I)得到的O. 05M功能化石墨烯分散液中浸泡30分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的功能化石墨烯；再在碳纳米管分散液中浸泡30分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的碳纳米管，如此反复2次，氮气气氛中，自然晾干。然后再在乙酰胆碱酯酶的5%壳聚糖分散液中4°C下浸泡12小时，将乙酰胆碱酯酶固定在电极上，得到基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器，置于O. 10 mol/L PBS中于4°C保存备用。该传感器是以玻碳电极为基底，中间层是功能化石墨烯和碳纳米管形成的3维网状结构的混合物，最外层为酶的修饰电极。实施例4
I)功能化石墨烯GO-PEG的制备200mg氧化石墨GO加入到IOmlDMF中，在70kHz超声处理3小时，得到稳定的G0/DMF分散液。再将40mlS0Cl2加入到该分散液中，在80°C温度下，回流反应48小时，蒸馏除去多余的S0C12。然后将2gPEG2000加入到反应物中，在120°C温度下，回流反应96小时，用乙醇、水洗至中性，真空60°C干燥，得到功能化石墨烯G0-PEG。(2)将O. 5g碳纳米管和强氧化性酸IOOmL混合，在120kHz超声波下处理5小时，然后加热到120°C，搅拌并回流反应72小时，经去离子水稀释洗涤微孔滤膜抽滤，至滤液为中性，在60°C温度下真空干燥48小时，得到羧基化的碳纳米管。(3)生物传感器的制备
a.玻碳电极的预处理首先将玻碳电极(Φ=3ι πι)用金相砂纸抛光,再依次用1. Ομπι和O. 3 μ m和O. 05 μ m的Al2O3悬浮液在麂皮上抛光至镜面，最后分别用1:1的HNO3溶液、无水乙醇和二次蒸馏水超声清洗干净，备用。b.修饰玻碳电极的制备将预处理好的玻碳电极在步骤(I)得到的O. 05M功能化石墨烯分散液中浸泡30分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的功能化石墨烯；再在碳纳米管分散液中浸泡30分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的碳纳米管，如此反复5次，氮气气氛中，自然晾干。然后再分别滴涂I μ 15%戊二醛、8 4 1^乙酰胆碱酯酶、I μ L牛血清白蛋白(5mg/mL)，于室温下交联反应30min，将乙酰胆碱酯酶固定在电极上，得到基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器，置于O. 10 mol/L PBS中于4°C保存备用。该传感器是以玻碳电极为基底，中间层是功能化石墨烯和碳纳米管形成的3维网状结构的混合物，最外层为酶的修饰 电极。
权利要求
1.一种基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器的制备方法，其特征在于具体步骤如下 (1)功能化石墨烯GO-PEG的制备200mg氧化石墨GO加入到IOmlDMF中，在50 120kHz超声(表述有误)处理I 5小时，得到G0/DMF分散液；再将40mlS0Cl2加入到该G0/DMF分散液中，在6(T80°C温度下，回流反应24 48小时，蒸馏除去多余的SOCl2 ;然后将2g聚乙二醇PEG加入到反应物中，在12(Tl50°C温度下，回流反应72 96小时，用乙醇、水交替洗至中性，真空干燥，得到功能化石墨烯GO-PEG ； (2)将0.5g 2g碳纳米管和强氧化性酸100 500mL混合，在50 120kHz超声或IOOr/mirTlO6 r/min的离心速度搅拌下处理I 80小时,然后加热到20 120°C,搅拌并回流反应I 80小时，经去离子水稀释洗涤微孔滤膜抽滤，至滤液为中性，在25 200°C温度下真空干燥I 48小时，得到羧基化的碳纳米管； (3)生物传感器的制备 a.玻碳电极的预处理首先将玻碳电极用金相砂纸抛光，再依次用1.0 ii m、0. 3 ii m和0.05um的Al2O3悬浮液在麂皮上抛光至镜面，最后分别用体积比为1:1的HNO3溶液、无水乙醇和二次蒸馏水超声清洗干净，备用； b.修饰玻碳电极的制备将预处理好的玻碳电极在步骤(I)得到的0.05M功能化石墨烯中浸泡20-40分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的功能化石墨烯；再在步骤(2)得到的碳纳米管中浸泡20-40分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的碳纳米管，如此反复2-5次，在氮气气氛中，自然晾干；然后将乙酰胆碱酯酶固定在玻碳电极上，得到基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器，置于0. 10 mo I/L PBS中于4°C保存备用。
2.根据权利要求1所述的基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器的制备方法，其特征是步骤(I)中所述石墨烯是指单层石墨片、多层石墨片或它们的混合物中任一种。
3.根据权利要求1所述的基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器的制备方法，其特征是步骤(I)中所述聚乙二醇PEG分子量为200、400、600、1000、2000或4000中的任一种。
4.根据权利要求1所述的基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器的制备方法，其特征是步骤(2)中所述碳纳米管包括化学气相沉积法、电弧放电法、太阳能法、模板法或激光蒸发法中的任一种制备的单壁或多壁碳纳米管或其以任意比例混合的混合物。
5.根据权利要求1所述的基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器的制备方法，其特征是步骤(3)中所述功能化石墨烯和碳纳米管的吸附层数为1、2、3、4或5中的任一种。
6.根据权利要求1所述的基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器的制备方法，其特征是步骤(3)中所述乙酰胆碱酯酶为家蝇、果蝇、电鳗动物或植物中的任一种。
7.根据权利要求1所述的基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器的制备方法，其特征是步骤(3)中所述乙酰胆碱酯酶的固定方法为吸附法、包埋法、共价键合法、交联法或电聚合法中的任一种。
8.根据权利要求1所述的基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器的制备方法，其特征是强氧化性酸是0.1 60%重量酸浓度硝酸、5 100%重量酸浓度硫酸、I / 100 50 / I摩尔比高锰酸钾和硫酸混合溶液、I / 100 50 / I摩尔比硝酸和硫酸混合溶液、I / 100 50 / I摩尔比高锰酸钾和硝酸混合溶液、I / 100 50 / I摩尔比过氧化氢和硫酸混合液、I / 100 50 / I摩尔比过氧化氢和盐酸混合液或I / 100 50 / I摩尔比过氧化氢和硝酸混合液中任一种或其多种组合。
全文摘要
本发明涉及一种基于石墨烯/碳纳米管的生物传感器的制备方法，属于材料制备技术领域。本发明主要是用聚乙二醇功能化修饰石墨烯改善其分散性，再将其与羧基化的碳纳米管联用，形成三维网络结构，修饰到玻碳电极上，再将乙酰胆碱酯酶固定在电极上，用于有机磷的快速电化学测定。碳纳米管起到了“分子导线”的作用，可将电子传递到酶的氧化还原中心，大大提高响应速度。本发明制备的纳米复合材料生物相容性好，利于生物酶的固定且制备方法成本低，简单快捷。本发明制作的生物传感器灵敏度高，稳定性好，可进行大量样品的现场快速定量检测，广泛应用于环境监测方面。
文档编号G01N27/403GK103048372SQ20121054496
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者邱军, 王珊珊 申请人:同济大学