专利名称：以非致癌物蒽为标准对苯并(a)芘定量的方法
技术领域：
本发明涉及一种苯并(a)芘的检测方法，尤其是涉及一种以非致癌物蒽为标准溶液实现苯并(a)芘的定量检测方法。
背景技术：
多环芳烃主要是煤炭、木材、脂肪等物质不完全燃烧时的产物，是最早被发现和研究的致癌类化合物之一，迄今为止，已发现的致癌性多环芳烃及其衍生物已达400多种。其中苯并(a)芘污染最广，含量最多，致癌作用最强，是已发现的200多种多环芳烃中最主要的环境和食品污染物，且与其它多环芳烃有一定的相关性，被作为环境和食品受多环芳烃污染的指标和代表。流行病学研究表明，苯并(a)芘可通过呼吸道、消化道、皮肤等被人体吸收，对机体各器官产生致癌作用，有诱发肺癌、直肠癌、胃癌、皮肤癌、膀胱癌等致癌作用。 此外，苯并(a)芘还具有致畸性和致突变性。怀孕妇女长期暴露于多环芳烃污染的环境中， 会影响胎儿的神经发育，造成新生婴儿的体重明显降低，小鼠实验也证实多环芳烃能够影响牙齿的发育。长期呼吸含苯并(a)芘的空气，饮食或食用苯并(a)芘污染的水和食物，不仅会造成慢性中毒，还会导致癌变的发生。在实际样品分析中，标准加入法通过向样品测定液中连续加入待测组分的标准溶液，可以克服样品的基体效应，获得准确的定量结果。但是，在样品分析时，常常使用到待测组分的标准物。对于长期从事苯并(a)芘等多环芳烃分析研究的科研人员，这无疑增加了接触苯并(a)芘的机率，对相关人员的健康带来潜在的威胁。因此，迫切需要建立一种无需苯并(a)芘标准物质即可定量分析苯并(a)芘的检测方法，且这种代替物必须是常见的、非致癌的化合物。代替物应具备以下特点1)是不致癌的；2)是苯并(a)芘的同系物，它应当和苯并(a)芘有尽可能一致的光谱行为和响应特征；幻代替物的光谱出峰位置最好在苯并 (a)芘的附近，这可保证代替物与苯并(a)芘具有类似的基体效应，而所产生的基体效应干扰可通过采用连续标准加入法的方式加以克服；4)通过选用合适的光谱分析方法，可实现代替物与苯并(a)芘的光谱分离。张伟等(张伟，周娜，李呐，谢永生，骆和东，李耀群，低温恒能量同步荧光法同时快速检测食品中多种多环芳烃，光谱学与光谱分析，2009，29 (10)，2806-2809)报道了有关低温恒能量同步荧光法同时快速检测食品中多种多环芳烃。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以非致癌物蒽为标准对苯并(a)芘定量的方法。本发明包括以下步骤1) 一个获取样品中苯并(a)芘和蒽信号分离的光谱的步骤；2) 一个获取蒽标准加入法光谱的步骤；3) 一个绘制工作曲线的步骤；4) 一个读取苯并(a)芘的信号强度的步骤；
5) 一个计算样品中苯并(a)芘的浓度的步骤。在步骤1)中，所述获取样品中苯并(a)芘和蒽信号分离的光谱的具体方法如下 使用二阶导数恒能量同步荧光法扫描样品，或采用一阶导数非线性可变角同步荧光法扫描样品溶液，获取相应的苯并(a)芘和蒽信号分离的光谱。在步骤2、中，所述获取蒽标准加入法光谱的具体方法如下配制一系列蒽标准溶液，在步骤1)所述样品中连续添加蒽标准溶液，绘制光谱。在步骤3)中，所述绘制工作曲线的具体方法如下读取蒽的光谱信号强度，以光谱信号强度对步骤2、所述添加蒽的浓度绘制工作曲线。在步骤5)中，所述计算样品中苯并(a)芘的浓度具体方法如下首先根据蒽和苯并(a)芘的标准溶液的工作曲线的斜率值计算相对校正因子以及苯并(a)芘定量公式，然后将相对校正因子、步骤3)所述工作曲线的斜率以及步骤4)所述苯并(a)芘的信号强度代入苯并(a)芘定量公式计算得苯并(a)芘的浓度；所述相对校正因子计算公式为
f ksf =—^
kr其中ks和&分别为蒽和苯并(a)芘的标准溶液的工作曲线的斜率值；所述苯并(a)芘定量公式为
Γ πf XFC=-
k其中，c是苯并(a)芘待测浓度，f是相对校正因子，F是苯并(a)芘荧光强度，k 是蒽标准加入法工作曲线的斜率。本发明结合内标法和标准加入法的特点，提出一种无需苯并(a)芘标准溶液的定量检测方法实现样品中苯并(a)芘的定量分析，以无致癌性的物质蒽代替苯并(a)芘做标准溶液，通过相对校正因子进行校正，测得实际样品中苯并(a)芘的含量，该方法快速简便，有效地减少了检测人员接触强致癌物苯并(a)芘的机率，由此降低了相应的健康风险。本发明选择苯并(a)芘的同系物且不致癌的蒽作为代替物实现苯并(a)芘的定量。本发明基于标准加入法，提供了一种新颖的定量检测方法首先获得苯并(a)芘和标准物蒽的分离的光谱，然后通过苯并(a)芘和蒽的标准溶液绘制工作曲线，计算得相对校正因子以及苯并(a)芘的定量公式。在实际样品分析中，向样品中连续添加蒽的标准溶液，通过相对校正因子、苯并(a)芘信号强度及蒽工作曲线斜率计算得样品中苯并(a)芘的含量。以往的检测方法需使用苯并(a)芘标准溶液配制工作曲线，本定量检测方法无需使用苯并(a)芘标准溶液可实现苯并(a)芘的定量分析。本方法有效地减少了检测人员接触强致癌物苯并(a)芘的机率，降低了相应的健康风险，具有重要的应用价值。且本方法光谱获得时间短，仅需lmin，快速简便，无需贵重仪器如高效液相色谱仪、气相色谱仪和质谱仪等昂贵设备，价格低廉。
图1是人工合成样品的恒能量同步荧光光谱。在图1中，横坐标为激发波长(nm)， 纵坐标为荧光强度；虚线是样品光谱，曲线1，2，3表示添加蒽标准溶液浓度分别是10，20和30ng/mLo图2是人工合成样品中蒽荧光强度对添加浓度绘制工作曲线。在图2中，横坐标为浓度(μ g/L)，纵坐标为荧光强度；Y = 0. 56+1. 89X，R = O. 99998。图3是人工合成样品的二阶导数恒能量同步荧光光谱。在图3中，横坐标为激发波长(nm)，纵坐标为荧光强度；虚线是样品光谱，曲线1，2，3添加蒽标准溶液浓度分别是10， 20 禾Π 30ng/mL。图4是食用油样品的一阶导数非线性可变角同步荧光光谱。在图4中，横坐标为测定序列，纵坐标为荧光强度。图5是在食用油样品中添加10 30ng/mL蒽标准溶液的一阶导数非线性可变角同步荧光光谱。在图5中，横坐标为测定序列，纵坐标为荧光强度；虚线是食用油样品光谱， 曲线1，2，3添加蒽标准溶液浓度分别是10，20和30ng/mL。图6是在苯并(a)芘溶液中(5. Ong/mL)连续添加蒽标准溶液光谱图。在图6中， 横坐标为测定序列，纵坐标为荧光强度；曲线1，2，3，4，5，6添加蒽标准溶液浓度分别是5， 15，30，45，75，110ng/mL。
具体实施例方式以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。相对校正因子的计算分别配制一系列浓度的苯并(a)芘和蒽标准溶液，绘制相应的光谱强度。然后以
信号强度对浓度分别绘制相应的工作曲线，按公式f =^ (ks和&分别是蒽标准溶液的工
作曲线斜率值和苯并(a)芘工作曲线斜率值)计算得苯并(a)芘的相对校正因子f。在相同的实验条件下，相对校正因子只需计算一次，可用于不同的样品中苯并(a)芘的定量计
笪弁。根据上述步骤可计算得一阶导数非线性可变角同步荧光光谱中苯并(a)芘的校正因子为0.110，恒能量同步荧光法中苯并(a)芘的校正因子为0.050，而二阶导数恒能量同步荧光法中苯并(a)芘的校正因子为0.040。实施例1 人工合成样品中苯并(a)芘的检测移取适量含1. Ong/mL苯并(a)芘的溶液于荧光仪上测量恒能量同步荧光光谱，能量差700CHT1，然后向测定溶液中连续添加10、20、30ng/mL的蒽标准溶液，绘制同步荧光光谱(如图1示)。读取蒽在374nm处的荧光强度，以强度对加标浓度绘制工作曲线，得斜率 (如图2示)。读取苯并(a)芘在392nm处荧光强度38. 9，将斜率1.89、荧光强度38. 9及相对校正因子0. 050代入本发明提出的定量公式计算得苯并(a)芘的浓度为1. 03ng/mL，与参考值(1. 00ng/mL) 一致。加置二阶导数功能，可获得上述样品的二阶导数恒能量同步荧光光谱(如图3 示)，读取蒽在373nm处的荧光强度，以蒽荧光强度对其加标浓度绘制工作曲线，得斜率值 4. 18。读取苯并(a)芘在400. 5nm处的荧光强度106. 3，将斜率4. 18、荧光强度106. 3及相对校正因子0. 040代入本发明提出的定量公式计算得苯并(a)芘的浓度为1. 02ng/mL，与参考值(1. 00ng/mL) 一致。
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实施例2 食用油中苯并(a)芘的检测称取0. 5g调和油样品于25mL的血清瓶中，加入4mL 二甲基亚砜溶剂，59KHz，250W 的超声条件下萃取6min，取出静置分层，分离出的上层油层在同样条件下再萃取一次，收集两次的二甲基亚砜萃取液作为待测液。移取2mL溶液至荧光光度计的常规石英荧光样品池，进行一阶导数非线性可变角同步荧光光谱的绘制(如图4所示)。然后在样品测定液中连续添加10、20、30ng/mL蒽的标准溶液，绘制同步荧光光谱(如图5所示)。读取蒽的荧光强度，以强度对浓度绘制工作曲线，得斜率为37. 98。读取苯并(a)芘荧光强度为180. 3，将斜率值、苯并(a)芘荧光强度和相对校正因子0. 110代入本发明提出的定量公式计算得苯并(a)芘的浓度为0. 53ng/mL，换算为食用油中含量为8. 36ng/g。实施例3 16种多环芳烃溶液中苯并(a)芘的检测移取2mL含16种多环芳烃的混合溶液绘制一阶导数非线性可变角同步荧光光谱， 然后在样品测定液中连续添加5、15、30、45、75、110ng/mL蒽的标准溶液，绘制一阶层数非线性可变角同步荧光光谱(如图6示)。读取蒽的荧光强度，以强度对浓度绘制工作曲线，得斜率为14. 01。读取苯并(a)芘荧光强度为566. 2，将斜率、荧光强度及相对校正因子0. 110 代入本发明提出的定量公式计算得苯并(a)芘的浓度为4.46ng/mL，与参考值(4. 5ng/mL) 一致。实施例4 茶叶中苯并(a)芘的检测茶叶样品在萃取前使用搅拌机将茶叶研成粉末，然后称取0. 5-1. 0克样品于玻璃容器中，加入15mL 二甲亚砜，混合均勻，置于家用微波炉中萃�。in，微波辅助萃取功率 140ffo萃取完毕后静置冷却至室温，萃取液用玻璃纤维过滤入分液漏斗中，加入30mL 2%硫酸钠溶液，混合均勻后用20mL正已烷分两次提取，每次10mL。合并正己烷提取液，旋转蒸发至干，定容于5mL 二甲亚砜中。移取2mL样品绘制一阶导数非线性可变角同步荧光光谱，然后在样品测定液中连续添加蒽的标准溶液，绘制同步荧光光谱。读取蒽的荧光强度，以强度对浓度绘制工作曲线，得斜率为4. 38。读取苯并(a)芘荧光强度为31. 7，将斜率、荧光强度及相对校正因子 0. 110代入本发明提出的定量公式计算得测定液中苯并(a)芘的浓度为0. 80ng/mL，与使用苯并(a)芘标准液定量结果(0. 78ng/mL)接近。实施例5 牛奶中苯并(a)芘的检测移取l.Og添加苯并(a)芘标准溶液的牛奶样品，加入6mL的正己烷，超声萃取 8min，移取正己烷层，重复萃取牛奶层一次，收集正己烷层，旋转蒸发至全干，二甲亚砜定容 2mL，得待测液。将2mL待测液至荧光光度计的常规石英荧光样品池，进行一阶导数非线性可变角同步荧光光谱的绘制，读取苯并(a)芘荧光强度。然后在样品测定液中连续添加蒽的标准溶液，绘制同步荧光光谱。读取蒽的荧光强度，以强度对浓度绘制工作曲线。将苯并 (a)芘荧光强度、工作曲线斜率和相对校正因子0. 110代入本发明提出的定量公式计算得苯并(a)芘的浓度为1. Mng/g，与真实值1. 50ng/g接近。
权利要求
1.以非致癌物蒽为标准对苯并(a)芘定量的方法，其特征在于包括以下步骤1)一个获取样品中苯并(a)芘和蒽信号分离的光谱的步骤；2)一个获取蒽标准加入法光谱的步骤；3)一个绘制工作曲线的步骤；4)一个读取苯并(a)芘的信号强度的步骤；5)一个计算样品中苯并(a)芘的浓度的步骤。
2.如权利要求1所述的以非致癌物蒽为标准对苯并(a)芘定量的方法，其特征在于在步骤1)中，所述获取样品中苯并(a)芘和蒽信号分离的光谱的具体方法如下使用二阶导数恒能量同步荧光法扫描样品，或采用一阶导数非线性可变角同步荧光法扫描样品溶液， 获取相应的苯并(a)芘和蒽信号分离的光谱。
3.如权利要求1所述的以非致癌物蒽为标准对苯并(a)芘定量的方法，其特征在于在步骤2)中，所述获取蒽标准加入法光谱的具体方法如下配制一系列蒽标准溶液，在步骤 1)所述样品中连续添加蒽标准溶液，绘制光谱。
4.如权利要求1所述的以非致癌物蒽为标准对苯并(a)芘定量的方法，其特征在于在步骤幻中，所述绘制工作曲线的具体方法如下读取蒽的光谱信号强度，以光谱信号强度对步骤2)所述添加蒽的浓度绘制工作曲线。
5.如权利要求1所述的以非致癌物蒽为标准对苯并(a)芘定量的方法，其特征在于在步骤5)中，所述计算样品中苯并(a)芘的浓度具体方法如下首先根据蒽和苯并(a)芘的标准溶液的工作曲线的斜率值计算相对校正因子以及苯并(a)芘定量公式，然后将相对校正因子、步骤3)所述工作曲线的斜率以及步骤4)所述苯并(a)芘的信号强度代入苯并(a) 芘定量公式计算得苯并(a)芘的浓度。
6.如权利要求5所述的以非致癌物蒽为标准对苯并(a)芘定量的方法，其特征在于在步骤5)中，所述相对校正因子计算公式为f=A kr其中分别为蒽和苯并(a)芘的标准溶液的工作曲线的斜率值。
7.如权利要求5所述的以非致癌物蒽为标准对苯并(a)芘定量的方法，其特征在于在步骤5)中，所述苯并(a)芘定量公式为f xFc =-k其中，C是苯并(a)芘待测浓度，f是相对校正因子，F是苯并(a)芘荧光强度，k是蒽标准加入法工作曲线的斜率。
全文摘要
以非致癌物蒽为标准对苯并(a)芘定量的方法，涉及一种苯并(a)芘的检测方法。一个获取样品中苯并(a)芘和蒽信号分离的光谱的步骤；一个获取蒽标准加入法光谱的步骤；一个绘制工作曲线的步骤；一个读取苯并(a)芘的信号强度的步骤；一个计算样品中苯并(a)芘的浓度的步骤；无需使用苯并(a)芘标准溶液可实现苯并(a)芘的定量分析。有效地减少检测人员接触强致癌物苯并(a)芘的机率，降低相应的健康风险，具有重要的应用价值。且光谱获得时间短，仅需1min，快速简便，无需贵重仪器如高效液相色谱仪、气相色谱仪和质谱仪等昂贵设备，价格低廉。
文档编号G01N21/64GK102393389SQ20111032652
公开日2012年3月28日 申请日期2011年10月24日 优先权日2011年10月24日
发明者付东赛, 吴平平, 李秀英, 李耀群, 林丽容 申请人:厦门大学
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