专利名称：一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因及其用途。
背景技术：
包虫病(Hydatid Disease)又称为棘球蚴病(Echinococcosis)，是棘球绦虫的中绦期幼虫寄生于人体和动物所引起的疾�。且恢盅现匚：θ诵蠼】档娜耸薰不技纳娌�。棘球绦虫种类较多，能感染人类的棘球属绦虫有4种细粒棘球绦虫 (Echinococcus granulosus, Eg)、多房棘球会条虫(Echinococcus multilocularis, Em) > 少节棘球绦虫(Echinococcus oligarthrus)禾口伏氏棘球绦虫(Echinococcus vogeli)。 这4种棘球绦虫可引起不同类型的棘球蚴病。我国存在两种棘球蚴�。聪噶＜蝌什� (echinococcosis granulosa)，又禾尔囊型包虫病(cystic echinococcosis, CE)禾口多房棘球蝴病(echinococcosis multilocularis),又禾尔泡型包虫病(alveolar echinococcosis, AE)。包虫病是一个重要的世界性公共卫生问题，广泛流行于欧、亚、非和地中海区域沿岸国家，以及澳洲和南美。在我国，包虫病主要流行于西部的农牧区，其中新疆、青海、甘肃、 宁夏、西藏、内蒙和四川西部最为严重，是世界上包虫病的高流行区。此外，吉林、陕西、云南、贵州和河南等省局部地区也有小范围流行，我国流行区受威胁人口约7000万。卫生部 《全国人体重要寄生虫病现状调查》报告显示，内蒙古、吉林、河南、四川、贵州、云南、陕西、 甘肃、青海、宁夏、新疆、西藏等12省(区)包虫病患病率为1.084%，据此推算，目前流行区约有病人38万人。由于B超诊断结果有一定的漏检率，实际患病病人数可能达60万人以上。血清学检查发现人群的感染率平均为11. 98%，感染人数约为700万人。包虫病不但给患者带来极大的痛苦和沉重的经济负担，且发病的高峰为20-50岁的青壮年，给社会带来极大的压力，系西部农牧区群众因病致贫，因病返贫的重要原因。此外，由于包虫病在牛羊的感染率相当高(可达90%)，每年因包虫病也给我国畜产品造成的经济损失达数十亿。因此包虫病不但严重�：θ嗣竦纳】担已现赜跋焐缁岷途梅⒄�、边疆稳定。在政府的重视下，包虫病的防治工作正在全面开展，为满足包虫病诊断和现场流行病学调查的需要，研制合适的包虫病检测方法是当务之急。囊型包虫病的诊断主要依据流行病学史、临床表现、影像学检查、病原学检查和免疫学检测。目前对囊型包虫病的诊断极大地依赖影像学方法，如X光检查、B型超声检查、 CT扫描、核磁共振等物理诊断方法。虽然影像学技术已广泛应用，且能对包块损害的部位、 大小和物理性状等做出较为明确的判断，但不能进行早期诊断(影像学诊断出的囊型包虫病人大都已不太适合药物治疗)，且不易与一些囊肿、脓肿或肿块相鉴别。由于影像检查设备携带不便，加之昂贵，且对操作人员的技术要求较高，在疾病诊断与流行病学调查中(特别在边远地区连电力供应都受到限制)的应用受到限制。免疫学检测方法具有敏感特异的特点，且可用于早期诊断，在各种疾病诊断中得到广泛应用，在囊型包虫病诊断中的应用也受到高度重视，国内外对其研究也不断深入，而研究的重点在于获得合适的抗原以提高诊断产品的性能。棘球蚴病免疫诊断抗原的研究经历了粗抗原、纯化抗原和重组抗原三个阶段。总的来说，粗抗原的诊断敏感性高，但是特异性较低；纯化抗原在粗抗原的基础上提高了诊断的特异性，但是敏感性有所降低；而重组抗原的特异性较高，且易于标准化，但目前公认具诊断价值的重组Ag5和AgB与其他寄生虫的相关分子具有共同表位，存在交叉反应，且高比例的囊型包虫病患者血清学反应为阴性，不能满足诊断的需要。因此，进一步开展对细粒棘球绦虫抗原的筛选研究，寻找具有更高敏感性和特异性的抗原组分，提高对囊型包虫病的诊断效率，是当前棘球蚴病免疫诊断研究的一项重要内容。构建cDNA文库并对其进行免疫筛选是获得新抗原基因的一个重要方法。将某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，并将其引入到相应的宿主细胞中(一般为E. coli)繁殖和扩增，理论上此群体就包含有该物种的全部 mRNA信息，称该生物基因组的cDNA文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。cDNA文库的构建主要包括mRNA的获得、cDNA第一链的合成、cDNA第二链的合成、 双链cDNA的克隆和包装。cDNA文库的筛选方法主要有1.核酸杂交是最常用，最可靠的方法之一，可大规模地分析文库的克隆子。所用的探针主要有1)同源探针至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列。常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆。2)部分同源探针探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同。常用于克隆家族基因。3)总cDNA探针通过反转录酶均勻掺入放射性核苷酸或通过总的或分级分离得到的poly (A) +mRNA进行末端标记而获得cDNA探针。4) cDNA扣除探针从第一种mRNA制备cDNA探针，连续多次与20倍过量的第二种 mRNA杂交；回收未杂交的cDNA探针，再与100倍过量的第一种mRNA杂交，使得原mRNA中的一些特异序列得到高度富集。主要用于探测cDNA文库中与调节水平有所差别的mRNA克隆。5)合成寡核苷酸探针。2.特异性免疫学检测在cDNA表达文库中，目的基因的表达产物能与特异性抗体发生免疫学反应，通过酶学的方法加以检测3. cDNA克隆的同胞检测
将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的亚cDNA文库，对每组亚cDNA文库进行检测，当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测，直到获得阳性单克隆。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因及其用途，所述的这种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因及其用途要解决现有技术中诊断细粒棘球蚴病的效果不佳， 不能进行早期诊断的技术问题。本发明提供了一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因(本发明命名为扎)，其碱基序列如SEQ ID NO :1所示，或者其碱基序列与SEQ ID NO :3中从357-1069位的核苷酸具有66% 以上的同源性。本发明还提供了上述的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因编码的蛋白质。进一步的，上述的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，或者其部分序列与SEQ ID NO :4所示的4-350位氨基酸序列相同。本发明还提供了一种表达载体，含有上述的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因。本发明还提供了一种融合蛋白，它含有上述的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因所编码的蛋白。本发明还提供了一种宿主细胞，由上述的表达载体转化或者转导。本发明还提供了一种抗体，其能与上述的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因编码的蛋白质特异性结合。本发明还提供了上述的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因编码的蛋白质在制备用于免疫囊型包虫病的疫苗中的应用。本发明还提供了上述的一种表达载体在制备用于诊断囊型包虫病的诊断试剂中的应用。本发明还提供了上述的一种融合蛋白在制备用于诊断囊型包虫病的诊断试剂中的应用。本发明还提供了上述的一种抗体在制备用于诊断囊型包虫病的诊断试剂中的应用。本发明所使用的细粒棘球绦虫原头节(Echinococcus granulosus protoscolex)，采自新疆患囊型包虫病的绵羊。细粒棘球蚴cDNA文库的构建首先离心分离得到细粒棘球绦虫原头节，提取总RNA，纯化得到mRNA ；然后合成cDNA第一链；合成cDNA 第二链；将双链cDNA连接到λ ZAP-II载体中，而后包装到λ ZAP-II噬菌体中。构建cDNA 文库的库容量为1. 8X 105pfu/mL。本发明每次用10名囊型包虫病患者混合血清对细粒棘球绦虫cDNA文库进行免疫筛�。竦昧撕邢噶＜蝌驶虻难粜允删撸删呓猩境坊鼓康幕蛄釉诨坊罞. coli SOLR菌株内的I^bluescript SK-载体上，并将重组载体送生物公司测序， 获得目的基因的序列。本发明获得的目的基因长度为1436bp，编码369个氨基酸的蛋白，所编码细粒棘球绦虫钙网织蛋白的分子量约为47232道尔顿。将目的基因的序列在NCBI中进行Blastn比对分析，发现它与其同源性最高的核苷酸为人钙网织蛋白mRNA(如SEQ ID N0:3所示)， 进行Blastx比对分析发现与其编码蛋白同源性最高的蛋白为细粒棘球绦虫钙网织蛋白 (如 SEQ ID NO 4 所示)。本发明提取包含目的基因的I^bluescript SK-载体，根据目的基因的序列，选择合适的核酸内切酶(EcoRI和BioI)将目的基因从I^bluescript SK-载体中切下，用同样的内切酶酶切表达载体PPGEX-4T-1，将酶切产物同时进行1. 2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下将目的片段切下，纯化，将目的基因和表达载体的纯化产物连接，转化E. coli Dffia细胞，挑取单菌落测序检测连接成功与否，将连接成功的重组载体从E. coli Dffia细胞中提取出来， 转化E. coli BL21(DE3)细胞，表达、纯化重组蛋白。本发明获得的重组蛋白可以用于囊型包虫病患者的免疫诊断，用该重组蛋白包板，用ELISA方法检测囊型包虫病、泡型包虫病、囊虫病、其它寄生虫病患者以及健康人血清，获得的敏感性和特异性分别为80. 46% (70/87) ^P 90. 28% (130/144)，目前诊断囊型包虫病效果最佳的天然纯化抗原B的诊断敏感性和特异性分别为86. 81% (79/91)和 73. 07% (95/130)，两者的敏感性和特异性均没有显著性差异(P > 0. 05)。
图1为cDNA文库在NZY培养基上形成的噬菌斑。图2为本发明的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因在NCBI上进行Blastn同源性分析，与同源性最高的基因序列比对图。图3为本发明的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因在NCBI上进行Blastx同源性分析，与同源性最高的氨基酸序列比对图。图4为本发明的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因编码蛋白的二级结构分析图。图5为本发明的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因编码蛋白的结构域分析图。图6为Pbluescript SK-/H4基因重组质�：蚿GEX_4T_l表达载体酶切鉴定图， 其中M:DNA分子量标准；1 酶切下来的目的片段H4&I^bluesCript SK-载体；2 酶切后的 PGEX-4T-1 载体。图7为I^bluescript SK-/H4重组质�：蚿GEX_4T_l表达载体纯化后的琼脂糖凝胶电泳图，其中M =DNA分子量标准；；1 酶切下来的目的片段H4 ；2 酶切后的pGEX-4T-l载体。图8为本发明的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因在E. coli BL21 (DE3)细胞中诱导表达后进行的的10% SDS-PAGE图，其中M 标准蛋白分子量；1 未诱导的pGEX_4T_l 空质粒；2 经IPTG诱导的pGEX-4T-l空质粒；3 未诱导的pGEX-4T_l/H4 ；4 经IPTG诱导的pGEX-4T-l/H4 ；5 :pGEX-4T_l/H4表达克隆菌体裂解上清；6 :pGEX-4T_l/H4表达克隆菌体裂解沉淀；7 菌体裂解上清经Glutathione Sepharose 4B树脂吸附后的流出液；8_11 纯化柱洗脱液。
具体实施例方式下面结合具体实例，进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1细粒棘球蚴cDNA文库的构建1.总RNA的分离和mRNA的纯化取约lmL-80 °C冻存的细粒棘球绦虫原头节，用Trizol法提取总RNA，用 GEHealthcare 公司的 quickpi^p mRNA Purification Kit 纯化 mRNA。2.cDNA 合成(1)合成cDNA的第一链在一个无RNA的1. 5mLependorf中，加入如下反应体系IOXfirst strand buffer5μ L甲基化 dNTP3μ LLinker-primer (1. 4 μ g/ μ L)2 μ LDETP-treated water14 μ LRnase Block RibonucleaseInhibitor (40U/ μ L)1 μ LmRNA 样品(5 μ g)22 μ L------------------------------------------------------47 μ L混合反应物，在室温中静置lOmin，允许引物与模板退火，然后加入 3 μ LAccu-Script-RT,使总体积达到50 μ L，轻轻混勻，稍离心，然后在42°C温育lh，Ih后将反应物从42°C转移到冰上。(2)合成 cDNA 第二链将下列试剂加入第一链合成的反应管IOXSecond strand buffer20 μ LSecond strand dNTP mixture6 μ L灭菌双蒸水114 μ LRNase H(l. 5U/μ L)2 μ LDNA Polymerase I (9. OU/ μ L)IlyL----------------------------------------153 μ L轻轻混勻，稍离心，置于16°C水浴中培育2. 5h，2. 5h后，将反应物转入冰浴中。(3)平端化cDNA末端将23 μ L平端化的dNTP混合物以及2 μ Lpfu酶加入已经合成的cDNA双链中，混勻，稍离心，置于72°C水浴中(不超过30min)，然后移出反应物，加入200 μ L苯酚和氯仿混合物(1 1)，混勻，涡旋。室温下，15000rpm离心aiiin，将上层液转入一新的离心管中，然后加入同体积的氯仿，涡旋，再次在室温下15000rpm离心2min，然后将上层液移至一新的离心管中，加入下列试剂沉淀cDNA 3M 乙酸钠20mL无水乙醇400 μ L混勻，置于_20°C冰箱中过夜。将过夜的cDNA自冰箱中取出，4°C，15000rpm离心lh，弃上清，轻轻加入70%乙醇洗涤沉淀物(不摇晃)，常温下，15000rpm离心2min，弃上清，抽干沉淀(5-lOmin)，用9 μ L EcoRI ligase buffer重新溶解沉淀物，4°C培育至少30min。(4)连接 EcoRI 接头将下列试剂加至平端cDNA和连接头中IOXligase buffer1 μ LIOmM rATP1 μ LT4DNAligase(4U/μ L)1 μ L简单离心，8°C培育过夜。(5)磷酸化EcoRI末端将过夜的反应物于70°C水浴中放置30min，终止连接酶活性，简单离心，在室温中冷却反应物5min，然后向反应物中加入下列试剂IOXligase buffer1 μ LIOmM rATP2 μ L灭菌双蒸水5 μ LΤ4 Polynucleotidekinase (5U/ μ L)2 μ L在37°C水浴中温育30min，然后移至70°C加热30min，以灭活激酶。将反应物简单离心，置于室温中冷却5min。(6) Xho I 消化酶切在反应物中加入下列试剂XhoI buffer supplement28 μ LXhoI(40U/y L)3μ L37°C培育1. 5h，然后在反应管内加入下列试剂IOXSTE buffer5μ L无水乙醇125 μ L置于-20°C冰箱，过夜沉淀。3.对样品进行大小分级(1)将反应物从冰箱取出，4°C，15000rpm离心15min。弃上清，抽干沉淀，用14 μ L 1 X STE buffer重新溶解沉淀，加3. 5 μ L装柱燃料至样品中。(2)安装分离柱从ImL移液管的顶部移去塑料包装，用无菌的镊子小心地拔出移液管内的棉塞， 使管内剩余棉塞3_4mm，用无菌的剪刀减去拔出的部分。用洗耳球将管内的3-4mm棉塞推至管的尖部。剪下一段约8mm长的连接管，用其将ImL的移液管和IOmL的注射器针筒连接起来，移液管和针筒间不能有空隙，抽出筒芯，使针筒成为滴柱的贮液库。然后用架子固定滴柱。(3)加样装柱前，通过颠倒kpharose CL-2B凝胶过滤介质，使树脂混勻，将2mL的移液管插入针筒，加入IXSTE buffer(该步骤不能使液体中出现气泡)，立即加入混勻的 Sepharose CL-2B凝胶过滤介质，待介质沉下后，再加入剩余树脂，直至树脂平面距移液管于针筒的连接面约为0. 635cm。将IXSTE buffer加入针筒以清洗柱子，清洗时保证buffer 以恒定的速度流出，用至少IOmL的IXSTE buffer来清洗。当树脂上仅存留约50 μ L的 1 X STE buffer时，立即将cDNA样品加入柱子，轻轻将cDNA打入柱底，但不能干扰到树脂以免影响cDNA的分离，一旦样品进入到kpharose CL-2B凝胶过滤介质，用加样枪在连接管内加入IX STCbuffer，贴壁，缓慢加入3mL IXSTE buffer于针筒内，当cDNA流过柱底时， 染液将逐步扩散，严密跟踪染液的进程。(4)收集样品用200 μ L离心管收集分级物，当染液前锋到达移液管的-0. 5cm处时，开始收集， 每管收集3滴，连续收集至染液尾端到达0. 3cm处，每管收集约100 μ L，将收集得的cDNA样品(共11管)编号，放入-20°C冰箱。将收集得的cDNA样品分管进行非变性SDS-PAGE电泳，将能观察到DNA条带的 cDNA管中的样品混合，以备下一步实验。4.双链cDNA的连接和包装(1)双链cDNA的连接按下列连接体系将双链cDNA与λ ZAP-II载体连接cDNALOyLIOXligase buffer0. 5 μ LΤ4 ligase0. 5 μ LIOmM rATP(PH7. 5)0. 5 μ Lλ ZAP-II vectorl.OyL灭菌双蒸水1.5yL-------------------------------5. OyL连接反应条件4°C水浴连接过夜。(2)连接产物的包装从-80°C冰箱中快速移出包装抽提液，用手握住包装抽提液管，待其刚好融化便立即加入连接好的cDNAl. 0 μ L，轻轻搅拌一下，快速离心3-5秒，然后将包装抽提液管置于 22°〇水浴中211，而后加入50(^1^ SM buffer和20 μ L氯仿，轻轻混勻，简单离心以沉淀碎片，取上清液即为cDNA文库。实施例2cDNA文库的免疫筛选1.筛库血清的处理取手术确诊的囊性包虫病患者混合血清IOOyLdO份，每份10 μ L)，加入ImL用 TBSI^tl 10稀释的Ε. coli XLl-blue MRF，裂解液，于室温吸附过夜后，5000g离心 lOmin，将上清液转移至新的离心管中，用抗体稀释液稀释，使血清终浓度为1 200，于4°C保存。2. cDNA文库的免疫筛选2.1 初筛2. 1.1细菌培养用无菌枪头挑取E.coli XLl-blue MRF，划线接种于LB培养平板(含15 μ g/mLTet)，37°C倒置培养过夜。次日，挑取E. coli XLl-blue MRF’的单菌落于3mL LB培养基 (含IOmM MgS04，0. 2%麦芽糖，15μ g/mL Tet)中，37°C，200rpm振荡培养过夜。次日，取培养液100 μ L转接到新的3mL LB培养基中，37°C，200rpm振荡培养约池。将培养液2000rpm，离心lOmin，弃上清液后，用IOmM MgS04重悬沉淀，测定OD值， 并稀释到0D600 = 0. 5。NZY平板用前于37°C温育lh，以除去平板表面的水滴。2. 1.2噬菌体感染于微波炉中溶解NZYTop Agar, 50°C水浴温育。将上述菌液200 μ L和细粒棘球蚴的cDNA文库(噬菌体液)5 μ L在15mL的培养管内混勻，37°C温育15min。向上述混合物中加入3mLNZY Top Agar,颠倒混勻，立即铺在NZY培养基上，轻轻摇晃使其平铺，室温下凝固 IOmin0于42°C培养箱育板，直至观察到可见的噬菌斑出现(约4h20min)(如图1所示)。2. 1. 3融合蛋白的诱导表达用灭菌的ddH20稀释IPTG至10mM，使用前20min将硝酸纤维素膜标记后浸泡入 IPTG中，浸透后取出，用滤纸吸干多余的溶液，避免噬菌斑间产生交叉。标记平板，将对应的 NC膜覆盖到平板上(用镊子夹住NC膜从平板的一边将膜轻轻放下，避免产生气泡)，37°C 培育3. 5h。把平板转移到4°C冰箱，冷却lOmin，然后用针头在NC膜，平板上的不对称三点做好标记后，用镊子将NC膜从平板上轻轻剥离，平板封口后存放于4°C冰箱。将NC膜放入 TBST (约25mL/膜)中至少洗三次，每次至少15min，除去残留的NZY Top Agar。将NC膜浸在封闭液中(约8mL/膜)，室温轻微振荡，封闭过夜。2. 1. 4表达目的融合蛋白噬菌斑的检测将NC膜从封闭液中取出，用TBST (约25mL/膜)洗膜两次，每次至少5min。加入筛库血清(约8mL/膜)，室温下轻微振荡池后将血清回收。再用TBST洗膜3次(约25mL/ 膜)，每次至少lOmin。加入羊抗鼠碱性磷酸酶结合物(用抗体稀释液1 8000稀释)(约 SmL/膜)室温下反应lh，用TBST洗膜三次，每次至少lOmin，用TBS洗膜2次，每次5min， 洗去残留的Tween 20。将NC膜从TBS中取出，用滤纸吸干多余的溶液，放入AP Buffer浸泡;3min。用Color Development Solution 稀释 NBT 至终浓度为 0. 3mg/mL, BCIP 终浓度为 0. 15mg/mL (将BCIP逐滴加入NBT中，防止形成沉淀)，配制成NBT-BCIP显色液。将NC膜浸入NBT-BCIP显色液中，在暗处进行显色反应直到阳性斑点清晰可见(一般不超过IOmin)。将NC膜从NBT-BCIP显色液中取出，加入另一盛有终止液的容器中，终止显色反应。取出NC膜，室温下风干，避光保存。2. 1.5阳性克隆定位1.根据NC膜上阳性斑点在原始LB培养板上的相应位置，挑取单个阳性噬菌斑， 置于200 μ L SM buffer (含1滴氯仿)中，室温下放置30min，使噬菌体颗粒扩散出琼脂块后，4°C保存。记录每个噬菌斑的阳性反应强度。2.复筛将保存有阳性克隆的SM buffer取出1 μ L，用SM buffer稀释至10 μ L，取1 μ L 按照之前的方法进行噬菌体展示，目的是获得单一的阳性噬菌斑克隆。3.三筛
重复复筛的步骤，直至平板上出现100%的阳性克隆。实施例3阳性噬菌体删除环化为pbluescript重组质粒挑取LB培养基中的E. coli XLl-blue MRF，单菌落于3mL LB培养基(含IOmM MgS04，0. 2%麦芽糖，lSyg/mL Tet)中，37 °C，200rpm振荡培养过夜。次日，取培养液 100 μ L转接到新的3mL LB培养基中，37°C，200rpm振荡培养约2h。培养液经5000g，5min 离心沉淀细菌，用IOmM MgS04重悬至0D600 = 1. 0。在细菌培养管中加入200 μ L Ε. coli XLl-blue MRF，重悬液、50 μ L含有阳性噬菌体的SM buffer和1 μ L辅助噬菌体。将细菌培养管放置于37°C水浴中15min，然后加入3mLLB培养基，于37°C振荡培养证。取出细菌培养管，在65°C加热20min，然后3000g离心15min，将上清转入一个新Ep管中，置于4°C保存。 SOLR 菌于 LB 培养基(含有 IOmM MgS04, 50 μ g/mLKan)然后 5000g，5min 离心沉淀细菌，用IOmM MgS04重悬至0D600 = 1. 0，在1. 5mLEP管中加入200 μ LSOLR菌和前面的上清保存液5 μ L，置于37°C水浴中15min，然后取出100 μ L均勻涂布于LB (含100 μ g/mLAmp) 琼脂平板上，37°C倒置培养过夜。实施例4pblueSCript重组质粒的提取、检测和分析挑取删除环化后的SOLR菌单菌落于LB (含100 μ g/mL Amp)液体培养基中，37°C， 200rpm振荡培养过夜。次日，用OMEGA公司的Plasmid Mini Kit I抽提环化后的质粒DNA， 用30 μ L ddH20将质粒DNA洗脱。将提取的质粒送生工生物技术有限公司进行序列测定(T3，T7通用引物)，将序列在 NCBI 中进行 Blastx 和 Blastn 同源性分析,在 http //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/ gorf.html网站进行结构域分析，确定正确的阅读框架；在http://npsa-pbil. ibcp. fr/ cgi-bin/npsa_automat. pi ？ page = npsa_nn. html 网立占进 二级结构分析，在 http:// www. ebi. ac. uk/InterProScan/站进行结构域分析(如图2、图3、图4和图5所示)。由图2可知，将本发明的基因的碱基序列在NCBI中做Blastn分析，其碱基序列与 SEQ ID N0. 3中从357-1069位的核苷酸具有66%的同源性。由图3可知，将本发明的基因的碱基序列在NCBI中做Blastx分析，其编码蛋白的部分序列与SEQ IDN0. 4的4-350位氨基酸序列相同。由图4所示，对本发明基因编码的蛋白进行二级结构分析，其α-螺旋结构占15.45%，β-片层占17. 89%，而无规卷曲结构占66. 67%。由于α -螺旋和β -片层两种结构有氢键维持，化学键键能比较高，不易变形，能够较牢固的维持蛋白的高级结构，很难与适合的抗体结合，且经常位于蛋白质的内部，不易形成抗原表位。而蛋白质的转角及无规卷曲等柔性结构则比较松散，易于发生扭曲、盘旋并容易出现在蛋白的表面，所以成为表面抗原的可能性较大。该序列大部分的二级结构为无规卷曲，而α-螺旋和β-片层结构较少，说明该序列具有含有B细胞表位的结构基础。由图5所示，对本发明基因编码的蛋白进行结构域分析可知，该序列含有钙网织蛋白的结构域。实施例5目的基因的克隆、转化根据目的基因的序列，选择合适的核酸内切酶(EcoRI和B10I)将目的基因从 Pbluescript SK-载体中切下，同时用同样的内切酶酶切表达载体pGEX_4T_l，酶切体系如下IOXBuffer Tango18 μ L
EcoRI6μ LXhoI6μ L重组载体/pGEX-4T_l 载体 9 μ L灭菌双蒸水51 μ L--------------------------------90 μ L酶切反应条件37°C酶切16h如图6和图7所示，将酶切产物分别进行1. 2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下将凝胶中的目的片段( 1400bp)和表达载体( 5000bp)切下，用Solarbio公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，将目的基因和表达载体用T4连接酶连接，连接体系如下T4 Iigase1 μ LΤ4 ligase buffer1 μ LpGEX-4T_l 载体4μ L目的基因4yL-------------------------------10 μ L连接反应条件16°C下过夜连接取5μ L连接产物转化E. coli Dffia细胞，具体方法为将5 μ L的连接产物与 200 μ L Ε. coli DH5a感受态细胞混勻，冰浴30分钟，之后于42°C水浴热休克90秒钟，再置于冰上1-2分钟，然后加入800 μ L预热的SOC培养基，370C，200rpm震荡培养45分钟，取 200 μ L菌液涂LB+Amp平板，倒置于37°C温箱过夜培养。在平板中挑取5-10个单菌落，分别置于5mLLB+Amp液体培养基中，37°C，200rpm 过夜震荡培养，送生工生物技术有限公司测序检测连接是否成功，将连接成功的重组载体，用OMEGA公司的Plasmid Mini Kit I抽提质粒，取1 μ L质粒照以上方法转化Ε. coli BL21 (DE3)细胞。同时取1 μ LpGEX_4T_l空载体转化E. coli DH5a细胞。实施例6重组蛋白的表达和纯化1.重组蛋白的小量表达分别取转化重组载体及含有PGEX-4T-1空载体的E. coli BL21 (DE3)单菌落于 3mLLB (含100 μ g/mLAmp)培养基，37°C，200rpm振荡培养过夜，而后将ImL菌液加入到2mL 新鲜LB (含100 μ g/mL Amp)培养基中，37°C，200rpm振荡培养2h，而后加入IPTG至终浓度为ImM，37°C，200rpm诱导表达3h。离心收集菌体，用PBS溶液洗两次，将两者同时进行10 % SDS-PAGE电泳，观察重组蛋白是否表达。2.重组蛋白的大量表达取确定表达的E. coli BL21(DE3)单菌落于 IOOmLLB(含 100 μ g/mL Amp)培养基，37°C，200rpm振荡培养过夜，而后将IOOmL菌液加入到IOOOmL新鲜LB (含IOOyg/ mL Amp)培养基中，37°C，200rpm振荡培养浊，而后加入加入IPTG至终浓度为lmMJ8°C， 200rpm诱导表达4h。离心收集菌体，用PBS溶液洗两次，而后在液氮和37°C水浴中反复冻融三次，加入20倍压积的PBS溶液，超声8次(每次30s，间隔lmin)，而后加入4mL 20% TritonX-IOO溶液至终浓度为1 %，冰上搅拌Ih后，20000g离心30min，收集上清和沉淀，进行10% SDS-PAGE电泳，以检验蛋白的溶解性。(如图8所示)3.重组蛋白的纯化由于该蛋白部分存在于上清中，而沉淀中的蛋白较难纯化，故用GEHealthcare公司的Glutathione Sepharose 4B纯化柱纯化上清获得重组蛋白，具体操作方法按照纯化柱的说明书进行，获得重组蛋白的浓度为1. 17mg/mL。实施例7重组蛋白的实验室评价1.天然AgB的纯化取新鲜羊肝包囊液，以IOOOg离心30min，吸上清液入透析袋，用pH5. 0的 5mM乙酸缓冲液于4 °C下透析过夜，50000g离心30min，弃上清以除去白蛋白。沉淀用 0. 2MPBS (pH8. 0)溶解，加40 %饱和硫酸铵，离心除去沉淀球蛋白。随后样品(上清)在水浴中煮沸15min，50000g离心1小时。弃沉淀，上清为AgB02. ELISA以pH9. 6的碳酸盐缓冲液稀释的纯化的天然AgB和重组蛋白H4包被96孔酶标板， 每孔100 μ 1 (每孔抗原量为1 μ g)，4°C过夜。PBS-T缓冲液洗涤3次，每次五分钟，之后用含 5%脱脂奶粉的PBS溶液37°C封闭lh。同法用PBS-T缓冲液洗涤3次后每孔加入1 200 稀释的囊型包虫病、泡型包虫病、囊虫病、其它寄生虫病患者以及健康人血清100μ 1，37°C 孵育1小时。PBS-T洗涤后加入用PBS稀释(1 ；30, 000)的羊抗人IgG辣根过氧化物酶结合物，每孔100μ 1，37°C孵育1小时。PBS-T洗涤后，每孔加入100 μ 1 3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)底物系统室温反应5min后，加100 μ 1 2mol/L H2SO4终止反应。在酶标仪上以 450nm波长读取OD值。以60个非疫区健康人血清的酶标OD值均值加3个标准差(X+3SD) 定为阳性阈值。每份血清做两个孔，如果两孔的平均值大于或等于阳性阈值判为阳性。3.结果用本发明实施例6制备的重组蛋白进行实验室评价结果如表1所示。由表1可以看出本发明的重组蛋白诊断囊型包虫病的敏感性和特异性分别为80. 46% (70/87)和 90. 28% (130/144)，目前诊断囊型包虫病效果最佳的天然纯化抗原B的诊断敏感性和特异性分别为87. 36% (76/87)和84. 72% (122/144)，两者的敏感性和特异性均没有显著性差异(P > 0. 05)。表1重组蛋白H4和天然纯化AgB对包虫病患者和其它寄生虫病患者血清的反应性
权利要求
1.一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因，其碱基序列如SEQ ID NO :1所示，或者其碱基序列与SEQ ID NO. 3中从357-1069位的核苷酸具有66%以上的同源性。
2.权利要求1所述的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因编码的蛋白质。
3.如权利要求2所述的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，或者其部分序列与SEQ ID NO :4所示的4-350位氨基酸序列相同。
4.一种表达载体，其特征在于含有权利要求1所述的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因。
5.一种融合蛋白，其特征在于含有权利要求1所述的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因所编码的蛋白。
6.一种宿主细胞，其特征在于由权利要求4所述的表达载体转化或者转导。
7.一种抗体，其能与权利要求2所述的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因编码的蛋白质特异性结合。
8.权利要求2所述的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因编码的蛋白质在制备用于免疫细粒棘球蚴病的疫苗中的应用。
9.权利要求4所述的一种表达载体在制备用于诊断囊型包虫病的诊断试剂中的应用。
10.权利要求5所述的一种融合蛋白在制备用于诊断囊型包虫病的诊断试剂中的应用。
11.权利要求7所述的一种抗体在制备用于诊断囊型包虫病的诊断试剂中的应用。
全文摘要
本发明属于生物工程领域，提供了一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因，其碱基序列如SEQ ID NO1所示，或者其碱基序列与SEQ ID NO3中从357-1069位的核苷酸具有66％以上的同源性。本发明还提供了上述的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因编码的蛋白质。本发明还提供了上述的一种细粒棘球绦虫钙网织蛋白基因编码的蛋白质在制备用于诊断囊型包虫病的诊断试剂中的应用。本发明的重组蛋白可以用于囊型包虫病患者的免疫诊断，用该重组蛋白包板，用ELISA方法检测囊型包虫病、泡型包虫病、囊尾蚴病、其它寄生虫病患者以及健康人血清，获得的敏感性和特异性分别为80.46％和90.28％。
文档编号G01N33/53GK102168089SQ201110037749
公开日2011年8月31日 申请日期2011年2月14日 优先权日2011年2月14日
发明者朱慧慧, 杨玥涛, 汪俊云, 石锋, 高春花 申请人:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所
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