专利名称：一种甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫层析法快速检测甲型肝炎病毒(HAV) IgM抗体试纸。
背景技术：
甲型肝炎是流行性肝炎的一种，由于甲型肝炎病毒(HAV)感染引起，是一类急性， 自限性疾病，预后良好，极少转变为慢性。HAV是通过粪-口途径传播的，即由病人的潜伏期或急性期粪便、血液中的甲肝病毒污染水源、食物、用具及生活密切接触经口进入胃肠道而传播。该病毒感染可引起不同程度的急性症状，包括爆发性肝炎。1988年初春，上海发生的一场突如其来的甲肝大流行，整整持续了 2个月，甲肝感染者超过35万人，死亡31人。甲肝的早期诊断具有重要意义。抗HAV-IgM是诊断甲型病毒肝炎的特异性指标。抗-HAV IgM阳性意味着患者处于甲型病毒性肝炎的急性期，并可作为早期诊断的可靠指标。免疫层析胶体金技术是一种新型的诊断技术，已得到较为广泛运用，其基本原理为利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试剂的NC膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测时当样品中含有相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗�：脱分信涮逑嘟岷闲纬筛春衔铮缓笤贜C膜上层析，再被包被抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测线，通过检测线的有无实现对结果的判定。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测等优点ο
发明内容本实用新型的目的是提供一种具有简便、准确、快速、灵敏度和特异性高、经济实用、适合于现场检测等特点的甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸。为了达到本实用新型的目的采取如下技术方案一种甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸，在塑料支撑板上粘贴上样垫，上样垫的一端紧密连接含有标记HAV抗体的胶体金垫，胶体金垫的另一端紧密连接的含有HAV抗原的抗原垫，抗原垫的另一端紧密连接硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线和质控线，检测线为包被在硝酸纤维素膜上的抗人IgM抗体，质控线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG抗体，在检测线和质控线之间且距检测线2. 5 3mm处划有指示线用于标识加样位置，硝酸纤维素膜的另一端紧密连接吸样垫形成试纸条，试纸条也可以装入塑料卡中形成卡式包装。所述的指示线加样量为3 5ul。所述的上样垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫为吸水滤纸。所述的甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸，其特征在于所述的抗人IgM抗体的包被方法为以0. 01MpH7. 2磷酸盐缓冲液(PBS)将抗人IgM抗体配制成1. 5mg/ml的溶液， 有喷膜机在NC膜下部以1. 3ul/cm的参数进行划线，包被T线，同时在NC膜上部包被羊抗鼠IgG作为C线，划线后将NC膜在干燥间(温度20 25°C，湿度小于30% )干燥8 10小时。所述的甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸，其特征在于所述的HAV抗体标记胶体金颗粒的方法为以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30 50nm的胶体金溶液， 制备完成后取IOOml胶体金液放在烧杯中，用0. 2MK2C03调至pH8. 2，按IOOml胶体金溶液加入0. 5mgHAV单克隆抗体，室温搅拌2小时，加入终浓度0. 酪蛋白钠，0. 聚乙二醇 20000封闭20min，12000转离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至66. 7ml，按Iml溶液铺16cm2的比例均勻地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间温度20 25°C，，湿度小于30 %干燥2 4小时，制成胶体金垫，备用。所述的甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸，其特征在于所述的HAV抗原垫制备方法为将HAV抗原胶体金工作液按(1 4)稀释，按Iml溶液铺18. 5cm2的比例均勻地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间温度20 25°C，湿度小于30%干燥2 4小时，制成抗原垫，备用。试纸条的装配方法为在干燥室内温度20 25°C，湿度小于30%，取塑料支撑板， 将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧距边缘Imm搭接抗原垫， 在抗原的另一侧距边缘Imm搭接胶体金垫，在胶体金垫另一侧距边缘2mm搭接粘贴上样垫； 在NC膜C线一侧距边缘1. 5mm处搭接吸样垫。然后用裁剪机将贴好的塑料板切成3mm或 4mm宽的试纸条。切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成HAV IgM抗体检测试剂卡。检测方法将被检血清或血浆平衡至室温，将制备好的试纸条或试剂卡平放，在 NC膜标示线上加入3 5ul被检样品，若样品中含抗HAV IgM抗体则被NC膜上的抗人IgM 抗体捕获，并与扩散到NC膜上的Ag-Ab-HAV-胶体金的Ag相结合，形成复合物，当被捕获的胶体金复合物达到一定数量时，则形成一条肉眼可见的T线，C线作为试剂的质控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。用肉眼直接观察在20分钟内C、T线的出现情况，并判定检测结果。本实用新型甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸的优点检测时将样本加在指示线8上，在上样垫上加稀释液，然后观察免疫反应结果。具有简便、准确、快速、灵敏度和特异性高、经济实用、适合于现场检测等特点。
图ι为本实用新型甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸结构示意图,
1 上样垫 3 抗原垫 5 吸样垫 7:质控线 9 塑料支撑板
2 胶体金垫 4 硝酸纤维素膜 6 检测线 8 指示线
具体实施方式
实施例制备甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸1主要材料HAV天然抗原、单克隆抗体、抗μ链单克隆抗体均为深圳市菲鹏生物股份有限公司提供，分别用于辅抗原垫、标记胶体金颗粒、包被硝酸纤维素(NC)膜；氯金酸和柠檬酸三钠为Sigma公司产品，用于空白金制备；硝酸纤维素膜为Millipore公司产品；酪蛋白钠、 聚乙二醇20000为Sigma公司产品，用于胶体金封闭；其它试剂均为分析纯试剂。2 方法2. IHAV单克隆抗体的标记用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0. 2MK2C03可将溶液pH调到pH7. 0、pH8. 2、pH9. 2、然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每IOOml溶液0. 5mg、1. Omg, 1. 5mgHAV单克隆抗体缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再加入终浓度为0. 酪蛋白钠，0. 聚乙二醇20000进行封闭20分钟，12000转离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至66. 7ml，按Iml溶液铺16cm2的比例均勻地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间温度20 25°C，，湿度小于30%干燥 2 4小时，制成胶体金垫，备用。2. 2HAV抗原垫制备方法将HAV抗原用胶体金工作液按1 1、1 2、1 4、1 8稀释，按Iml溶液铺 18. 5cm2的比例均勻地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间温度20 25°C，湿度小于 30 %干燥2 4小时，制成抗原垫，备用。2. 3抗μ链单克隆抗体包被用0. OlM pH7. 2PBS抗μ链单克隆抗体包被分别稀释成1. Omg/mlU. 5mg/ml、 2.0mg/ml，然后用喷膜仪将抗μ链单克隆抗体在NC膜上按1. Ml/cm划线包被，同时包被羊抗鼠IgG抗体，包被完成后将NC膜置于干燥间干燥8-10小时，备用。2. 4试纸条的装配在干燥室内温度20 25°C，湿度小于30 %，取塑料支撑析，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧距边缘Imm搭接抗原垫，在抗原的另一侧距边缘Imm搭接胶体金垫，在胶体金垫另一侧距边缘2mm搭接粘贴上样垫；在NC膜C线一侧距边缘1.5mm处搭接吸样垫。然后用裁剪机将贴好的塑料板切成3mm或4mm宽的试纸条。切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成HAV IgM抗体检测试剂卡。2. 4检测方法将被检血清或血浆平衡至室温，将制备好的试纸条或试剂卡平放， 在NC膜标示线上加入3 5ul被检样品，若样品中含抗HAV IgM抗体则被NC膜上的抗人 IgM抗体捕获，并与扩散到NC膜上的Ag-Ab-HAV的Ag相结合，形成复合物，当被捕获的胶体金复合物达到一定数量时，则形成一条肉眼可见的T线，C线作为试剂的质控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。用肉眼直接观察在20分钟内C、T线的出现情况，并判定检测结果。3 结果3. 1根据小样的检测结果，确定试纸的最佳标记pH值为8. 2，最佳标记量为0. 5mg 每IOOml胶体金溶液，最佳的胶体金工作液为pH9. O的Tris-柠檬酸缓冲液，含0. 2%的酪蛋白，5%蔗糖，0.2%的BSA，0. 2%的吐温，最佳的抗μ链单克隆抗体包被浓度为1.5mg/ ml，最佳的抗原稀释比例为1 4。20分钟内判读结果。3. 2临床样本检测以ELISA试剂为对照，20份阳性血清，本试剂检测出阳性19份，灵敏度为95%，50份阴性样本中，本试剂检测出阴性49份，特异性为98%。
权利要求1.一种甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸，其特征在于在塑料支撑板(9)上粘贴上样垫(1)，上样垫(1)的一端紧密连接含有标记HAV抗体的胶体金垫O)，胶体金垫O)的另一端紧密连接的含有HAV抗原的抗原垫(3)，抗原垫(3)的另一端紧密连接硝酸纤维素膜G)，硝酸纤维素膜(4)包被有相互分离的检测线(6)和质控线(7)，检测线(6)为包被在硝酸纤维素膜上的抗人IgM抗体，质控线(7)为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG抗体，在检测线(6)和质控线(7)之间且距检测线(6) 2. 5 3mm处划有指示线⑶用于标识加样位置，硝酸纤维素膜(4)的另一端紧密连接吸样垫( 形成试纸条，试纸条也可以装入塑料卡中形成卡式包装。
2.根据权利要求1所述的甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸，其特征在于所述的指示线⑶加样量为3 5ul。
3.根据权利要求1所述的甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸，其特征在于所述的上样垫(1)为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫(5)为吸水滤纸。
专利摘要本实用新型涉及生物应用技术领域，特别涉及一种甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸。由上样垫、标记有HAV抗体的胶体金垫、HAV抗原垫，硝酸纤维素(NC)膜和吸样垫构成，NC膜包被有相互分离的检测(T)线和质控(C)线，在C线与T线之间喷有指示线。T线为抗人IgM抗体，C线为羊抗鼠IgG抗体。检测时将样本加在指示线上，在上样垫上加稀释液，然后观察免疫反应结果。具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
文档编号G01N33/558GK201965131SQ201020665839
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月17日 优先权日2010年12月17日
发明者崔迎进, 李洲 申请人:天津中新科炬生物制药有限公司
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