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专利名称：体外模拟评定液体饲料复合酶质量的方法
技术领域：
本发明涉及一种体外模拟评定液体饲料复合酶质量的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
饲用酶制剂作为一类高效、无毒副作用、环保型的“绿色”饲料添加剂，能够直接提高饲料产品质量及转化利用率，降低饲料成本，已被业界公认具有良好的实用效果，为饲料工业和养殖业的发展起到了很大的促进作用，有着十分广阔的前景。但是，酶制剂的化学本质是一类蛋白质，其特定的空间结构在饲料加工过程中 (如制粒、膨化等)，不可避免地会受高温、高压等因素的强烈作用而遭到破坏，导致酶变性失活，从而对酶制剂的最终使用效果产生了很大的影响。为了避免饲料加工过程中高温、压力等因素对酶制剂的破坏作用，通常采用一定的剂型办法对其进行保护(如采用包衣、包被、微丸等剂型处理等)。但这些剂型处理的饲用酶制剂还是存在着一些不足，例如，制粒温度超过85 °C，酶制剂仍然会有一定的损失等。因此，在制�：笸ü缤恳禾迕钢萍粒梢酝耆苊庵屏Ｊ备呶隆⒏哐�、剪切力等因素对酶制剂的破坏作用。液体后喷涂是颗粒饲料使用酶制剂的终极解决方案。目前，已被国内外的饲料生产企业广泛接受。因为使用液体饲料复合酶完全避免了饲料制粒、膨化过程中对酶制剂的破坏作用，减少加工的损失，根本上保证了饲料的品质。同时可使酶制剂等热敏性微量组分免受热加工的损害，减少这些组分的超额添加量，从而降低饲料生产成本。衡量液体饲料复合酶制剂产品质量水平和作用效果的依据主要是酶的种类、含量、活性、稳定性和动物饲养效果。而目前中国广大酶制剂使用厂家，在筛选液体饲料复合酶制剂时，主要依据实验室对单一酶种酶活的检测结果，检测方法主要有国家农业部标准 (NY/T 2006-2009，主要是纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶)或企业标准或轻工业部方法，哪怕同一酶种同一酶活，不同企业标示的结果差别很大，因为，酶活力的定义不同，其酶活数值有很大不同。1961年，国际酶学委员会规定在特定条件(25°C、最适pH及底物浓度)下， Imin内转化1 μ mol底物(或底物中1 μ mol有关基团)所需的酶量，为1个酶活力单位。 此酶活力单位又称国际单位(international unit，IU)，单位为μπιο /min。但实际应用中酶活力的定义，有些是出于应用方便，有些是沿用习惯，差别很大。例如目前所见的不同文献或生产厂商对木聚糖酶活力的定义达6种之多，其酶活力数值大小迥异(表1-1)。表1-1木聚糖酶活力数值不同定义方法的不同国际单位(IU)其他定义所使用单位及换算值μmol/minμmol/hμmol/snmol/minnmol/sU g/min与IU换算系数1601/6010001000/60150酶活力10006000016. 7100000016700150000从表1-1中数据可见，不同定义的酶活力数值差异很大。当然，测定方法和测定条件相同的前提下，酶活换算后是可以直接进行比较的。但实践中，酶活高的，在动物饲养试验中，并不一定表现出好的效果。一是酶活的检测条件并不能代表动物体内的实际环境，因此，酶在动物体内不一定充分发挥最佳效果；二是选用的底物不能完全代表饲料，酶发挥作用的条件必须有充足的相对应的底物，否则不能发挥较好作用效果；三是菌种不同，产生的酶对底物的催化功能也不同；四是生产方式(固态/液态发酵)不同，酶的纯度及卫生指标不同，就是同一生产方式中的不同生产条件也会产生种类不同的酶，导致其催化功能差异。用酶活来评估液体饲料复合酶在动物生产中的实际效果是不科学的，酶活高低并不能用来预测产品的相对性能。于是，大多厂家开始转向动物饲养试验进行验证和比较，花费很多的人力、物力和财力，投入动物饲养试验，做了大量的效果验证试验后，结果发现，酶制剂的作用不稳定，基本上呈现效果好与没有效果的比率各为50%。为了进一步验证，有些试验反复做，一次不行，二次，二次不行三次…，甲用户做后，乙用户做，乙客户做完，丙客户做…。耗费很多时间的同时也浪费了金钱。因此，寻找一种简单、经济和科学易行的评定方法迫在眉睫。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种体外模拟评定液体饲料复合酶质量的方法。一种体外模拟评定液体饲料复合酶质量的方法，包括以下步骤步骤1 配制DNS 试剂称取氢氧化钠100. Og加水溶解，定容至500mL(命名为A试液)。称取3，5- 二硝基水杨酸15. 75g，将其缓慢加入到2500mL蒸馏水中，不断搅拌，水浴至45°C，向其中逐步加入 500mL A试液，不断搅拌至溶液清澈透明(在加入氢氧化钠溶液过程中，溶液温度不要超过 480C )。再逐步加入四水酒石酸钾钠455g、苯酚12. 5g、无水亚硫酸钠12. 5g，继续45°C水浴加热，同时补水1500mL，不断搅拌，至上述物质完全溶解后，冷却至室温，并定容到5000mL， 储存于棕色瓶中，标识名称和配制日期，避光，室温保存7天后可以使用。有效期3个月。步骤2 绘制标准曲线吸取lmg/ml无水葡萄糖溶液0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1.0ml 于试管中，补水至20ml，加DNS试剂:3ml，混合后于沸水中煮IOmin，冷却，定容至15ml，于分光光度计MOnm波长下测吸光度(A)；以吸光度为纵坐标，葡萄糖量为横坐标，绘制标准曲线，上述步骤重复三次，三次重复实验的均值用最小二乘法拟合一元线性方程y = ax+b，求出吸光度(y)与葡萄糖量(χ)的关系；步骤3 胃蛋白酶液配制将IOg胃蛋白酶加入IOOOml水中，然后用3mol/L HCl 调节PH值至2. 5得到胃蛋白酶液备用；
在三角瓶中按料液比为(g ml)l 3. 7加入所述胃蛋白酶液，在三个实验组的三角瓶中分别加入待评定的液体复合酶lml，在38°C摇床中振荡，分别在lh、3hjh每组取出一个三角瓶，用氢氧化钠溶液调节PH值至5. 0以上，然后在4000转离心机中离心lOmin， 取出上清液；吸取一定量上清液至15ml刻度管中加水补至anl，加3mlDNS，在沸水浴中煮沸 IOmin后取出迅速用冷水冷却；定容至15ml，于分光光度计MOnm波长下测吸光度(A)；保证吸光值在0. 25-0. 35之间；步骤4 采用以下公式计算y = ax+b，根据吸光度(y)计算葡萄糖量(χ)；步骤5 结果分析还原糖含量高的，说明饲料复合酶的质量较好。以上方法比较科学地判断液体饲料复合酶的质量和应用效果。减少检测费用，节省试验时间。帮助饲料酶使用客户较好地评定和判断液体饲料复合酶的质量。


图1为饲料中还原糖本分含量与消化时间关系趋势图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。主要试剂氢氧化钠(GB629)化学纯；3，5- 二硝基水杨酸化学纯；四水酒石酸钾钠化学纯；苯酚化学纯；无水亚硫酸钠化学纯；葡萄糖化学纯；胃蛋白酶，生化试剂，规格1 15000，产地中国。步骤1 :DNS试剂的配制称取氢氧化钠100. Og加水溶解，定容至500mL(命名为A试液)。称取3，5_ 二硝基水杨酸15. 75g，将其缓慢加入到2500mL蒸馏水中，不断搅拌，水浴至45°C，向其中逐步加入 500mL A试液，不断搅拌至溶液清澈透明(在加入氢氧化钠溶液过程中，溶液温度不要超过 480C )。再逐步加入四水酒石酸钾钠455g、苯酚12. 5g、无水亚硫酸钠12. 5g，继续45°C水浴加热，同时补水1500mL，不断搅拌，至上述物质完全溶解后，冷却至室温，并定容到5000mL， 储存于棕色瓶中，标识名称和配制日期，避光，室温保存7天后可以使用。有效期3个月。步骤2 标准曲线绘制吸取lmg/ml无水葡萄糖溶液0，0. 2,0. 4,0. 6,0. 8，1. Oml 于试管中，补水至2ml，加DNS试剂3ml，混合后于沸水中煮lOmin，冷却，定容至15ml，于分光光度计MOnm波长下测吸光度(A)。以吸光度为纵坐标，葡萄糖量为横坐标，绘制标准曲线，上述步骤重复三次，三次重复实验的均值用最小二乘法拟合一元线性方程y = ax+b，求出吸光度(y)与葡萄糖量(χ)的关系。步骤3 胃蛋白酶液配制将IOg胃蛋白酶加入IOOOml水中，然后用3mol/L HCl 调节PH值至2. 5备用(注此溶液要现用现配)。以比较3种不同液体复合酶的效果为例取12个150ml三角瓶，每个三角瓶中准确称取IOg全价料，分成四组，一个为对照组，其它三个为实验组，每一组均设三个时间点，分别为lh、3h、5h，每个三角瓶中按料液比为1 3. 7加入37ml (即10克全价料中添加 37ml胃蛋白酶液)胃蛋白酶液，在三个实验组的三角瓶中分别加入待评定和比较的三种不同液体复合酶Iml (编号1、2、；3)，在38°C摇床中振荡，分别在lh、3hjh每组取出一个三角瓶，用氢氧化钠(0. 2mol/L，大约五滴)调节pH值至5.0以上，然后在4000转离心机中离心 lOmin，取出上清液。吸取一定量上清液至15ml刻度管中加水补至20ml，加3mlDNS，在沸水浴中煮沸IOmin后取出迅速用冷水冷却。定容至15ml，于分光光度计MOnm波长下测吸光度y (A)。保证吸光值在0. 25-0. 35之间。步骤4 采用公式计算葡萄糖量y = ax+b，根据吸光度(y)求出葡萄糖量(χ)，进而可以计算出葡萄糖的百分含量(即还原糖的百分含量)。步骤5:结果分析还原糖含量高的，说明饲料复合酶的质量好些。与动物饲养试验对比显示，动物饲养效果的结果与以上实验结果有很高的相关性 (> 0. 95)。即采取以上方法基本上能鉴别出液体饲料复合酶的质量。按照上述方法，试验结果如图1所示，说明3号酶产品效果好于其他组酶制剂产品。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1. 一种体外模拟评定液体饲料复合酶质量的方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤1 配制DNS试剂称取氢氧化钠100. Og加水溶解，定容至500mL(命名为A试液)。称取3，5- 二硝基水杨酸15. 75g，将其缓慢加入到2500mL蒸馏水中，不断搅拌，水浴至45°C，向其中逐步加入500mL A试液，不断搅拌至溶液清澈透明(在加入氢氧化钠溶液过程中，溶液温度不要超过48°C )。再逐步加入四水酒石酸钾钠455g、苯酚12. 5g、无水亚硫酸钠12. 5g，继续45°C水浴加热，同时补水1500mL，不断搅拌，至上述物质完全溶解后，冷却至室温，并定容到5000mL，储存于棕色瓶中，标识名称和配制日期，避光，室温保存7天后可以使用。有效期3个月。步骤2 绘制标准曲线吸取lmg/ml无水葡萄糖溶液0、0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. Oml于试管中，补水至20ml，加DNS试剂:3ml，混合后于沸水中煮IOmin，冷却，定容至15ml，于分光光度计MOnm波长下测吸光度(A)；以吸光度为纵坐标，葡萄糖量为横坐标，绘制标准曲线，上述步骤重复三次，三次重复实验的均值用最小二乘法拟合一元线性方程y = ax+b，求出吸光度(y)与葡萄糖量(χ)的关系；步骤3 胃蛋白酶液配制将IOg胃蛋白酶加入IOOOml水中，然后用3mol/L HCl调节 pH值至2. 5得到胃蛋白酶液备用；在三角瓶中按料液比为(g ml)l 3. 7加入所述胃蛋白酶液，在三个实验组的三角瓶中分别加入待评定的液体复合酶lml，在38°C摇床中振荡，分别在lh、3hjh每组取出一个三角瓶，用氢氧化钠溶液调节PH值至5. 0以上，然后在4000转离心机中离心lOmin，取出上清液；吸取一定量上清液至15ml刻度管中加水补至anl，加3mlDNS，在沸水浴中煮沸 IOmin后取出迅速用冷水冷却；定容至15ml，于分光光度计MOnm波长下测吸光度(A)；保证吸光值在0. 25-0. 35之间；步骤4 采用以下公式计算y = ax+b，根据吸光度(y)计算葡萄糖量(χ)； 步骤5 结果分析还原糖含量高的，说明饲料复合酶的质量较好。
全文摘要
本发明公开了一种体外模拟评定液体饲料复合酶质量的方法，包括以下步骤步骤1配制DNS试剂步骤2绘制标准曲线；步骤3胃蛋白酶液配制；步骤4采用以下公式计算y＝ax+b，根据吸光度(y)计算葡萄糖量(x)；步骤5结果分析还原糖含量高的，说明饲料复合酶的质量较好。以上方法比较科学地判断液体饲料复合酶的质量和应用效果。减少检测费用，节省试验时间。帮助饲料酶使用客户较好地评定和判断液体饲料复合酶的质量。
文档编号G01N21/31GK102279163SQ201110187029
公开日2011年12月14日 申请日期2011年7月6日 优先权日2011年7月6日
发明者陈清华 申请人:湖南利尔康生物有限公司