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专利名称：用于固定生理物质的底物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及用于固定生理物质(a physiological material)的底物(substrate)及其制备方法，且更具体地，本发明涉及用于固定带有均匀和高密度的官能团的生理物质的底物及其制备方法。
背景技术：
近来，世界上对开发用于分析诸如核酸、蛋白质、酶、抗体和抗原这样的生理物质活性的技术的需求迅速增加。就这类需求而言，建议使用生物芯片，其中通过采用半导体加工技术将所需的生理物质分子固定在某些微小的区域，由此易于通过以生物化学方式检测上述生物芯片而获得生理上有用的信息。
生物芯片是常规的半导体芯片的形式，不过在其上面整合的是诸如酶、蛋白质、抗体、DNA、微生物、动物和植物细胞及器官、神经元等这样的生物有机物质。可以将所述的生物芯片分类为固定DNA探针的“DNA芯片”；固定诸如酶、抗体、抗原等这样的蛋白质的“蛋白质芯片”；以及通过预处理、生化反应、检测和产生自动分析功能的数据分析功能整合的“芯片上的实验室”。
为了成功开发这类生物芯片，重要的是找到一种用于固定生理物质的方法，其中可以在生理物质与底物之间有效形成界面，并且可以以最大程度地利用所述生理物质的内在固有功能。一般来说，通过各种技术，例如通过使DNA与碳化二亚胺反应而活化DNA的5’-磷酸基和通过使活化的DNA与底物表面上的官能团反应以便将所述DNA固定在所述底物表面而将生理物质固定在玻璃载玻片、硅片、微孔板、管、球形珠、带有多孔层的表面等的表面上。
USP No.5,858,653中公开了能够与靶生理物质反应的离子基团如季铵基团、质子化的叔胺或磷鎓和用于结合底物表面的带有光活性基团或热化学活性基团的聚合物。USP No.5,981,734中教导了当用带有氨基或醛基的聚丙烯酰胺凝胶固定DNA时，该DNA可以通过稳定的杂交键与底物结合而易于促进分析的进行。USP No.5,869,272中公开了包括选自树枝状聚合物、星形聚合物、分子自组装聚合物、聚合型硅氧烷和通过用氨基硅烷对硅片进行旋转涂敷形成的成膜胶乳的化学物质的结合层。USP No.5,869,272中还公开了一种通过检测光活性表面的视觉颜色改变来测定细菌抗原的方法。USP No.5,919,523中公开了一种载体的制备方法，在该载体上用甘氨酸或丝氨酸掺涂氨基硅烷处理的底物或用胺、亚胺或基于酰胺的有机聚合物涂覆该底物。USP No.5,985,551中公开了一种通过在氨基硅烷处理的底物上使用光刻法技术而在固体底物上形成氨基的方法，该方法包括下列步骤给固定DNA的区域赋予亲水性功能并给其它区域赋予氟硅氧烷疏水性功能以便在底物上形成所需图案的DNA斑点。
在上述专利中，通过制备自组装的单层硅烷分子而产生固定层。优选硅烷是氨基烷氧基硅烷，因为它不会产生酸性副产物且它可以产生具相对高密度的带有官能团的分子层。尽管已经进行了大量研究而使用氨基烷氧基硅烷获得带有高密度官能团的均匀单层，但是尚未获得均匀和高密度的具有官能团且生产时间较短的氨基硅烷单层。
生物芯片的性能还受到用作载体的底物性质的影响。也就是说，为了在对致密排列进行杂交分析时应用光谱技术，底物应是透光的且底物表面与生理物质之间的结合应是稳定的。
一般来说，通过给钠石灰玻璃涂敷(coat)氨基硅烷化合物来制备固定底物。然而，钠石灰玻璃是含有约12％以上钠的低等级玻璃。存在于这类玻璃中的钠易于沉积，从而导致玻璃的透明性退化和硅氧烷键或玻璃与硅烷之间的键离解。固定层由此失去了与底物的结合强度且难以获得均匀密度的官能团。
为了解决上述难题，WO 99/40038中建议使用硼硅酸盐或硼硅酸铝(boroaluminosilicate)玻璃，但它的缺点是过于昂贵。
发明概述为了解决上述难题，本发明的一个目的是提供一种用于固定带有均匀和高密度的官能团的生理物质的底物。
本发明的另一个目的是提供一种通过简单过程制备用于固定生理物质的底物的方法。
本发明的又一个目的是提供一种包括用于固定生理物质的底物的生物芯片。
本发明的其它目的和优点部分将在下文中描述且部分可以从本说明书中显而易见或可以通过实施本发明而得知。
为了实现这些目的，本发明提供了一种用于固定生理物质的底物，它包括底物、在所述底物上形成的首层和在该首层(primer layer)上形成的固定层，其中所述的首层用于增进所述底物与所述固定层之间的结合。
本发明进一步提供了一种制备用于固定生理物质的底物的方法，该方法包括下列步骤给底物涂敷带有官能团的化合物以形成首层；给所述首层涂敷带有能够固定生理物质的官能团的化合物以形成固定层，其中所述的首层能够增进底物与固定层之间的结合。
本发明还提供了一种包括固定在底物表面上的生理物质的生物芯片。
附图简述对本发明更完全地理解及其许多附加的优点是容易明白的，因为可以通过参照下列具体描述并结合图考虑时更好地理解它们。


图1是说明本发明固定生理物质的底物的制备方法的示意图；图2是表示常规自组装单层的截面图；图3是表示本发明用于具有三维交联结构的固定生理物质的底物的截面图。
图4A和4B分别是表示对用于固定生理物质的本发明实施例1和2底物进行浸入试验的结果的照片；且图5A和5B分别是表示用于固定生理物质的本发明实施例1和6底物的发光影象的照片。
优选实施方案的详细描述下文进一步具体地描述本发明。
图1是说明制备用于固定生理物质的底物的方法的示意图。正如图1中所示，用于固定生理物质的底物10在底物10与固定层30之间包括首层20。该首层20阻断碱性物质从钠石灰玻璃基质中的沉积且能够改善底物10与固定层30的固定官能团之间的结合。它还极易与氨基硅烷反应，使得它产生均匀排列的高密度官能团。
本发明的底物10例如为玻璃、硅片(silicone wafer)、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚氨基甲酸酯等，但并不限于它们。它还可以是微孔板、管、球形珠或多孔层的形式。
用于形成能够增进在底物10与固定层30之间结合的首层的实例包括，但不限于选自式1和式2所代表的化合物及其混合物的任意化合物M(OR1)n(1)其中M是选自元素周期表4B、3A、4A和5A族元素组成的组的元素；且优选选自Si、Zr、Ti、Al、Sn、In和Sb组成的组；R1是氢原子或C1-20烷基或C6-12芳族基且优选是氢原子、甲基、乙基、丙基、丁基或苯基；且n是3-4的值且根据M的化合价来决定；[M’(OR2)m]p(R3)q(2)其中M’是选自元素周期表4B、3A、4A和5A族元素组成的组的元素且优选选自Si、Zr、Ti、Al、Sn、In和Sb组成的组；R2是氢原子、卤原子或C1-20烷基或C6-12芳族基团且优选是氢原子、氯或甲基、乙基、丙基、丁基或苯基；R3是任选被C1-6取代基取代的亚甲基(methylene)或苯基；m是2-3的值且根据M’的化合价来决定；p是2-4的数值；且q是1-20的数值。
由式(1)代表的化合物的优选实例是四烷醇硅(silicon tetraalkoxide)，如原硅酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate)、三丁醇铝(aluminum tributoxide)、四丁醇锆(zirconium tetrabutoxide)等。
由式(2)代表的化合物的实例是双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷、双(三甲氧基甲硅烷基)己烷、双(三乙基氧基甲硅烷基)甲烷、1，9-双-(三氯甲硅烷基)壬烷、双(三正丁氧基锡)甲烷、双(三异丙氧基钛)己烷(bis(triisoipropoxytitanium)hexane)、1，4-双(三甲氧基甲硅烷基乙基)苯等。
在将式(1)化合物与式(2)化合物混合使用的情况中，它们的重量比优选在0.01∶99.9-100.0、更优选在50∶50-95∶5的范围。
通过给底物涂布涂敷组合物来形成首层，所述的涂敷组合物包括能够增进底物与固定层之间结合的化合物。通过将用于形成首层的化合物溶于稀释溶剂中来制备涂敷组合物。稀释溶剂是水与有机溶剂的混合物且所述的有机溶剂优选是醇溶剂，诸如甲醇、乙醇、丙醇或丁醇；溶纤剂溶剂，诸如甲基溶纤剂；与水相容的任意有机溶剂，诸如丙酮类；或它们的任意混合物。
将用于形成首层的化合物溶于溶剂中且通过水解反应和缩合反应形成低聚物。为了增加反应速率，添加诸如乙酸、硝酸、盐酸等这样的任意有机酸或无机酸以便将涂敷用组合物的pH调节至2-10。
该涂敷组合物包括用量为0.1-90wt％、优选1-50wt％的形成首层的化合物。在化合物的用量低于0.1wt％的情况中，底物与固定层之间结合的增进作用不充分，而在化合物的用量高于90wt％的情况中，该涂敷组合物不能施加到底物上。
通过给底物涂布涂敷组合物而简单地制备首层。该涂敷方法的实例包括、但不限于湿涂覆法，诸如浸入、喷雾、旋转涂敷或印刷。正如图1中所示，该首层的表面上带有能够与固定官能团结合的硅醇基(SiOH)。
优选在100-400℃的温度下加热涂敷的底物以便增加涂敷层的密度并增进与底物的结合。在加热温度低于100℃的情况中，表面强度不足且诸如钠这样的碱性物质几乎很少被阻断。另一方面，在加热温度高于400℃的情况中，表面的硅烷醇基退化而使涂敷层与底物之间的结合降低。
通过在首层表面上施加包括固定官能团的化合物而获得固定层，从而得到用于固定生理物质的底物。本文中的术语“固定层”指的是带有用于固定生理物质的固定官能团的任意化合物的涂敷层。
所述的固定官能团例如为氨基、醛、巯基或羧基，但并不限于它们。带有固定基团的化合物可以由式(3)代表Y-R4-Si(R5)3(3)其中Y随生理物质的端基的不同而改变且至少是一种选自氨基、醛、巯基和羧基组成的组的官能团；
R4选自C1-20烷基、C6-20芳族基团、酯基和亚胺基组成的组；且优选是甲基、乙基、丙基或丁基；而R5选自羟基、C1-20烷氧基、乙酰氧基、卤素及其组合组成的组且优选是羟基、乙氧基或乙酰氧基。
带有氨基作为固定官能团的式(3)化合物的优选实例包括3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、2-氨基十一烷基三甲氧基硅烷、氨基苯基三甲氧基硅烷和N-(2-氨基乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷。带有巯基的化合物优选例如为3-巯基丙基三甲氧基硅烷、3-巯基丙基三乙氧基硅烷等。带有醛基的化合物优选例如为4-三甲氧基甲硅烷基丁醛、4-三甲氧基甲硅烷基丁醛等。带有羧基的化合物优选例如为羧甲基三甲氧基硅烷、羧甲基三乙氧基硅烷等。
为了降低固定基团的亲水性并改善三维交联结构的热稳定性，可以将式(3)的化合物与由下列式(4)代表的疏水性硅烷化合物混合 其中R6选自C1-14烷基、任选被优选的甲基、乙基或丙基取代的C6-12芳族基团和CX3组成的组，其中X是卤素，且优选是甲基、乙基或丙基；R7和R8各自独立地选自C1-14烷氧基、乙酰氧基、羟基和卤素组成的组且优选是甲氧基、乙氧基、乙酰氧基或氯；R9选自氢、C1-14烷基和C6-12芳族基团组成的组且优选是甲基或乙基；k是1-15的整数。
可以通过向带有固定官能团的化合物中添加疏水性硅烷化合物来控制固定层的亲水性、效率、用量和形状。疏水性硅烷化合物例如为甲基三甲氧基硅烷、丙基三乙酰氧基硅烷等。
当将式(3)的硅烷化合物与式(4)的疏水性硅烷化合物混合时，它们的重量比为0.01∶99.99-100.0且优选50∶50-95∶5。
通过给首层涂布涂敷组合物来制备固定层，通过将式(3)的化合物和任选的式(4)的化合物溶于稀释溶剂中来制备涂敷组合物。
稀释溶剂是有机溶剂、水或有机溶剂与水的混合物。有机溶剂优选是醇溶剂，诸如甲醇、乙醇、丙醇或丁醇；溶纤剂溶剂，诸如甲基溶纤剂；与水相容的任意有机溶剂，诸如丙酮类；或它们的任意混合物。由于稀释溶剂是与水相容的有机溶剂，所以硅烷低聚物易于共聚得到涂敷组合物且对环境有利。
用于形成固定层的涂敷组合物包括0.1-90wt％、优选0.1-50wt％的硅烷化合物。当硅烷化合物的用量低于0.1wt％时，不足以形成固定官能团；而当硅烷化合物的用量高于90wt％时，涂敷组合物不能施加到底物上且获得的涂敷层过厚而难以防止裂化。
根据本发明的一个优选实施方案，用包括硅烷低聚物与稀释溶剂的涂敷组合物来形成固定层，其中通过使带有固定官能团的硅烷化合物在水或含有水与有机溶剂的混合溶剂中共聚合来获得硅烷低聚物。稀释溶剂选自水、有机溶剂以及水与有机溶剂的混合溶剂组成的组。
根据本发明的另一个优选实施方案，可以通过将带有固定官能团的硅烷化合物与选自水和水与有机溶剂混合溶剂的稀释溶剂混合来获得涂敷组合物。硅烷化合物在水或含有水与有机溶剂的混合溶剂中共聚合而形成硅烷低聚物(oligomer)。
当带有作为固定官能团的氨基的式(3)化合物之一的氨基硅烷化合物在水中聚合时，获得了由下列式(5)代表的化合物 其中r是共聚度。
使式(3)化合物中官能团是氨基的氨基硅烷化合物与式(4)的疏水性硅烷化合物彼此聚合成由下列式(6)代表的氨基硅烷低聚物 其中R6与式(4)中所定义的相同；且s和t分别为共聚度。
为了提高反应速率，添加诸如乙酸、硝酸、盐酸等这样的任意的有机酸或无机酸催化剂以将涂敷组合物的pH调节至2-10。共聚合反应优选在0℃-100℃的温度下进行1-24小时。
硅烷低聚物维持稳定的反应相当速率而不会参与进一步的反应，因为如式(5)和(6)中所示，氨基端基通过涂敷用组合物中的氢键与羟基端基结合。
此外，根据本发明的其它优选实施方案，将带有固定官能团的硅烷化合物溶于水或含有水与有机溶剂的混合溶剂从而通过共聚合反应得到涂敷组合物中的硅烷低聚物水合物。
可以通过与形成首层相同的方法形成固定层。也就是说，可以使用诸如浸涂、喷雾、旋转涂敷或印刷这样的任意湿涂敷法，但并不限于它们。正如图1中所示，固定层的官能团与首层表面上存在的硅烷醇基反应。
涂敷的硅烷低聚物热固并缩合以提供带有三维交联结构的固定层。热固温度优选为100-300℃。当温度低于100℃时，不足以发生缩合反应；而当该温度高于300℃时，氨基迅速退化(degenerate)。
正如图2中所示，在底物1上形成的常规固定层是自组装单层。制备该自组装单层的时间期限延长且难以获得具有均匀密度的官能团。
本发明可以提供具有如图3中所示三维交联结构的固定层，从而提供均匀的官能团。此外，用相对短的时间制备具有高密度官能团的固定层。
所述的三维交联结构防止了在固定或洗涤步骤中使用溶剂洗涤时固定层的消失和生理物质的分离。因此，由于这种结构特性而改善了热稳定性和试剂稳定性。
在固定层与底物之间存在的首层改善了固定层与底物之间的结合并阻断了降低结合强度的任何碱性物质，从而稳定地保护了固定官能团。
通过分析激光束连续照射时从固定层荧光染料中发射出的光来测定固定基团的密度，其中所述的染料是异硫氰酸酯或琥珀酰亚胺醚活化的四乙基罗丹明-异硫氰酸酯(SCN-TMR)或异硫氰酸荧光素(FITC)。
密度分析结果表明本发明用于固定生理物质的底物带有均匀和高密度的极为稳定的固定官能团。
本发明还提供了通过使生理物质与底物上的固定官能团结合或通过使活化而带有官能团的生理物质结合在底物上并洗涤掉未反应的生理物质而形成预定图案而制备的生物芯片。所述的生理物质优选与固定层反应1-24小时。
本文的术语“生理物质”指的是来源于生物体及其等同物的生理物质或体外制备的生理物质。例如，它包括酶、蛋白质、抗体、细菌(microbe)、动物和植物细胞和器官、神经元、DNA和RNA且优选是DNA、RNA或蛋白质，其中所述的DNA可以包括cDNA、基因组DNA和寡核苷酸；所述的RNA可以包括基因组RNA、mRNA和寡核苷酸；且所述的蛋白质可以包括抗体、抗原、酶、肽等。
用于使生理物质在固定层上显示出图案的方法可以是光刻法、压电印刷法、微量吸移法、点样法(spotting)等中的任意方法。
下文参照实施例来具体地解释本发明。然而，不应将这些实施例在任何意义上理解为限定本发明的范围。
实施例1将3g的原硅酸四乙酯加入到包括90g乙醇与7g水的稀释溶剂混合物中并通过添加硝酸而将该体系的pH调节至pH为2以获得用于形成首层的涂敷组合物。将玻璃载玻片浸入所述的涂敷组合物中并给其涂敷该涂敷组合物且在200℃下加热至在玻璃载玻片上形成首层。将5g的3-氨基丙基三甲氧基硅烷与15g的水混合并在60℃下反应8小时而得到氨基硅烷低聚物水合物。将10g的氨基硅烷低聚物水合物溶于90g的乙醇中而得到用于形成固定层的涂敷组合物。将首层涂敷的玻璃载玻片浸入该涂敷组合物并给其涂敷该涂敷组合物且然后在120℃下热固60分钟而形成用于固定生理物质的底物。
实施例2将3g的原硅酸四乙酯和0.3g的双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷加入到包括90g乙醇与7g水的稀释溶剂混合物中并通过添加硝酸而将该体系的pH调节至pH为2以获得用于形成首层的涂敷用组合物。将玻璃载玻片浸入所述的涂敷组合物中并涂敷该涂敷组合物且在200℃下加热至在玻璃载玻片上形成首层。然后按照与实施例1中所述相同的方法获得用于固定生理物质的底物。
实施例3将3g的原硅酸四乙酯加入到包括90g乙醇与7g水的稀释溶剂混合物中并通过添加硝酸而将该体系的pH调节至pH为2以获得用于形成首层的第一种涂敷组合物。将19g的正丁醇锆溶于包括8g乙酰基丙酮与73g乙醇的稀释溶剂混合物中而得到用于形成首层的第二种涂敷组合物。将玻璃载玻片浸入重量比为9∶1的第一种涂敷组合物与第二种涂敷组合物的涂敷组合物混合物中并将其涂敷该涂敷组合物混合物且在200℃下加热至在玻璃载玻片上形成首层。将2.5g的3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶于7.5g水与90g乙醇的稀释溶剂混合物中并在60℃下反应8小时而得到用于形成固定层的含有氨基硅烷低聚物水合物的涂敷组合物。将首层涂敷的玻璃载玻片浸入所述的涂敷组合物中并涂敷该涂敷组合物、然后在100℃下热固60分钟，随后得到用于固定生理物质的底物。
实施例4将3g的原硅酸四乙酯加入到包括90g乙醇与7g水的稀释溶剂混合物中并通过添加硝酸而将该体系的pH调节至pH为2以获得用于形成首层的第一种涂敷组合物。将17g的异丙醇钛(titanium isopropoxide)溶于包括6g乙酰基丙酮与77g乙醇的稀释溶剂混合物中而得到用于形成首层的第二种涂敷组合物。将玻璃载玻片浸入重量比为9∶1的第一种涂敷组合物与第二种涂敷组合物的涂敷组合物混合物中并将其涂敷该涂敷组合物混合物且在200℃下加热至在玻璃载玻片上形成首层。然后按照与实施例3中所述相同的方法获得用于固定生理物质的底物。
实施例5将3g的原硅酸四乙酯加入到包括90g乙醇与7g水的稀释溶剂混合物中并通过添加硝酸而将该体系的pH调节至pH为2以获得用于形成首层的第一种涂敷组合物。将24g的正丁醇铝溶于包括10g乙酰基丙酮与66g乙醇的稀释溶剂混合物中而得到用于形成首层的第二种涂敷组合物。将玻璃载玻片浸入重量比为9∶1的第一种涂敷组合物与第二种涂敷组合物的涂敷组合物混合物并将其涂敷该涂敷组合物混合物，然后在200℃下加热至在玻璃载玻片上形成首层。然后按照与实施例3中所述相同的方法获得用于固定生理物质的底物。
实施例6将2.5g的氨基丙基三甲氧基硅烷加入到包括90g乙醇与7.5g水的混合溶剂中并在60℃下反应8小时而得到用于形成固定层的含氨基硅烷低聚物水合物的涂敷组合物。将玻璃载玻片浸入该涂敷组合物中并将其涂敷该涂敷组合物，随后在100℃下热固60分钟，然后获得用于固定生理物质的底物。
用于固定官能团的稳定性试验将按照本发明实施例1-6方法制备的用于固定生理物质的底物浸入100℃的沸水中6小时并用Au/Ag胶粒(获自Mitsubishi Material.Co.)的配制溶液染色。图4A和4B是浸入过程前(a)和经过6小时后(b)实施例1和2底物的照片。如图4A中所示，用于固定生理物质的实施例1底物上的染色程度在浸入沸水后(b)与浸入前(a)相比有轻度的下降。此外，如图4B中所示，实施例2底物的染色程度(b)几乎与浸入前(a)相同。就实施例6而言，染色程度下降。
固定官能团的密度测定将用于固定生理物质的实施例1-6的底物浸入100℃的沸水中1小时并用FITC的二甲基甲酰胺溶液标记该固定层。将激光束连续照射到该固定层上并通过ScanArray4000(由GSILUMONICS生产)检测从该层上FITC中发射出的光。表1显示其结果。
表1
一般来说，荧光强度越高，则固定基团越容易保留。可以看出本发明用于固定生理物质的底物可以保护稳定和高密度的固定官能团。
生物芯片的发光影象分析将用于固定生理物质的实施例1-6的底物浸入100℃的沸水中1小时并与带有15个碱基的寡核苷酸探针DNA反应以便将该DNA固定在表面上。随后将底物浸入含有用荧光染料Cy3(获自Mersham Pharmacia，Inc.)标记的靶DNA的样品溶液中并与该靶DNA反应，然后将其洗涤掉而获得DNA芯片。用激光束照射该DNA芯片并通过ScanArray4000(由GSI LUMONICS生产)检测从该DNA芯片上发射出的光。图5A和5B分别表示实施例1和本发明可以通过提供能够增进底物与固定层之间结合的首层而保护固定层。此外，所述的首层阻断了来源于底物的碱性物质以便使固定官能团保持稳定。本发明还提供了通过简单过程固定带有均匀和高密度的固定官能团的生理物质的底物。
实施例7将5g的3-氨基丙基三甲氧基硅烷与15g水混合并在60℃下反应8小时而得到氨基硅烷低聚物水合物。将10g的氨基硅烷低聚物水合物溶于90g的乙醇中而得到用于形成固定层的含氨基硅烷低聚物水合物的涂敷组合物。将玻璃载玻片浸入该涂敷组合物中并将其涂敷该涂敷组合物，然后在120℃下热固60分钟而获得用于固定生理物质的底物。
实施例8按照与实施例7中所述相同的方法获得用于固定生理物质的底物，但用3.55g的3-氨基丙基三甲氧基硅烷和1.45g的甲基三甲氧基硅烷替换3-氨基丙基三甲氧基硅烷。
实施例9按照与实施例7中所述相同的方法获得用于固定生理物质的底物，但用3.55g的3-氨基乙基三甲氧基硅烷和1.45g的甲基三甲氧基硅烷替换3-氨基丙基三甲氧基硅烷。
对比例1将0.1g的氨基丙基三甲氧基硅烷加入到9.9g的甲苯中而得到用于形成固定层的涂敷组合物。将玻璃载玻片浸入该涂敷组合物中并涂敷该涂敷组合物，随后在120℃下热固60分钟，从而得到用于固定生理物质的底物。固定官能团的密度测定将用于固定生理物质的实施例7-9和对比例1的底物用FITC的二甲基甲酰胺溶液标记。使激光束连续照射到固定层上并通过ScanArray4000(由GSI LUMONICS生产)检测从该层上FITC中发射出的光。表2显示其结果。
表2
一般来说，荧光强度越高，则固定基团越容易保留。正如表2中所示，实施例7-9的荧光强度显著超过对比例1的荧光强度。这表明本发明用于固定生理物质的底物带有一定密度的固定官能团。
尽管已经参照优选实施方案具体地描述了本发明，但是本领域技术人员会理解可以对本发明作各种修改和替换而不会脱离所附权利要求中所列的本发明的实质和范围。
权利要求
1.用于固定生理物质的底物，包括涂敷有首层和在该首层上的固定层的底物材料，所述的首层包括带有官能团且能够增进所述底物材料与固定层之间结合的化合物；且所述的固定层包括具有能够固定生理物质的官能团。
2.权利要求1所述的底物，其中所述的首层包括选自由下列式1和式2所代表的化合物及其混合物M(OR1)n(1)[M’(OR2)m]p(R3)q(2)其中M和M’各自独立地选自元素周期表4B、3A、4A和5A族元素组成的组；R1选自氢原子、C1-20烷基和C6-12芳族基团；R2选自氢原子、卤原子、C1-20烷基和C6-12芳族基团；R3是任选被C1-6取代基取代的亚甲基或苯基；n是3-4的值且根据M的化合价来决定；m是2-3的值且根据M’的化合价来决定；p是2-4的数值；且q是1-20的数值。
3.权利要求2所述的底物，其中所述的首层包括由式1代表的化合物。
4.权利要求3所述的底物，其中M选自Si、Zr、Ti、Al、Sn、In和Sb组成的组；且R1选自氢、甲基、乙基、丙基、丁基和苯基。
5.权利要求3所述的底物，其中所述的化合物选自四烷醇硅、三丁醇铝和四丁醇锆。
6.权利要求2所述的底物，其中所述的首层包括由式2代表的化合物。
7.权利要求6所述的底物，其中M’选自Si、Zr、Ti、Al、Sn、In和Sb组成的组；且R2选自氢、氯、甲基、乙基、丙基、丁基和苯基。
8.权利要求6所述的底物，其中所述的化合物选自1，4-双(三甲氧基甲硅烷基乙基)苯、双(三甲氧基甲硅烷基)己烷、双(三乙基氧基甲硅烷基)甲烷、1，9-双-(三氯甲硅烷基)壬烷、双(三正丁氧基锡)甲烷、双(三异丙氧基钛)己烷和双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷组成的组。
9.权利要求2所述的底物，其中所述的首层包括由式1和式2所代表的化合物的混合物，其中式(1)化合物与式(2)化合物的重量比在50∶50-95∶5的范围。
10.权利要求2所述的底物，其中所述的固定层包括式(3)的化合物Y-R4-Si(R5)3(3)其中Y随所述生理物质的端基的不同而改变且至少是一种选自氨基、醛、巯基和羧基组成的组的官能团；R4选自C1-20烷基、C6-20芳族基团、酯基和亚胺基组成的组；且R5选自羟基、C1-20烷氧基、乙酰氧基、卤素及其组合组成的组。
11.权利要求10所述的底物，其中所述的式(3)的化合物选自3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、2-氨基十一烷基三甲氧基硅烷、氨基苯基三甲氧基硅烷、N-(2-氨基乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷、3-巯基丙基三甲氧基硅烷、3-巯基丙基三乙氧基硅烷、4-三甲氧基甲硅烷基丁醛、4-三甲氧基甲硅烷基丁醛、羧甲基三甲氧基硅烷、羧甲基三乙氧基硅烷及其混合物组成的组。
12.权利要求1所述的底物，其中所述的固定层包括具有式(4)的疏水性硅烷化合物 其中R6选自C1-14烷基、C6-12芳族基团、取代的C6-12芳族基团和CX3组成的组，其中X是卤素；R7和R8各自独立地选自C1-14烷氧基、乙酰氧基、羟基和卤素组成的组；R9选自氢、C1-14烷基和C6-12芳族基团组成的组；且k是1-15的整数。
13.权利要求12所述的底物，其中R6是甲基、乙基或丙基；R7和R8各自独立地选自甲氧基、乙氧基、乙酰氧基和氯组成的组；且R9是甲基或乙基。
14.一种用于能够增进底物与固定层之间结合的首层的用涂敷组合物，该涂敷组合物包括稀释溶剂，其中溶解有选自由下列式1和式2所代表的化合物及其混合物M(OR1)n(1)[M’(OR2)m]p(R3)q(2)其中M和M’各自独立地选自元素周期表4B、3A、4A和5A族元素组成的组；R1选自氢原子、C1-20烷基和C6-12芳族基团；R2选自氢原子、卤原子、C1-20烷基和C6-12芳族基团；R3是任选被C1-6取代基取代的亚甲基或苯基；n是3-4的值且根据M的化合价来决定；m是2-3的值且根据M’的化合价来决定；p是2-4的数值；且q是1-20的数值。
15.权利要求14所述的涂敷组合物，其中所述的首层包括由式1代表的化合物。
16.权利要求15所述的涂敷组合物，其中M选自Si、Zr、Ti、Al、Sn、In和Sb组成的组；且R1选自氢、甲基、乙基、丙基、丁基和苯基。
17.权利要求15所述的涂敷组合物，其中所述的化合物选自四烷醇硅、三丁醇铝和四丁醇锆及其混合物组成的组。
18.权利要求14所述的涂敷组合物，其中所述的首层包括由式2代表的化合物。
19.权利要求18所述的涂敷组合物，其中M’选自Si、Zr、Ti、Al、Sn、In和Sb组成的组；且R2选自氢、氯、甲基、乙基、丙基、丁基和苯基。
20.权利要求18所述的涂敷组合物，其中所述的化合物选自1，4-双(三甲氧基甲硅烷基乙基)苯、双(三甲氧基甲硅烷基)己烷、双(三乙基氧基甲硅烷基)甲烷、1，9-双-(三氯甲硅烷基)壬烷、双(三正丁氧基锡)甲烷、双(三异丙氧基钛)己烷、双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷及其混合物组成的组。
21.权利要求14所述的涂敷组合物，其中所述的首层包括由式1和式2所代表的化合物的混合物，其中式(1)化合物与式(2)化合物的重量比在50∶50-95∶5的范围。
22.权利要求14所述的涂敷组合物，其中所述的有机溶剂是至少一种选自醇溶剂、溶纤剂溶剂和丙酮类组成的组的溶剂。
23.一种用于底物的固定层的涂敷组合物，该涂敷组合物包括含有水的稀释溶剂，其中溶解有选自由式(3)代表的化合物Y-R4-Si(R5)3(3)其中Y随所述生理物质的端基的不同而改变且至少是一种选自氨基、醛、巯基和羧基组成的组的官能团；R4选自C1-20烷基、C6-20芳族基团、酯基和亚胺基组成的组；且R5选自羟基、C1-20烷氧基、乙酰氧基、卤素及其组合组成的组。
24.权利要求23所述的涂敷组合物，其中R4是甲基、乙基、丙基或丁基；且R5是羟基、乙氧基或乙酰氧基。
25.权利要求23所述的涂敷组合物，其中所述的式(3)的化合物选自3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、2-氨基十一烷基三甲氧基硅烷、氨基苯基三甲氧基硅烷、N-(2-氨基乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷、3-巯基丙基三甲氧基硅烷、3-巯基丙基三乙氧基硅烷、4-三甲氧基甲硅烷基丁醛、4-三甲氧基甲硅烷基丁醛、羧甲基三甲氧基硅烷、羧甲基三乙氧基硅烷及其混合物组成的组。
26.权利要求23的涂敷组合物，其中所述的稀释溶剂基本上由水组成。
27.权利要求23的涂敷组合物，其中所述的稀释溶剂包括水和有机溶剂。
28.权利要求23的涂敷组合物，该涂敷组合物进一步包括溶于稀释溶剂中的疏水性硅烷化合物，该疏水性硅烷化合物具有式(4) 其中R6选自C1-14烷基、C6-12芳族基团、取代的C6-12芳族基团和CX3组成的组，其中X是卤素；R7和R8各自独立地选自C1-14烷氧基、乙酰氧基、羟基和卤素组成的组；R9选自氢、C1-14烷基和C6-12芳族基团组成的组；且k是1-15的整数。
29.权利要求28所述的涂敷组合物，其中R6是甲基、乙基或丙基；R7和R8各自独立地选自甲氧基、乙氧基、乙酰氧基和氯组成的组；且R9是甲基或乙基。
30.权利要求28所述的涂敷组合物，其中式(3)的化合物与式(4)的化合物的重量比为50∶50-95∶5。
31.一种包括固定在权利要求1所述底物表面上的生理物质的生物芯片。
32.权利要求31的生物芯片，其中所述的生理物质选自酶、蛋白质、DNA、RNA、细菌、微生物、动物和植物细胞及器官以及神经元组成的组。
33.一种制备用于固定生理物质的底物的方法，该方法包括通过在所述底物材料上涂敷首层涂敷组合物而在底物材料上形成首层，所述的首层涂敷组合物包括稀释溶剂，其中溶解有具有官能团且能够增进所述底物材料与固定层之间结合以形成首层涂敷的底物的化合物；且通过在所述首层上涂敷固定层涂敷组合物而形成固定层，所述的固定层涂敷组合物包括稀释溶剂，其中溶解有具有能够固定生理物质以形成固定涂敷底物的化合物。
34.权利要求33所述的方法，其中所述的首层涂敷组合物包括选自由下列式1和式2所代表的化合物及其混合物M(OR1)n(1)[M’(OR2)m]p(R3)q(2)其中M和M’各自独立地选自元素周期表4B、3A、4A和5A族元素组成的组；R1选自氢原子、C1-20烷基和C6-12芳族基团；R2选自氢原子、卤原子、C1-20烷基和C6-12芳族基团；R3是任选被C1-6取代基取代的亚甲基或苯基；n是3-4的值且根据M的化合价来决定；m是2-3的值且根据M’的化合价来决定；p是2-4的数值；且q是1-20的数值。
35.权利要求34所述的方法，其中M和M’各自独立地选自Si、Zr、Ti、Al、Sn、In和Sb组成的组；且R1选自氢、甲基、乙基、丙基、丁基和苯基；而R2选自氢、氯、甲基、乙基、丙基、丁基和苯基。
36.权利要求34所述的方法，其中所述的首层涂敷组合物包括由式1代表的化合物。
37.权利要求34所述的方法，其中所述的首层涂敷组合物包括由式2代表的化合物。
38.权利要求33所述的方法，其中所述的固定层涂敷组合物包括式(3)的化合物Y-R4-Si(R5)3(3)其中Y随所述生理物质的端基的不同而改变且至少是一种选自氨基、醛、巯基和羧基组成的组的官能团；R4选自C1-20烷基、C6-20芳族基团、酯基和亚胺基组成的组；且R5选自羟基、C1-20烷氧基、乙酰氧基、卤素及其组合组成的组。
39.权利要求33所述的方法，其中所述的固定层涂敷组合物包括具有式(4)的疏水性硅烷化合物 其中R6选自C1-14烷基、C6-12芳族基团、取代的C6-12芳族基团和CX3组成的组，其中X是卤素；R7和R8各自独立地选自C1-14烷氧基、乙酰氧基、羟基和卤素组成的组；R9选自氢、C1-14烷基和C6-12芳族基团组成的组；且k是1-15的整数。
40.权利要求33所述的方法，进一步包括在约100℃-约400℃的温度下加热所述首层涂敷的底物。
41.权利要求33所述的方法，进一步包括在约100℃-约300℃的温度下加热所述固定层涂敷的底物。
全文摘要
本发明提供了用于固定生理物质的底物。该底物包括底物材料，在该底物材料上形成的首层和在该首层上形成的固定层。所述的首层能够增强所述底物与所述固定层之间的结合。通过简便的方法可以使用于固定生理物质的底物能够提供具有稳定、均匀和高密度的固定层。
文档编号G01N33/544GK1407116SQ02130479
公开日2003年4月2日 申请日期2002年8月21日 优先权日2001年8月21日
发明者徐康一, 南宫吉纳, 吴恩圭, 崔荣镀, 李仁镐, 朴泰俊, 金宪秀 申请人:三星Sdi株式会社