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专利名称：一种果蔬组织及其相关制品中还原型抗坏血酸和异抗坏血酸的分离测量的方法
技术领域：
本发明属于分析领域，涉及一种果蔬组织及其相关制品中还原型抗坏血酸和异抗坏血酸的分离测量的方法。
背景技术：
维生素C (以下简称Vc)，又叫抗坏血酸，是一种己糖衍生物。维生素C具有很高的医用价值，是维持机体正常生命活动所必需的一类小分子有机化合物，可参与体内氧化还原反应和氧化还原信号传递与调节，Vc具有解毒作用，人体若严重缺乏会引起坏血病。人体自身不能合成维生素C，必须从食物中摄取。维生素C广泛存在于新鲜水果、蔬菜中。因此在果蔬Vc代谢、氧化还原信号传递等生理过程的研究及种质资源研究、品种育种、贮藏加工和果品质量监测中，经常需要测定Vc含量。Vc包括还原型Vc、氧化型Vc和异抗坏血 酸，新鲜果品中以还原型Vc为主。现有的Vc测定方法主要是全量测定法(测定还原型Vc和氧化型Vc的总含量，如突光法和2，4- 二硝基苯餅法等)和还原型Vc测定法(如2，6- 二氯親酌■滴定法、电位滴定法、碘滴定法、钥蓝比色法、碘酸钾萃取分光光度法等)两类。这些方法操作繁杂、容易受到果蔬组织中一价铜离子、亚铁离子、单宁、半胱氨酸、谷胱甘肽、维生素E、色素等物质的影响，分析测量不精确，而且不能很好的区分还原型抗坏血酸、氧化型抗坏血酸和异抗坏血酸。近几年发展起来的用气相色谱、液相色谱分析鉴定抗坏血酸的方法能够克服传统化学方法的不足，尤其是高效液相色谱被广泛的应有到抗坏血酸的分析测量中，通过对材料的衍生化处理，高效液相色谱能精确的分析鉴定还原型抗坏血酸和氧化型抗坏血酸。尽管这些方法能够精确的分析鉴定抗坏血酸，但是这些方法都比较费时，抗坏血酸是一种不稳定的活泼分子，离体条件下极易被氧化降解，造成分析测量的误差。一种可靠的抗坏血酸测量方法应该能够准确的测量植物组织中抗坏血酸的含量，同时要能够鉴定还原型抗坏血酸、氧化型抗坏血酸和异抗坏血酸。

发明内容
本发明的目的是提供一种果蔬组织及其相关制品中抗坏血酸和异抗坏血酸的分离测量的方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种果蔬组织及其相关制品中抗坏血酸和异抗坏血酸的分离测量的方法，包括如下步骤(I)备料以新鲜的果蔬组织或其制品为原料，在液氮中研磨成匀浆；(2)提取以料液比1:5-10 (g/ml)的比例加入提取还原液，35_40°C提取60分钟，得到含有抗坏血酸提取液，提取液经过离心机以5000r/min的速度进行固液分离，获得上清液；残渣用相同的条件重复提取一次，合并两次上清液；
(3)上清液用0. 45微米尼龙膜过滤，过滤液作为色谱分析的待测样品；(4)取5-lOy L的上述样品上色谱柱进行分离测量，色谱条件是采用TSKgel-Amide-80色谱柱(4. 6mmX 100mm)，流动相为乙睛(B相)和0. 1%的酸溶液(A相)，梯度洗脱条件0-7min B相A相体积比为90:10，7_8min B相A相体积比为20:80，8-13min B 相:A 相体积比为 20:80，13_14min B 相:A 相体积比为 90:10，14_20min B 相:A相体积比为90:10 ;流速为0. 6-0. 8mL/min，柱温为25_30°C，检测波长为244nm ；(5)利用外标法根据标准曲线计算样品还原性抗坏血酸和异抗坏血酸的含量。所述的提取还原液是由4-7% (g/100ml)偏磷酸，2mM磷酸三-(￠-氯乙基)酯(TCEP)和2mM乙二铵四乙酸钠组成。所述的0. 1% (V/V)的酸溶液所用的酸包括甲酸、乙酸或三氟乙酸。
有益效果本发明提供一种可靠的抗坏血酸测量方法，能够有效的分离水果、蔬菜及其相关制品中还原型抗坏血酸和异抗坏血酸,准确的测量植物组织中还原型抗坏血酸和异抗坏血酸的含量。传统的维生素C的测量方法不能将抗坏血酸和异抗坏血酸有效的分开，因此测量结果受到异抗坏血酸的干扰。本发明开发采用的正相亲水色谱柱的分离条件，能够有效的将还原型抗坏血酸和异抗坏血酸分离开来(图1)，并利用外标法对样品中的含量进行定量分析。该放方法简便易行，可广泛的应用于水果、蔬菜及其相关的制品的抗坏血酸分析测试中。


图I供试样品的色谱分离图(峰I为异抗坏血酸，峰2为还原性抗坏血酸)。图2为还原性抗坏血酸的标准曲线。图3为异坏血酸的标准曲线。
具体实施例方式下面通过对具体实施例的描述，对本发明作进一步详细说明。取带皮鲜梨4g，在液氮中研磨成匀浆后转移到20mL含有6. 25%偏磷酸、2mM磷酸三-(P -氯乙基)酯和2mM乙二铵四乙酸钠的提取还原液中，35°C条件下提取60min,经过5000r/min转速离心，分离获得上清液，残渣用相同的条件重复提取一次，合并两次上清液，以0.45微米的尼龙膜过滤上清液。取5 ii L过滤液，上亲水相互作用色谱分析。亲水相互作用色谱采用TSKgel-Amide-80色谱柱(4. 6mmX 100mm)，流动相为乙睛(B)和0. 1%的三氟乙酸溶液(A)，梯度洗脱条件0-7min(B:A=90:10，V/V), 7-8min (B:A=20:80, V/V)，8-13min(B:A=20:80,V/V)，13_14min (B:A=90:10，V/V)，14_20min (B:A=90:10，V/V);流速为0. 7mL/min，柱温为30°C，检测波长为244nm。色谱分离图如图I所示，峰I为异抗坏血酸，峰2为抗坏血酸。准确称取0. 0020g经60°C干燥的还原性抗坏血酸(Sigma Co.)，用上述提取液溶解定容至IOOOml容量瓶中作为标准母液，分别取l、2、3、4、5、6、7、8、9、10ml标准母液放入IOml容量瓶，并用上述提取液定容。将配制好的上述不同浓度的标准液经0. 45 y m膜过滤后上亲水相互作用色谱分析，并根据吸收峰面积与浓度关系制备标准曲线，见图2。准确称取0. 0020g异抗坏血酸(Sigma Co.)按同样的方法制备标准曲线,见图3。根据所测供试样品的色谱分离图(图1)，及标准曲线(图2、图3)，计算供试样品中还原型抗坏血酸和异抗坏血酸的含量分别为23. 5mg/100gFff,0. 93mg/100gFW。
权利要求
1.一种果蔬组织及其相关制品中还原性抗坏血酸和异抗坏血酸的分离测量的方法，其特征在于包括如下步骤 (1)备料以新鲜的果蔬组织或其制品为原料，在液氮中研磨成匀浆； (2)提取以料液比1:5-10的比例加入提取还原液，35-40°C提取60分钟，得到含有抗坏血酸提取液，提取液经过离心机以5000r/min的速度进行固液分离，获得上清液；残渣用相同的条件重复提取一次，合并两次上清液； (3)上清液用0.45微米尼龙膜过滤，过滤液作为色谱分析的待测样品； (4)取5-10y L的上述样品上色谱柱进行分离测量，色谱条件是采用TSKgel-Amide-80色谱柱，流动相为B相乙睛和A相0. 1%的酸溶液，梯度洗脱条件0_7min B相A相体积比为90:10, 7_8min B相A相体积比为20:80,8_13min B相A相体积比为20:80，13-14min B相:A相体积比为90:10，14_20min B相:A相体积比为90:10 ;流速为0. 6-0. 8mL/min，柱温为25_30°C，检测波长为244nm ； (5)利用外标法根据标准曲线计算样品还原性抗坏血酸和异抗坏血酸的含量。
2.根据权利要求I所述的一种果蔬组织及其相关制品中抗坏血酸和异抗坏血酸的分离测量的方法，其特征在于步骤(2)中所述的提取还原液由4-7%偏磷酸，2mM磷酸三-(￠-氯乙基)酯和2mM乙二铵四乙酸钠组成。
3.根据权利要求I所述的一种果蔬组织及其相关制品中抗坏血酸和异抗坏血酸的分离测量的方法，其特征在于步骤(4)所述的0. 1%的酸溶液所用的酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸。
全文摘要
本发明涉及一种果蔬组织及其相关制品中还原型抗坏血酸和异抗坏血酸的分离测量的方法。包括以新鲜的果蔬组织或其制品为原料，在液氮中研磨成匀浆,通过提取还原液提取、过滤得到含维生素C的待测样品，以TSKgel-Amide-80亲水柱为色谱，以乙睛和0.1%的酸溶液为流动相，在244nm下对抗坏血酸和异抗坏血酸进行分析。本发明所述的方法重复性好，简便易行，能有效的分离测量抗坏血酸和异抗坏血酸，可广泛的应用于水果、蔬菜及其相关制品的抗坏血酸分析测试。
文档编号G01N30/02GK102749394SQ20121018472
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月6日 优先权日2012年6月6日
发明者吴俊 , 张全军, 张绍铃, 张虎平, 秦改花, 陶书田, 黄文江, 齐开杰 申请人:南京农业大学