专利名称：双层的制作方法
技术领域：
本发明涉及双层如脂质双层，还涉及制备双层的方法，以及双层的用途。
背景技术：
人工平面脂质双层充当生物膜的简化模型，并广泛用于离子通道和蛋白孔的电学表征(Mueller, P. et al. , 1962. Nature 194, 979-980; White, S. H. 1986. ed. Miller,C. Plenum Press:New York)。膜片钳还用来研究生物膜，例如膜片钳常用于单通道记录(SCR) (Sakmann, B. &Neher, E. 1984. Annual Review of Physiology 46，455-472)。使用的其他方法包括离体膜片法(excised-patch)、尖端浸润法(tip-dip)和芯片(on-chip)法。 整体细胞的膜片钳是检查通道的通用且灵敏的方法，但非�：氖鼻依眩⑶页Ｓ捎谙赴さ囊熘市灾识丛踊Ｓ肫湎喾矗斯て矫嬷仕憧刂葡低车淖槌桑⑶夷芄挥糜谘芯看炕牡鞍�。通常通过涂布(其中将脂质在有机溶剂中的溶液直接施用至分隔两个水性部分的孔(Mueller, P. et al. , 1962. Nature 194, 979-980; White, S. H. 1986. ed. Miller,C. Plenum Press:New York)或Langmuir-Blodgett技术的变体(其中使两个空气/水单层升高过孔(Montal, M. & Mueller, P. 1972. Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 69, 3561-3566))而形成平面脂质双层。尽管得到广泛使用，但是平面脂质双层难以制备，并且其短暂的寿命也限制了其在很多情况下的应用。也曾提出基于乳液的形成双层的可选方法(Tsofina, L. M. et al. , 1966. Nature212，681-683)，其中在浸入脂质在油中的溶液中的水性表面之间生成双层。当浸入不混溶的脂质/油溶液中时，水性表面自发地自组装成脂质单层(Cevc，G. 1993. Phospholipidshandbook, ed. Cevc, G. , Marcel Dekker, NewYork) ; Seddon, J. M. & Templer, R. H. 1995.eds. Lipowsky, R. & Sackmann, E. , Elsevier, Amsterdam, Oxford),并且当使来自两个水性组分的单层相接触时，它们能够像“拉链”那样一起形成脂质双层(T Tien, H.T.1974. M. Dekker, New York;Fujiwara, H. et al. , 2003. Journal of Chemical Physics119,6768-6775)。最近的研究表明，微流体流(Malmstadt, N. et al. , 2006. Nano Letters
6,1961-1965;Funakoshi, K.et al. , 2006. Analytical Chemistry 78, 8169-8174)和液滴(Funakoshi, K. et al.,2006.Analytical Chemistry 78,8169-8174;Holden, M. A. etal. , 2007. Journal of the American Chemical Society p8650_5)能够在脂质/ 油溶液中接触，从而生成适合于例如单通道记录试验的双层。近来，在前的专利申请即公开号W02009024775(A1)描述人工脂质双层的制备，通过将水合的支持物(例如水凝胶)和亲水体(例如水性液滴)浸入脂质在油中(lipid-in-oil)的溶液中，由此在水合的支持物与亲水体之间形成稳定的人工双层。此类双层可用于研究嵌入该双层中的经洗涤剂增溶的蛋白。但是，这限制可成功研究的蛋白的种类。
发明内容
本发明的目的是改进双层中的膜组分的分析和研究。本发明的第一方面提供一种制备双层的方法，所述方法包括
(a)提供浸于疏水介质中的水合的支持物和亲水体，其中在所述疏水介质与所述亲水体之间的界面上形成两亲分子的第一单层，并且在所述疏水介质与所述水合的支持物之间的界面上形成两亲分子的第二单层；和(b)使所述第一单层与所述第二单层接触以形成两亲分子的双层，其中在所述水合的支持物中和/或上，和/或在所述亲水体中提供包含细胞膜组分的至少部分的细胞膜；从而在形成所述双层期间或之后将细胞膜的组分并入所述双层中。令人惊讶地，将细胞膜与水性组分(水合的支持物和/或疏水体)合并获得包含至少一些细胞膜组分的双层。因此，可从细胞膜碎片或整个的完整细胞膜或纯化的真核细胞膜组分容易地在双层中重建任何膜或所关注的膜蛋白。这允许通过例如电记录或荧光显微镜法直接体外表征这样的膜蛋白。这不同于现有技术，其通常包括将纯化的膜蛋白或脂蛋白体并入已有的双层中，而不是直接使用细胞膜。因此，本发明的方法不仅自发地形成两亲分子的双层，而且自发地从所述水合的支持物和/或所述亲水体并入所述细胞膜组分。本发明的有利之处在于，膜组分易于并入双层中用于研究，并且需要最少量的样品制备。例如，利用本发明的方法，可将任何膜蛋白重建在双层中。具体地，所述技术允许将源于膜制备物的真核细胞膜蛋白重建在双层中。迄今，已将真核细胞膜组分并入人工双层中。但是，这些实验需要靶蛋白的基于洗涤剂的冗长纯化过程，以及在脂蛋白体中的重建和/或脂蛋白体与双层的融合。这些步骤的每一个都是困难的。因此，允许容易地将这样的真核细胞膜并入人工双层中的方法特别有益。真核细胞膜蛋白及其他膜组分的直接重建允许体外研究之前通过现有技术不可能实现的真核细胞膜蛋白功能以及研究除了蛋白之外的膜组分。与用于研究细胞膜蛋白及其他膜组分的常规方法相比，使用的方便性赋予显著更大的用于高通量的可能性。所述方法的另一益处在于，由于高效的重建而需要极少量的细胞材料，例如，每双层可以需要小于I个细胞。可使用低表达水平的膜蛋白，避免需要开发稳定表达所关注膜蛋白的细胞系(例如，在整体细胞膜片钳中)。此外，不需要活细胞，这允许长期储存膜蛋白样品(膜材料)将来使用。本发明提供的有利之处是直接单分子测量或天然细胞膜组分的大量测量，这允许探究所关注分子的结合机制。有利地，不需要在除了它们天然脂质环境之外的表面活性剂或洗涤剂中制备用于研究的细胞膜组分。例如，不需要为了膜蛋白重建而预先制备特定的脂蛋白体(含蛋白的脂质囊泡)。有利地，本发明允许研究细胞膜组分如膜蛋白，其中在真核表达系统中进行蛋白的功能表达、翻译后修饰并且不需要洗涤剂纯化，由此可保持蛋白的功能性。在双层中重建所关注的膜蛋白看起来不改变活性。在整个突出的重建步骤中，膜蛋白的胞质蛋白结构域保持在水性环境中。此外，并未使蛋白离开其天然的脂质包埋的环境，这不同于洗涤剂纯化方法，其中由于跨疏水膜的结构域或亲水结构域的蛋白变性，蛋白可能丧失其天然的行为。真核细胞膜或包含所关注的膜组分(例如膜蛋白)的膜碎片的直接重建消除通常的观点细菌中异源蛋白的表达对于将足量的蛋白从表达系统转移至人工脂质双层是必须的。例如，真核细胞系中的表达允许进行翻译后修饰，这据证实是真核细胞膜蛋白的正确折叠、寡聚和功能所必需的。本文中在谈及使两亲分子的单层接触以形成双层时所使用的术语“接触(contacting) ”或“接触(contact) ”应理解为表示实际的物理接触,和/或足够接近以允 许两亲分子双层的组装而不分离两亲分子单层。提及“浸于”或“浸入”时，浸入可以是部分或完全浸入。提及“膜蛋白”时，该术语包括跨膜蛋白、整合膜蛋白和外周膜蛋白，以及膜相关或膜锚定蛋白。所述膜蛋白可来自任何生物体和任何膜。细胞膜组分可包括典型地存在于细胞膜(包括内膜，例如亚细胞细胞器和病毒膜)上或中的任何组分，例如脂质、肽、蛋白和糖。“纯化的膜组分”可包括利用洗涤剂纯化的膜相关蛋白或人工脂质。在步骤(a)中，提供浸于疏水介质中的水合的支持物和亲水体，其中在所述疏水介质与所述亲水体之间的界面上形成两亲分子的第一单层，并且在所述疏水介质与所述水合的支持物之间的界面上形成两亲分子的第二单层。由于在所述亲水体上和/或在所述疏水介质中提供两亲分子，从而在所述疏水介质与所述亲水体之间的界面上形成两亲分子的第一单层。由于在所述水合的支持物上和/或在所述疏水介质中提供两亲分子，从而在所述疏水介质与所述水合的支持物之间的界面上形成两亲分子的第二单层。在一实施方案中，在所述疏水介质中提供两亲分子。因此，当各自置于包含两亲分子的疏水介质中时，两亲分子的第一和第二单层可在所述水合的支持物和所述亲水体上自组装。在另一实施方案中，在所述亲水体和/或所述水合的支持物上提供两亲分子。因此，当各自置于所述疏水介质中时，两亲分子的第一和第二单层可从所述水合的支持物和亲水体自组装。可在所述水合的支持物和/或所述亲水体浸入所述疏水介质中之前或之后提供两亲分子。例如，可在两亲分子添加至所述疏水介质之前或之后，将所述水合的支持物和所述亲水体添加至所述疏水介质中。在一优选实施方案中，在所述水合的支持物和所述亲水体浸入所述疏水介质中之前，将两亲分子添加至所述疏水介质。可以任何顺序将所述水合的支持物和所述亲水体浸入所述疏水介质中。在一优选实施方案中，在所述亲水体浸入所述疏水介质中之前，将所述水合的支持物浸于所述疏水介质中。在另一实施方案中，在将所述亲水体浸于所述疏水介质中的同时将所述水合的支持物浸于所述疏水介质中。在一实施方案中，在所述亲水体浸入所述疏水介质中之后，将所述水合的支持物浸于所述疏水介质中。可在形成所述双层之后，在所述水合的支持物中和/或所述亲水体中提供包含细胞膜组分的细胞膜。可选地或另外，可在形成所述双层之前，在所述水合的支持物中或上，和/或在所述亲水体中提供包含细胞膜组分的细胞膜。因此，可首先形成所述双层，然后使其与细胞膜接触。或者，可在形成所述双层的同时加入包含细胞膜组分的细胞膜。可通过在添加疏水介质之前将细胞膜层铺于所述水合的支持物上来提供所述细胞膜。作为备选或附加方案，可在形成亲水体时将细胞膜并入所述亲水体中，或者可在形成亲水体后将细胞膜注入所述亲水体中。作为备选或附加方案，可在形成水合的支持物时将细胞膜并入所述水合的支持物中，或者可在形成水合的支持物后将细胞膜注入所述水合的支持物中。例如，在其中所述水合的支持物包含水凝胶的实施方案中，可在凝固前将细胞膜混合入水凝胶中，或者可在凝固后将其层铺于水凝胶上。在其中所述水合的支持物是玻璃或相似的固体基底的实施方案中，可将细胞膜置于玻璃或相似的固体基底的上表面上。 本文中所有提及的细胞膜是指包含细胞膜组分的细胞膜。在一实施方案中，步骤(a)包括 提供水合的支持物； 通过将细胞膜层铺于所述水合的支持物上，或者通过以其中细胞膜混合入所述水合的支持物中的形式提供所述水合的支持物来提供细胞膜；然后 将所述支持物浸入包含两亲分子的疏水介质中，由此在所述疏水介质与所述水合的支持物之间的界面上形成两亲分子的单层；然后 将亲水体浸入所述疏水介质中，由此在所述疏水介质与所述亲水体之间的界面上形成两亲分子的单层。在此实施方案中，所述水合的支持物优选包含水凝胶，例如琼脂糖。所述亲水体优选为水性液滴，其可被移液至所述疏水介质中。所述疏水介质优选为油。所述两亲分子优选为脂质，在所述疏水介质中以脂质在油中的溶液的形式提供。所述细胞膜优选为在水溶液中提供的细胞膜碎片或完整的细胞，其可与水凝胶混合或者被移液至所述水合的支持物上。所述细胞膜组分可提供为整体的细胞膜或细胞膜碎片，或者为亚细胞膜制备物，或者为完整或破碎的亚细胞细胞器。细胞膜碎片可源于细胞的质膜或亚细胞区室。细胞膜或其碎片可制备为粗提取物，或者经过纯化。所述细胞膜组分可以是源于细胞膜碎片的脂质体的形式。细胞膜组分还可提供为源于经纯化的组分(例如，洗涤剂增溶的蛋白)的脂质体，并且还可额外地提供合成脂质以用于并入所述双层中。除了或替代细胞外膜，亚细胞结构或细胞器的细胞膜如线粒体膜和内质网，可并入所述双层中。在一有利实施方案中，所述细胞膜是真核细胞膜。如上所述，之前无法容易且直接地将真核细胞膜并入人工双层中。令人惊讶地，本发明提供实现此目的的方法。在本发明中，还可将原核细胞膜并入所述双层中。在本发明中，可将病毒组分如病毒包膜蛋白并入所述双层中。
所述细胞膜可源于原代细胞的直接制备物。所述细胞膜可源于从真核生物收获的组织，例如临床来源哺乳动物组织(例如心脏组织、脑组织、神经组织、肝组织、肾组织、血液细胞)。所述组织可包括健康组织或者与疾病相关的病理组织(例如癌组织、受损的心脏组织、血液细胞)。通过细胞膜的并入，可将膜蛋白，例如真核细胞膜蛋白，包括寡聚蛋白和单多肽蛋白，如离子通道；受体；孔；抗原；酶；以及转运蛋白并入所述双层中。所述膜蛋白可在膜的外周，即仅在一定程度上插入脂质双层，或者是跨双层包埋的，这可意味着单次或多次插入脂质双层。包含细胞膜组分的细胞膜可包含蛋白，例如膜 蛋白。包含细胞膜组分的细胞膜可包含一种或多种离子通道。源于真核细胞(例如哺乳动物细胞)的细胞膜可包含内源表达的膜蛋白，和/或在细胞中通过重组方式表达的蛋白，或者由病毒核酸表达的蛋白。所关注的蛋白可在细胞的质膜或亚细胞膜或细胞器膜中过表达。源于原核生物的细胞膜可包含内源膜蛋白，或者通过重组方式表达的外源膜蛋白，例如真核细胞膜蛋白。源于病毒成分如病毒包膜的细胞膜可包含病毒蛋白，或者源于病毒的宿主细胞的蛋白，或者来自宿主或病毒的其他膜组分。所述细胞膜可包含来自任何真核细胞系如任何哺乳动物细胞系，例如HEK293、SupTU CHO、Jurkat细胞或昆虫细胞例如Sf9，以及单细胞真核细胞如酵母(酿酒酵母(S. cerevisiae)和其他酵母)的内源表达的，或者通过重组方式表达的膜蛋白。可调节内源膜蛋白的表达水平以上调或下调所述蛋白在细胞膜中的量或浓度。可通过制备特定生长条件下的细胞培养物，或通过添加调节基因表达水平的物质来调节所述蛋白的表达。可通过控制细胞环境(例如温度或者环境气体或化学品的浓度)来调节所述蛋白的表达。细胞膜组分可直接从完整的整体细胞膜并入。细胞膜组分可从细胞膜碎片并入。可通过任何以下公知方法产生细胞膜碎片I.低渗裂解2.冷冻-解冻3.超声处理4.温和的洗涤剂5.膜的酶促消化6.膜的机械破裂7.生物学产生膜碎片下文更详细地描述这些技术。在本发明方法的步骤(a)中形成的单层中，所述两亲分子在所述亲水体和所述水合的支持物的表面上的排列为它们的亲水基团(或“头”)朝向水界面，并且它们的疏水基团(或“尾”)远离水界面。所述两亲分子在单层中的取向意味着当所述单层接触时形成双层。用于本发明的两亲分子可以是脂质分子，特别地，可使用表面活性剂分子。脂质分子可选自包括脂肪酰(fatty acyl)、甘油脂质、甘油磷脂、鞘脂、留醇、异戊烯醇脂质、聚酮化合物、磷脂和糖脂的组。所述脂质可源于细胞膜。所述脂质可包括下组中的任何物质，所述组包括甘油一油酸酯；1，2_ 二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC) ;1，2- 二植烷酰-sn_甘油-3-磷脂酰胆碱(DPhPC);棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC) ; I-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE) ; I-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺和I-棕榈酰-2-油酰磷脂酰甘油(P0PE/P0PG)混合物；或者上述物质的混合物。可将荧光和非荧光探针并入疏水或亲水介质中。例如，可通过水性亲水体和/或水合的支持物通过囊泡将亲脂荧光电位染料(例如di-8-ANEPPS)并入所述双层中。单层中的两亲分子可以为相同或不同的类型。例如，双层的每个单层可包含不同类型的两亲分子，从而产生不对称的双层。
或者，每个单层可包含相同类型的两亲分子，或者不同类型的两亲分子的混合物。可将疏水化合物添加至所述疏水介质或所述水合的支持物或亲水体，包括例如，用于调节膜蛋白功能的亲脂性激动剂和拮抗剂。所述水合的支持物可包含固体或半固体基底。本文使用的术语“固体”和“半固体”具有本领域技术人员理解的普通含义。本质上，术语“固体”是指刚性且抗形变的基底，而“半固体”是指性质介于固体和液体之间的基底。优选地，半固体基底具有一定程度的柔性，但其刚性足以在置于容器中时保持其形状，而不会立即转变为容器的形状。半固体基底的实例是凝胶。所述水合的支持物可以是亲水的。所述水合的支持物可包含能够在脂质在油中的溶液下保持水层的任何亲水基底。或者，所述水合的支持物也可以不是亲水的，并且脂质单层可通过将脂质分子连接至表面而形成，例如，所述支持物的表面可以是这样的经修饰的脂质与表面反应并结合以形成单层。所述水合的支持物可包含亲水凝胶。优选地，若在两亲分子的存在下置于疏水介质中，两亲分子的单层会在所述水合的支持物的表面上自组装。所述水合的支持物可以是多孔或无孔的。优选所述水合的支持物是多孔的。所述水合的支持物可以是水凝胶。水凝胶可以是化学交联或光致交联的。所述水合的支持物可以是部分或基本上透明的。或者，所述水合的支持物主要是不透明的。所述水合的支持物可以是蛋白或分析物分离凝胶，例如电泳凝胶。分离凝胶可包含例如依据其大小、分子量或离子性质而分离的蛋白、DNA或其他样品。所述水合的支持物可包括任何厚度的基底，优选约Inm-约10cm，更优选约I ii m-约 Icm,最优选约 100 u m-约 1cm。所述水合的支持物可包含选自粗琼脂、壳聚糖、明胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、交联的聚乙二醇、硝化纤维素、聚碳酸酯、阳极化(anodisc)材料、聚醚砜、乙酸纤维素、尼龙、高氟化树脂(Naphion)材料、中孔二氧化硅、水和玻璃，或者上述物质的组合的组中的任何物质。所述亲水体可以是液体、固体或半固体或上述形式的混合物。优选地，所述亲水体包含水溶液的液滴，例如水。在所述亲水体是水溶液的液滴的情况下，其优选具有约5nm-10cm或更大的直径,优选I ii m-lmm。在一实施方案中，液滴的直径为约100 ii m。所述亲水体可包含水合的固体或半固体支持物/基底。所述亲水体可包含水凝胶，例如水合琼脂糖。所述亲水体可包含水性细胞膜脂质体。可控制所述亲水体和/或所述水合的支持物的组成以包含正确的盐来传输电流，可包含，例如NaCl、KCl、MgCl2和/或其他盐。所述亲水体还可包含常规的缓冲液以控制pH,例如Bis-tris、Tris、Hepes、磷酸钠和/或磷酸钾。出于其他原因，例如使蛋白稳定、控制静电相互作用、控制跨双层的渗透梯度和/或激活荧光探针，也可包含盐。所述亲水体和/或水合的支持物可包含变化量的其他组分，例如膜蛋白功能的激动剂或拮抗剂，或者蛋白辅因子，糖例如蔗糖，或者可用来稳定渗透胁迫的聚合物，氨基酸，肽，核酸，荧光或非荧光探针，化学剂/药物，染料，微球或珠。所述亲水体还可包含变性剂，例如脲或胍HCl。可在双层形成和/或细胞膜并入之前或之后，加入其他/额外的组分。所述亲水体和/或水合的支持物可包含在与水混合的痕量有机溶剂(例如，乙醇、甲醇、DMSO、DMF或氯仿与水的混合物)中的低溶解性小分子化合物。
所述疏水介质可以是油。所述油可以是烃，其可以是支化或非支化的，也可以是取代或未取代的。例如，所述烃可具有5-20个碳原子，更优选10-17个碳原子。适合的油包括烷烃或烯烃，例如十六烷、癸烷、戊烷或角鲨烯，或氟化的油、或基于硅酮的油、或四氯化碳。在一实施方案中，所述油是正烧烃。所述疏水介质可以是脂质在油中的溶液，即在所述油中提供两亲脂质分子。优选地，所述脂质在油中的溶液在油中包含约lmg/ml-约30mg/ml的脂质。优选地，所述脂质在油中的溶液包含约5mg/ml的脂质。优选地，脂质/油溶液包含磷脂，例如磷酸胆碱脂质，如正烷烃(例如C10-C17正烧烃，如正十六烧(C16))中的1，2- 二植烧酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)。可通过提供既疏水又疏油的分子(例如氟化的油)，或者疏水和疏油的脂质来提
供第三相。除了细胞膜提供的任何蛋白之外，额外的蛋白也可插入所述双层中。所述蛋白可以是已知的膜蛋白，或者水溶性蛋白。所述额外的蛋白可以是纯化的。可按照在前专利公布W02009024775中公开的方法来插入额外的蛋白。所述双层可用来检测与该双层中的两亲分子或者该双层中的膜相关蛋白相互作用的化合物/分析物。与所述蛋白或所述两亲分子的相互作用可通过所述分析物/化合物跨所述双层的特异性或非特异性转运，这可由所述蛋白或其他膜组分如糖等，或者由所述两亲分子介导。或者，化合物/分析物可与所述蛋白或所述双层相互作用以产生物理、光学、电学或生物化学变化。这样的相互作用可通过许多不同的方式进行检测，包括但不限于视觉变化、比电容变化，或者所述双层中或附近的荧光标记的分子的激活。具有并入的膜组分的双层可用来研究在该双层处、在该双层中或跨该双层所发生的过程。所述双层可用来研究膜组分行为。所述双层可用来检测与在该双层中重建的膜组分相互作用的蛋白或分子。所述双层可用来研究和/或筛选细胞膜-蛋白；研究和/或筛选与重建的膜相互作用的分析物；和/或研究和/或筛选与含有源自不同细胞类型的重建的膜的双层相互作用的化合物。所述双层可用来研究该双层中的膜相关蛋白跨膜转运分子的能力。例如，可利用电压研究、质谱法、酶技术如ELISA、或者利用荧光或放射性标记的底物来测定被跨膜转运(通过蛋白或简单地未介导的跨双层转运)的分子的量。所述双层可用来研究双层的力学变化对该双层中的蛋白或对该双层自身的影响。可研究的力学变化包括，例如膜曲率、侧向力、表面张力等的变化。可通过将要测试、研究和/或用于筛选的化合物/分析物置于所述亲水体和/或所述水合的支持物和/或所述疏水介质中而将其引入所述双层中。若包含在所述亲水体中，则所述化合物/分析物可在形成该亲水体时被并入，或者可后来加入，例如，注入形成的亲水体中。相似地，若所述化合物/分析物在所述水合的支持物中，则其可在形成所述水合的支持物时被并入，或者后来加入。在一实施方案中，所述水合的支持物可以是包含用于分析的蛋白(分析物/化合物)的蛋白分离凝胶或膜。例如，样品可以是包含根据大小而分离的蛋白的聚丙烯酰胺凝胶。在此实施方案中，所述分析物/化合物通过所述水合的支持物而引入所述双层中。所述分析物/化合物可以是纯化的蛋白或粗蛋白提取物。 要测试的分析物/化合物可以在样品中。所述样品可以是，例如血液、尿、血清、唾液、细胞或组织的样品。所述样品可以是来自细胞培养基的液体。所述双层可透过所述水合的支持物通过光学手段如倒置显微镜，或者在一些情况中甚至通过裸眼显现。脂质双层的显现可用来跟踪该双层的形成、位置、大小或其他性质。所述双层的显现允许观察和研究该双层处或该双层中的标记的分析物/蛋白/化合物/细胞膜。一种或多种检测手段可用来检测两亲分子的双层或者插入所述双层的膜相关蛋白的化学、生物化学、电学、光学、物理和/或环境性质。具体地，所述一种或多种检测手段可用来检测所述双层中或所述双层处由化合物/分析物诱导的变化。所述检测手段可包括电极，其可用来检测所述双层中经过蛋白通道的离子电流的变化，或者所述水合的支持物、亲水体或双层中的分子的电化学性质的变化。可利用标准膜片钳放大器或其他低噪声电学放大系统来记录电流。可利用酶促测定或免疫测定来检测化学或生物化学变化。或者，标记的，例如放射或荧光标记的蛋白(其在某些条件下被激活)可用来监测双层处的变化。对反应时光吸收的变化作出响应的比色法也可用来检测所述双层中的变化，具体地，此方法可用来检测所述双层大小的变化。所述检测手段能够不断地或间断地检测所述双层的性质或者所述双层处的变化。检测试剂(如膜相关蛋白、分析物及其他化合物)可通过并入所述亲水体和/或所述水合的支持物中，直接注入所述亲水体和/或所述水合的支持物中，和/或并入或添加至所述疏水介质来递送至所述双层。可利用微量移液器注入所述亲水体和/或所述水合的支持物中。在其中对膜电容变化进行研究的实施方案中，电极可用作检测手段。所述电极可以是Ag/AgCl,此类电极的直径可以为约10微米-1mm。第一电极可与所述亲水体电接触，并且第二电极可与所述水合的支持物电接触。可利用电极测定双层的电学性质，例如双层的比电容。荧光成像及强度测量可用来测量包埋于双层的膜蛋白的性质。例如，所含的电位染料(例如di-8-ANEPPS)可用来测量在离子通道、孔或转运蛋白和/或其他膜蛋白，和/或其功能调节剂的存在下的跨双层电压。可利用选自红外光谱法、拉曼光谱法、表面等离子共振、原子力显微镜、SAXS和中子散射、差示扫描量热法、等温滴定量热法、圆二色性光谱法、电子显微镜和质谱或上述方法的组合中的任何方法来研究所述双层中的膜蛋白功能。光学和/或电学表征有利地允许快速筛选很大量的膜蛋白或化合物。光学和/或电学表征还有利地允许快速筛选很大量的双层。可通过向或从双层和/或亲水体和/或水合的支持物引入、除去或螯合试剂、分析物、化合物和/或蛋白来控制所述双层的物理、化学或电学环境，例如，可通过向所述亲水体和/或所述水合的支持物添加缓冲液来控制双层周围环境的pH。一旦形成，按照本发明制得的双层可跨过所述水合的支持物的表面转移或移动。优选地，这通过跨过所述水合的支持物的表面移动所述亲水体来实现。优选地，当所述双层跨过所述水合的支持物的表面转移时，并入所述双层的膜蛋白不从所述双层分离。 双层跨过所述水合的支持物的表面的转移可通过移动与所述亲水体或所述水合的支持物接触的元件来实现。该元件可以是电极。所述双层跨过所述水合的支持物的表面的转移可通过微流体泵送来实现，从而实现所述亲水体的转移，并因此实现所述双层跨过所述水合的支持物转移。双层的转移可用来向该双层中的蛋白施加力，从而研究例如机械敏感性蛋白通道，或者研究这样的力对双层自身的性质的影响。双层的转移可用来跨过所述水合的支持物的表面进行扫描以鉴定所述水合的支持物中改变所述双层和/或所述双层中的膜相关蛋白的性质的分析物/化合物。双层跨过所述水合的支持物的表面转移的令人惊讶的能力提供的益处是能够用该双层跨过所述水合的支持物进行扫描以检测分析物/化合物，例如位于相同水合的支持物的不同区域的蛋白和/或试剂或底物。这可有利地在各取样区域之间的双层不必解体的情况下实施。双层可跨过包含不同化合物的阵列或文库的水合的支持物转移。可将不同的化合物按照预定的位置点样在支持物上。或者，所述水合的支持物可包含分离凝胶或膜(包含根据大小或离子性质而分离的化合物，例如蛋白或DNA或小分子)。一个或多个双层的转移可允许针对所述水合的支持物中的化合物文库快速筛选双层，所述双层包含细胞膜中的一种或多种特定膜相关蛋白。筛选可检测文库中的化合物，所述化合物与膜相关蛋白相互作用并且在双层产生可检测的性质变化。文库中的化合物可以是蛋白、DNA或其他小分子。可检测的变化可以是，例如电导率变化，或者荧光或其他标记模式的变化。可在悬浮于可移动装置如移液器吸头中的水合的支持物上形成双层，然后可穿过细胞的表面对其进行扫描。或者，可移动装置可用来探测不同的溶液，例如不同的生物学样品。一旦形成，按照本发明制得的双层的大小可增大或减小。所述双层大小的增大或减小可通过使所述亲水体的中心朝向或远离所述水合的支持物移动来实现。可在多个分离的亲水体与一个或多个水合的支持物之间形成多个分离的双层。亲水体可按照二维或三维阵列排列。相同水合的支持物上的两个或更多个分离的亲水体可包含相同或不同的检测手段和/或不同的试剂，和/或源于相同细胞类型或不同细胞类型的细胞膜。可将水性液滴的阵列置于水合的支持物表面上，从而通过例如亲水体的荧光，或者检测分析物/化合物时记录的电导率的变化来检测分析物/化合物在所述水合的支持物中的位置。可在微流体通道中形成双层。所述微流体通道可包含水性液体，其可至少部分地提供亲水体。所述微流体通道还可包含疏水介质。所述微流体通道的至少一个壁/底层包含水合的支持物。本发明的另一方面提供一种双层产品，其包含浸于疏水介质中的亲水体和水合的支持物，其中包含两亲分子的双层在所述亲水体与所述水合的支持物之间，其特征在于所述双层包含至少部分的细胞膜。所述双层中存在的细胞膜可来自整体细胞和/或来自细胞膜碎片。对于所述亲水体、所述水合的支持物、所述两亲分子和重建的细胞膜，优选的实施方案如上所述。所述双层可按照本发明的方法形成。本发明的另一方面提供本发明的双层产品与荧光显微镜法结合的用途。所述水合的支持物的性质优选地允许利用显微镜观察双层。因此，在本发明的这一方面中，所述水合的支持物可以是厚度不大于约2mm的层。所述水合的支持物的厚度可以为约Inm-约2mm，或者约IOOnm-约1mm，或者所述水合的支持物的厚度可以为约IOOnm-约 400nm。要观察的分子可用荧光团荧光标记。亲水液滴和/或水合的支持物中的荧光团可利用全内反射荧光显微镜法或其他宽视野荧光显微镜技术进行观察。可通过物镜类型或基于棱镜的几何学促进全内反射荧光显微镜法。利用全内反射荧光显微镜法观测可与电学测量组合使用。全内反射荧光(TIRF)显微镜法可用来观察来自双层中存在的物质的荧光，作为该双层的整体性质，或者适合在低至单个分子水平上进行检测。TIRF技术可与其他分析技术(例如采集电学数据)组合使用。利用全内反射荧光观察荧光团的优点在于，仅在双层的约200nm内的荧光团被照射到，由此被观察到，而不接近细胞膜双层的其他荧光团则未被照射到，并且未被观察到。全内反射荧光测量与电学测量组合使用的优点在于，可研究蛋白-蛋白相互作用，例如可研究离子通道对荧光底物的结合的电学响应。本发明的又一方面提供一种筛选包含重建的细胞膜组分的两亲分子的双层与文库中的一种或多种化合物之间的相互作用的方法，所述方法包括i)提供本发明的双层产品；ii)跨过水合的支持物的表面转移亲水体，由此转移所述双层；和iii)检测所述双层与所述水合的支持物和/或亲水体中的化合物之间的任何相
互作用。所述细胞膜组分可以如上所述，例如，在人工双层中重建的完整细胞膜或细胞膜碎片。所述水合的支持物和/或亲水体可包含要测试的化合物的文库。
所述双层的转移可通过亲水体与配置为移动所述亲水体的显微操作器的直接或间接接触来实现。所述亲水体可与电极接触，可移动该电极以跨过所述水合的支持物来转移所述双层。可使所述筛选方法自动化,从而允许进行高通量筛选。本发明的另一方面提供本发明的双层产品用于鉴定能够与位于所述双层中的源于细胞膜的膜相关蛋白和/或其他膜组分相互作用的物质的用途。所述双层可在药物开发或医学诊断中用于原代细胞筛选。例如，可将靶化合物或物质并入亲水体或水合的支持物中，然后可探究这样的化合物或物质对所述双层中的蛋白的功能影响。所述相互作用或影响可以是所述物质或靶化合物的转运、调节，例如由所述物质或靶化合物抑制或激活蛋白的功能。所述相互作用或影响可以是蛋白的构象变化。应理解，仅就本发明的一些方面所讨论的本发明的任选和/或优选的特征可适用于本发明的所有方面。
借助于实施例，并且参照
本发明的实施方案/方面，其中图I :说明水性液滴(亲水体)在水合的支持物之上的双层，在本文中称作液滴在水合的支持物上的双层(droplet-on-hydrated-support bilayer, DHB);图IA是液滴在水合的支持物上的双层的示意图。当各自浸入脂质在疏水油中的溶液中时，在水性(水)液滴和水合的支持物(水凝胶)的水性表面上自发地形成脂质单层。在使这两种组分的单层相接触时，它们形成脂质双层；图IB显示使用倒置显微镜从下方观察的液滴双层(DHB)，图像显示由水凝胶表面支持的不带电极的液滴。由于界面处折射率的巨大变化而易于观察到液滴中心中的单个连续的双层区域。图2 :显示细胞膜并入本发明的双层的示意图。图3 :显示并入双层中的HEK293细胞膜中的hERG通道的单通道记录的结果。图4 :显示并入双层中的3T3细胞膜中的NMDA通道的单通道记录的结果。图5 :显示并入双层中的Min6细胞膜中的Katp通道的单通道记录的结果。图6 :显示并入双层中的SupTl细胞膜中的Kv通道的单通道记录的结果。图7 :显示来自图6中讨论的SupTl细胞的Kv通道I-V曲线。图8 :显示在开放概率方面，图6和7中讨论的Kv通道的电压依赖性。图9 :显示源于人红细胞的细胞膜双层的单通道记录的结果。图10 :显示荧光膜电位探针在双层中的用途，其中外部施加的交替电势差驱使相伴发生的荧光强度变化。图11 :显示荧光膜电位探针在双层中的另一用途。图12 :显示如何通过从微量移液器(A)或具有多孔毛细管的微量移液器(B)注射将试剂引入水性液滴的示意图。图13 :显示液滴在水合的支持物上的双层的全内反射荧光显微图像。、
图14 :显示用于制备双层的阵列的装置。图15 :显示用于试验筛选的用六边形PDMS印模形成的双层的阵列。制作直径150mm的孔，产生密度为360双层/cm2的双层的阵列。图16 :显示用KcsA-ChiIV进行卡利蝎毒素(KTX)滴定时电流阻断的结果。图17 :显示直接从大肠杆菌宿主膜重建入双层的来自细菌的KcsA-ChiIV的单通道记录的结果。图18 :显示线粒体通道的正电势和负电势的单通道记录的结果。图19 :显示用磷脂酶C酶促消化SupTl细胞的膜的结果。A :DMEM中的SupTl细胞；B :含有磷脂酶C的DMEM中的SupTl ；C :含有磷脂酶C的DMEM中的SupTl，超声处理(2min)；D :含有磷脂酶C的DMEM中的SupTl，超声处理(2min)，冷冻-解冻(3x)。图20 :示意用来将真核细胞离子通道并入本发明的脂质双层的重建系统。(I)将 细胞机械破碎并分离膜；(2)将细胞膜碎片沉积于涂布有水凝胶的盖片上或者并入水凝胶中；(3)添加脂质在油中的溶液并且在界面上形成脂质单层；(4)将具有脂质单层的水性液滴加入油中；(5)两种脂质单层相接触形成脂质双层，在此过程中细胞膜碎片中的离子通道在脂质双层中重建。将电极引入水性液滴以测量经过双层的离子通量(6)。图21 :显示细胞系中过表达的离子通道的单通道记录(SCR-上图)和整体(bulk)离子电流(下图)。(a)在无孔蛋白的大肠杆菌菌株PC2889中表达的KcsA的SCR(+50mV，150mM KCl, IOmM琥珀酸，pH 4中)。柱状图表示在无或有150mM Ba2+的情况下的整体电流记录(误差条是5次试验的标准偏差)；(b)HEK293细胞中表达的hERG通道的SCR (+IOOmV,350mM KCl, IOmM HEPES, pH 7. 5中)。柱状图表示在无或有阻断剂E-4031的情况下的整体电流记录；(c)3T3细胞中过表达的NMDA受体的SCR(140mM NaCl, IOmM HEPES, pH 7.5在液滴中，以及140mM NaCl, IOmM HEPES, IOuM甘氨酸，IOyM谷氨酸，pH 7. 5在琼脂糖中，+50mV)。柱状图表示在无或有谷氨酸的情况下的整体电流；(d)Min6细胞中表达的KATP通道的SCR(140mM KCl, IOmM HEPES, pH 7. 5，+50mV)。柱状图表示在有和无格列本脲(GBC)的情况下KATP通道的整体电流。图22 :显示淋巴细胞膜中的电压门控钾通道(a)在液滴脂质双层中重建的来自淋巴细胞膜的K+通道的单通道记录(150mM KCl, IOmM Hepes, pH 7. 5, +25mV) ； (b)从淋巴细胞膜获得的K+通道的电流-电压曲线；(c)显示通道开放概率的电压依赖性的全点电流柱状图；(d)利用4-AP阻断淋巴细胞膜的钾通道的整体电流。4-AP存在时的离子通量与不存在阻断剂时的测量相比降低降低96%; (e)通过卡利蝎毒素(KTX)阻断淋巴细胞膜的K+通道的整体电流。与KTX不存在时的离子通量(左)相比，KTX存在时的离子通量(右)降低99.4%。根据5次试验的标准偏差得出误差条。图23 :显示原代细胞和细胞器中的电记录(a)在无或有5mM Ca2+的情况下记录来自红细胞膜的归一化的整体电流(150mM KCl, Hepes, pH 7，+50mV)。根据5次试验的标准偏差得出误差条；(b)线粒体膜中的钾传导通道的单通道记录(150mM KCl, IOmM Hepes, pH7. 5, +50mV) ；(c)重建的镰形细胞膜的整体电流记录，测试对不同阳离子(Na+、K+、Ca2+)的传导性。镰形细胞膜对所有的阳离子具有高传导性，而来自健康个体的对照膜则未显示出传导性；(d)HbSS基因型的红细胞样品的单通道记录，传导钠(140mM NaCl, IOmM Hepes, pH7.4，+125mV)。底图(d)的放大部分。
具体实施方式
在具体的实施例中提及的“液滴在水合的支持物上的双层”(或DHB)或“液滴脂质双层”与上述的“两亲分子的双层”相同。在具体的实施例中提及的水性体与上述的亲水体等同。方法材料未经进一步纯化使用1，2- 二植烧酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(Avanti PolarLipids)、十六烧(Sigma-Aldrich)0制备液滴在水合的支持物上的双层在所有的试验中，将IOmM的十六烷(C16)中的1，2_ 二植烷酰-sn_甘油_3_磷酸胆碱(DPhPC)用作脂质/油溶液。浸于此溶液中的水性体积自发地自组装DPhPC单层，并且当两组分的单层相接触时，它们自发地形成脂质双层(Tsofina, L. M. et al.，1966. Nature212，681-683 ; Malmstadt, N. et al.，2006. Nano Letters 6，1961-1965; Funakoshi, K. etal.，2006. Analytical Chemistry 78，8169-8174;Holden，M. A. et al.，2007. Journal ofthe American Chemical Society-出版中)。通过使水性液滴与多孔的水合的支持物如水凝胶接触来形成液滴在水合的支持物上的双层(图1A)。在单层接触之前需要至少5分钟的稳定时间以防融合。此后，在水性液滴与水合的支持物接触的数秒至I分钟内以几乎100%的效率观察到双层形成。在倒置显微镜上观察液滴在水合的支持物上的双层(图1B)，此技术用来在试验过程中跟踪脂质双层的位置。利用显微操作器将直径lOOym的Ag/AgCl电极丝插入液滴中以电接入脂质双层(图1A)。利用水合的支持物中的相应Ag/AgCl地电极，进行跨脂质双层的电学测量。利用膜片钳放大器(Axopatch 200B;Axon Instruments)记录电流，并且以不同的频率数字化(National Instruments Ni-DAQ)。获取后过滤电痕迹(electrical trace) (100Hz 低通高斯滤波器)，并利用WinEDR进行分析。脂质双层典型地能够耐受高达约300mV的电压，同时保持超过100GQ的密封。电噪声水平典型地为±01. OpAr. m. s的数量级，并且记录带宽为IOOkHz0这反映出此装置的局限，而不是液滴在水合的支持物上的双层中的固有噪声。用于荧光法的液滴在水合的支持物上的双层可利用全内反射荧光(TIRF)显微镜荧光法检查置于薄水合的支持物上的液滴在水合的支持物上的双层。图13显示液滴在水合的支持物上的双层的全内反射荧光显微图像，在玻璃盖片上形成由琼脂糖薄层组成的支持基底。通过用含水琼脂糖填充聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微通道装置来使此薄基底再水合。装置孔填充有脂质在油中的溶液。将水性液滴置于油下的水凝胶之上。在两种水相之间的界面上形成脂质双层。倏逝场传播入液滴在水合的支持物上的双层中，照射脂质双层中的荧光团。将膜蛋白并入脂质双层的方法I.将水凝胶(如琼脂糖)沉积在平面固体支持物(如载玻片)上。2.将包含细胞膜碎片或完整细胞的溶液移液至水凝胶上。3.将水凝胶浸于脂质在油中的溶液。4.将水性液滴移液至脂质在油中的溶液中，当与水凝胶接触时，形成包含膜蛋白的双层。
在一备选实施方案中，还可从存在于水性液滴中的碎片或细胞而不是下层的水凝胶并入细胞膜。由于液滴脂质双层的千兆欧电密封性(giga-ohm electrical seal),可进行单通道分辨率的电学测量，或者可与整体细胞电记录相似地进行整体电流测量。平面水凝胶基底还允许双层的高灵敏度光学成像，作为探究双层内中蛋白行为的方式。直接并入来自完整的整体细胞的膜蛋白通过直接并入完整的整体细胞来将细胞膜组分并入双层，而不对膜造成任何破坏。将完整/整体细胞置于等渗介质中，并且并入水凝胶(水合的支持物)或水性液滴(亲水体)的水相中。制备细胞膜碎片通过任何以下方法产生包含蛋白的膜碎片 I.低渗裂解将细胞置于低渗含水介质，例如蒸馏水或低渗缓冲液(小于 140mM总渗透质(osmolyte))，其中从细胞内部施加的渗透压使细胞溶胀并且导致膜自发崩解以形成细胞膜碎片。然后，除了大的膜碎片之外，包括所有胞质组分在内的细胞组分自由地扩散入悬浮介质中。2.冷冻-解冻将细胞置于与细胞等渗的含水/缓冲介质中，然后将它们缓慢地冷冻至至少0° C以形成水冰，而后解冻，重复进行。解冻冰晶的作用是剪切细胞膜使细胞崩解以形成细胞膜碎片，并利用进一步的重复操作逐渐收缩膜碎片。可调整此方法(即重复的次数)以控制碎片的大�。纱送ü∈涂刂浦亟ㄈ胨阒械南赴さ鞍椎牧�。3.超声处理与冷冻-解冻相似，利用超声浴或超声探头剪切含水/等渗缓冲介质中的细胞。增大超声浴中施加的功率(更高的探头频率或者振幅)减小细胞膜碎片的大小，增大温育时间也如此。可调整此方法以控制细胞膜碎片的大�。纱送ü∈涂刂浦亟ㄈ胨阒械南赴さ鞍椎牧�。4.温和的洗涤剂温和的亲脂洗涤剂(例如CHAPS、DM、0G)用来分散细胞膜。一旦被分散，可稀释剩余的含蛋白的细胞膜碎片以控制重建入DHB中的蛋白的量。5.膜的酶促消化磷脂消化酶如磷脂酶能够消化完整的细胞膜以产生更小的含蛋白的细胞膜碎片(脂蛋白体)。通过小心地控制酶浓度和温育时间来控制产生的碎片的大小，由此影响重建A DHB中的蛋白的量。例如，图19显示用磷脂酶C酶促消化SupTl细胞的膜的结果。A DMEM中的SupTl细胞；B :含有磷脂酶C的DMEM中的SupTl ；C :含有磷脂酶C的DMEM中的SupTl，超声处理(2min) ；D :含有磷脂酶C的DMEM中的SupTl，超声处理(2min)，冷冻-解冻(3x)。6.膜的机械破裂压力驱动的装置例如匀浆器和“法氏滤压器(French-Presses) ”可用来使膜破裂和收缩并由其产生碎片。利用剪切力破碎细胞的其他此类装置例如喷嘴，可用来破碎细胞膜。通过喷嘴或过滤器(已知尺寸)挤出可用来制备大小精确的膜碎片。7.生物学产生膜碎片使用成孔剂(肽、蛋白、聚合物)以扰乱细胞渗透平衡，导致细胞自发崩解，由此在除去成孔剂后，包含所关注的膜蛋白的膜碎片被重建入DHB中。此外，蛋白可被共表达，这诱导膜囊泡形成或者细胞膜崩解，从而导致特定的蛋白脂质囊泡从质膜出芽，或者膜崩解。所有上述用于控制膜碎片大小的方法可以任意组合或者单独地实施，这取决于碎片的要求，即为了准确稀释膜碎片，靶膜中较高密度的蛋白表达，与低水平的靶蛋白表达相t匕，可能需要较大的膜剪切。因此，这促进准确控制重建入DHB中的蛋白的水平。所述制备方法可以以任意组合和任意顺序实施。膜碎片可与包含溶解的脂质(微胶粒或囊泡形式)的任何水性介质混合。可在上述控制膜碎片大小的方法之前实施此步骤。
可通过标准生物化学技术(例如离心分离或透析(减小体积和/或除去胞质组分))分离和收获所得的细胞膜碎片(包含胞质组分)。所得的细胞膜碎片制备物可进行缓冲处理，并通过在DHB的每侧上并入任何水相(水合的支持物或亲水体)而并入DHB中。如通过监测包埋的离子通道(从碎片制备物带入DHB中)的电活性测定的，通过这些技术制得的膜碎片自发地并入脂质双层中。制备包含所关注的靶膜蛋白的细胞膜部分(fraction)作为示例，通过刮擦或者胰蛋白酶(蛋白酶)处理从培养容器分离，从而从培养基收获来自哺乳动物细胞培养物的细胞系(例如HEK293细胞)。通过使细胞悬浮于过量缓冲液中并且以低速(100xg，10分钟)离心细胞，在等渗缓冲液中洗涤细胞以除去培养基。重复此步骤以稀释样品中剩余的细胞培养基。为了从完整的细胞制备膜部分，首先如上所述使它们形成沉淀(pellet)。细胞因渗透压而溶胀和破裂，由此产生大的质膜碎片。细胞的胞质组分被释放入介质中。然后用低渗介质替换离心后的介质，而后以较高的g_力(例如25，OOOxg)再离心30分钟以保留碎片。通过重复替换在高速离心(例如25，OOOxg)时的上清，从介质分离密实的膜部分和亚细胞细胞器。在高速离心时，可配制蔗糖梯度，利用亚细胞组分不同的沉降性质来分离它们。利用此方法，从较大的内质网和质膜分离密度较小的物质(即，线粒体)。在膜碎片的离心制备步骤中，可改变缓冲条件，并且可用任何期望的盐浓度、pH、渗透质含量、配体和蛋白-辅因子、所关注的激动剂和拮抗剂替换介质。然后，样品可用于并入液滴在水凝胶上(droplet-on-hydrogel)的脂质双层(DHB)系统。制备液滴在水凝胶上的脂质双层(DHB)水性和疏水介质在需要从DHB的亲水基底侧插入靶蛋白的情况中，在制备DHB基底之前，通过直接加入热C50° C立即冷却)熔化琼脂糖中，将上述膜碎片制备物并入。通过将琼脂糖粉末熔于期望的缓冲液(最常见地包含电解质例如KCl或NaCl以及缓冲化合物，用酸或碱将其PH滴定至期望的值，通常为中性pH)中来制备此类琼脂糖。将小体积的热琼脂糖( 50° C)添加至等体积的期望稀释度的膜碎片制备物中，继而快速冷却。将水性琼脂糖-膜碎片混合物铺展在整个用于制备DHB基底的表面(为了成像优选为光学透明的表面)上。
制备DHB装置基底水性琼脂糖层可用于浸没在正癸烷的脂质在油中的溶液(例如十六烷C16)下，其中溶有5-10mM磷酸胆碱脂质(例如1，2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)。将塑料夹持装置置于DHB基底上方，其包括含电解质的水性琼脂糖和脂质在油中的溶液的储槽。然后该装置用来使水性液滴与基底亲水的水性琼脂糖接触。制备液滴将水性液滴移液(或者可通过微流体装置产生)入与用于制备DHB装置的相同的脂质在油中的溶液中，或者不同的脂质在油中的溶液中以形成不对称的双层。最常见地，需
要对称的双层，其中双层的两小叶都包含相同的脂质。在短时间平衡后，在这些脂质在油中的溶液中，在水性液滴与疏水的脂质在油中的溶液之间的界面上形成脂质的单层。典型地，这耗时小于5分钟，但是平衡时间的长度可受到浸泡溶液中的脂质浓度的影响。脂质平衡的水性液滴与脂质平衡的亲水琼脂糖基底接触通过移液(或者通过微流体泵送、重力沉降或直接注射)至基底的附近，将液滴引入制得的脂质平衡的DHB基底琼脂糖上。可在水性介质(液滴和基底)之间的界面上形成脂质双层所需的时间短，例如约I分钟。验证蛋白重建在脂质双层形成期间或之后的任何阶段，包含所关注的靶蛋白的膜碎片自发地并入脂质双层，继而蛋白自发地重建入液滴在水凝胶上的脂质双层中。通过存在于DHB中的离子通道电流的电生理学记录或者与蛋白相关的荧光性质的直接成像来验证此过程。试验当脂质双层形成并且包含所关注的靶膜蛋白的细胞膜碎片重建时，可实施任何电生理学方法来探究重建的离子通道的功能。可根据系统的化学组成确定条件。可通过将电极并入双层任一侧的含电解质的水性介质中来跨脂质双层地施加外部电压。可利用电位染料或其他荧光团，对并入的蛋白的性质进行荧光成像。对本领域技术人员而言，显然可进行其他生物物理学试验以探究重建的膜蛋白功能，例如通过光学技术，如表面等离子共振、圆二色性光谱、拉曼光谱法等。当形成稳定的DHB时，可将分离的化学组分并入系统，例如膜蛋白的配体，即激动齐U、拮抗剂，或者其他化学物质，通过直接注入液滴中或者通过液滴融合而并入脂质双层任一侧的水性区室中。例如，这可用来监测在添加阻断剂之前离子通道的行为，其中可在添加激动剂或拮抗剂之前和之后监测蛋白功能。如通过单通道测定的，以下实施例证实包含离子通道的各种细胞膜双层的并入。HEK293细胞中的hERG通道图3显示在HEK293细胞中过表达且并入双层中的hERG通道的单通道记录的结果。在 350mM KClUOmM HEPES, pH 7. 5 中洗涤HEK293 细胞膜(在4° C下沉淀)。将 1:40000的稀释液与基底琼脂糖(5uL)混合，然后组装装置并浸没于脂质在油中的溶液中(十六烷中的DPhPC)。施加的电压(显示的痕迹)+100mV。缓冲液350mM KCl, IOmM HEPES, pH
7.5。3T3细胞中的NMDA通道图4显示在3T3细胞中过表达且并入双层中的NMDA通道的单通道记录的结果。通过在140mM NaCl, IOmM HEPES, pH 7. 25中形成沉淀(3x)来洗涤表达NMDA的3T3细胞(约10，000受体/细胞)。然后对细胞进行冷冻-解冻循环3次(RTP至-80° C)，而后在水浴中在4° C下超声处理3min。将样品1:25000的稀释液与用于基底琼脂糖层的琼脂糖(5uL)混合，然后组装装置并浸没于脂质在油中的溶液中(十六烷中的DPhPC)。施加的电压(显示的痕迹)+50mV。缓冲液140mM NaCl, IOmMHEPES, pH 7. 5，在液滴中。缓冲液140mM NaCl, IOmM HEPES, IOuM甘氨酸，IOuM谷氨酸，pH 7. 5，在琼脂糖中。Min6细胞中的Katp通道图5显示在Min6细胞中过表达且并入双层中的Katp通道的单通道记录的结果。将Min6细胞在140mM KCl, IOmM HEPES, pH 7. 5中洗涤，沉淀，并且超声处理5min。将1:10000的稀释液与基底琼脂糖(5uL)混合，然后组装装置并浸没于脂质在油中的溶液中(十六烷中的DPhPC)。缓冲液140mM KCl, IOmM HEPES, pH 7. 5。施加的电压(显示的痕迹):+50mV。
SupT I细胞中的Kv通道图6显示在SupTl细胞中过表达且并入双层中的Kv通道的单通道记录的结果。使SupTl悬液细胞在DMEM中生长，然后在_80°C下冷冻100，000细胞在20uL中的溶液。对细胞进行4次冷冻-解冻循环，达到室温，然后1:80，000稀释，并移液至5uL基底琼脂糖层(其铺展于玻璃盖片上)上。施加的电压(显示的痕迹)+10mV。缓冲液150mM KCl, IOmMHEPES, pH7. 5。图7显示以上试验的SupTl细胞的Kv通道I-V曲线。图8显示在开放概率方面上述Kv通道的电压依赖性。通道表现出开放概率随电压增大而增大的特征。人红细胞图9显示源于人红细胞的细胞膜双层的电记录的结果。在140mM KC1，IOmMHEPES, pH 7. 5中重复洗涤人红细胞，并除去血清，包括白细胞。然后在低渗缓冲液中超声处理5min。将1:100000稀释液与基底琼脂糖(5uL)混合，然后组装装置并浸没于脂质在油中的溶液中(十六烷中的DPhPC)。缓冲液2M KCl, IOmM HEPES, pH 7.5。施加的电压(显示的痕迹)+100mVoKcsA-ChiIV 通道记录图16显示在用KcsA-ChiIV进行卡利蝎毒素(KTX)滴定时电流阻断的结果，图17显示来自细菌的KcsA-ChiIV直接从大肠杆菌宿主膜重建入双层中的单通道记录的结果。线粒体通道记录图18显示线粒体通道的正电势和负电势的单通道记录的结果。荧光膜电位探针在双层中的用途参照图10，将电位染料(di-8-ANEPPS)并入脂质在油中的溶液中。它存在于与脂质双层的平面垂直、与脂质平行的两小叶中。来自染料的荧光根据跨脂质双层的电势而改变。在此，跨DHB外部施加交替正弦波电势差(+/-150mV)。可清楚地观察染料，随着正弦波交替，报告跨DHB的电势差，这指示与施加的波的确切时间相关性。图11显示荧光膜电位探针在双层中的另一用途。在此，电位染料用来检测细菌成孔毒素a-溶血素在双层中的存在。当膜蛋白存在于双层中时，荧光强度显著增强。用于荧光法的液滴在水合的支持物上的双层利用全内反射荧光(TIRF)显微镜法，可荧光检查置于薄水合的支持物上的液滴在水合的支持物上的双层。图13显示液滴在水合的支持物上的双层的全内反射荧光显微镜图像，在玻璃盖片上形成由琼脂糖薄层组成的支持基底。通过用含水的琼脂糖填充聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微通道装置，使此薄基底再水合。装置孔填充有脂质在油中的溶液。将水性液滴置于油下的水凝胶之上。在两种水相之间的界面上形成脂质双层。倏逝场传播入液滴在水合的支持物上的双层中，照射脂质双层和液滴中的荧光团。TIRF技术还可与其他分析技术组合使用，例如与电学数据采集组合使用。数据的组合可提供关于蛋白功能的改进信息。形成双层时引入细胞膜蛋白的其他实施例为了进一步证实本发明的方法的可行性，研究多种代表性的配体门控离子通道和电压门控离子通道。研究一系列不同的条件；从原核蛋白至来自哺乳动物的初生组织样品。 记录整体的和来自单通道的离子通道活性。记录来自多种过表达的真核蛋白(包括NMDA受体、hERG和KATP)的电流。还研究内源表达的通道。获得来自包括镰形细胞在内的细胞和线粒体的离子电流的单通道记录，这由于它们的大小或形状对于膜片钳目前难以实现。如上所述，在形成双层时，将细胞膜碎片弓I入脂质双层中。方法细胞系、蛋白、制备膜和电记录KcsA利用无孔蛋白的大肠杆菌菌株PC2889在pQE60(Qiagen, Germany)中过表达。利用基于压力的细胞匀浆器(TC5-612，Stansted Fluid Power，UK)使细胞崩解，通过在水中离心而分离膜，然后在液氮中冷冻。将沉降的膜再悬浮于150mM KCl, IOmM Hepes, pH 7.5中。对于整体和单通道记录，分别按照1:106和1:108(对于所有的情况，除非另外说明，都以体积体积报告稀释比)稀释膜制备物。在150mM KCl, IOmM琥珀酸，pH 4中进行整体和单通道记录。利用含有150mM BaCl2, IOmM Hepes, pH 7. 5的液滴进行阻断试验(+50mV，n=5) ohERG.对储藏在-80 ° C下的过表达KCNH2基因的生长停滞HEK293细胞(Invitrogen, UK)进行超声处理(Sonorex, Bandelin, Germany, 320W, 4。C，3 分钟)。然后通过离心分离膜，在缓冲液(350mM KCl, IOmM Hepes, pH 7. 5)中洗涤。最后，将膜I: IO4稀释入相同的缓冲液中。然后将膜并入冷却的低熔点(low melting)琼脂糖(Sigma,总体积10iiL，l:10样品:琼脂糖，1.5%，〈60° C)中，并沉积在盖片上，然后组装装置。施加+IOOmV的电压，在有和无甲磺酰苯胺药物E-4031 (ImM E-4031, n=5, Invitrogen, UK)的情况下,测量电压依赖性电流响应。为了记录单通道，进一步稀释(1:20)细胞膜制备物。NMDA受体.在贴壁的小鼠成纤维细胞3T3细胞系中表达人NRl_la/NR2A受体亚基。从培养瓶机械分离细胞后，将细胞在等渗缓冲液洗涤(3次，用140mM NaCl, IOmMHepes, pH 7. 5),然后通过超声(Sonorex, Bandelin, Germany, 320W)处理 30s 和 4 次冷冻-解冻循环机械破碎细胞。通过离心分离膜并在上述缓冲液洗涤之后，将样品稀释(I IO3)入相同的缓冲液中。然后，将包含膜的琼脂糖沉积在盖片上，然后组装装置。随后在固化前将膜并入冷却的琼脂糖(1.5%)中，其中分别地，总稀释比对于整体电流记录为1:5000，对于单通道水平为1:500000。在膜去极化(+50mV施加的电压，n=5)后，向140mMNaCl, IOmM Hepes, pH 7. 5中添加10 ii M谷氨酸和IOyM甘氨酸,这导致受体活化。进一步稀释(1:100)膜制备物，可记录单通道(+50mV施加的电压)。KATP.为了KATP通道，在Min6细胞中共表达Kir6. 2和SURl (磺酰脲受体)。对冷冻的细胞进行3次冷冻-解冻循环,然后超声处理I分钟(4° C，Sonorex, Bandelin, Germany,320W)。通过离心分离膜之后，在等渗缓冲液(140mM KCl, IOmM Hepes, pH 7. 5)中洗涤膜，并且稀释1:5000。通过与冷却的琼脂糖(1.5%)混合(1:10 v:v)将膜并入琼脂糖中，并沉积在盖片上，然后组装装置。为了单通道记录，将样品进一步稀释10倍。在液滴和琼脂糖支持物中，在140mM KCl, IOmM Hepes, pH 7. 5中进行电记录。利用格列本脲获得整体电流阻断(ImM, +50mV, n=5)。淋巴细胞.使SupTl细胞以悬浮培养的形式生长，在缓冲液(150mMKCl，IOmMHepes, pH 7.5)中洗涤4次。然后通过低渗休克裂解细胞，通过离心分离膜，并在等渗缓冲液(140mM KCl, IOmM Hepes, pH 7. 5)中洗涤。将膜I: IO4稀释，将I y L的此溶液沉积在涂有琼脂糖(1.5%)的盖片上。对于整体电流阻断，使用非特异性K+通道阻断剂4-氨基吡啶(5mM, +50mV)。为了特异性阻断，，使用特异性Kv-通道阻断剂卡利蝎毒素(50 u M, +50mV)。 红细胞.按照已发表的方法(Gibson et a I, JPhysiol :511 (Ptl) ,225-234 (1998))，通过离心并在 PBS 缓冲液(137mM NaCl, 2. 7mMKC1，IOmM磷酸氢钠，2mM磷酸二氢钾，pH 7.4，含有1%葡萄糖)中洗涤4次，经抽吸除去剩余的血液组分，从镰形细胞或健康的个体的全血分离红细胞。在低盐缓冲液(15mMNaCl, IOmM EDTA, IOmM Hepes, pH 7)中通过低渗休克裂解细胞。然后通过离心使膜沉降，在低盐缓冲液中洗涤4次，随后再悬浮于等渗缓冲液(150mM NaCl或KCl或CaCl2, IOmMHepes, pH 7.4)中。为了 Gardos通道试验，将膜再悬浮于等渗缓冲液(包含150mMKCl, IOmMHepes, pH 7)中。使用含有或不含 Ca2+的液滴(150mM KCl,+/_5mM CaCl2,+/_5mMKCl, IOmM Hepes, pH 7，+50mV, n=5)来观察Ca2+依赖性的K+通量。为了镰形细胞和对照膜的电记录，将膜制备物在等渗缓冲液(150mMNaCl或KCl或CaCl2, IOmM Hepes, pH 7. 4)中1:105稀释，并入琼脂糖中(1.5%，v/v 1:10稀释比)，然后沉积在盖片上，接着组装装置。为了单通道记录，需要进一步稀释1:20。线粒体 按照先前已发表的方法(Basoah et al FEBLett:579, 6511-6517(2005)),利用由机动搅拌器驱动的Teflon玻璃匀浆器(Heidolph, Germany),在冰上裂解猪肝细胞。通过以1，IOOg在4° C下离心IOmin除去大碎片，包括完整的细胞。首先以11，OOOg在4° C下离心IOmin使线粒体沉淀，然后用5mlPBS洗漆I次,接着以11，OOOg离心5min产生最后的线粒体沉淀。将线粒体沉淀再悬浮于冰冷的耗氧的缓冲液(0. 25M蔗糖，5mM MOPS, 5mM KH2PO4和5mM MgCl2, pH 7.4)中，并在-80° C下储藏。解冻后，将线粒体在等渗钾缓冲液(150mM KCl, IOmM Hepes, pH 7. 5)中洗漆2次,超声处理5分钟(Sonorex, Bandelin, Germany, 320W),并以1:104稀释入缓冲液(150mM KCl, IOmM Hepes, pH 7. 5)中。然后将膜1:10稀释入冷却的琼脂糖(Sigma,总体积IOuL, I. 5%)中，沉积在盖片上，接着组装装置。重建和组装液滴双层装置通过从5xl06细胞/mL的起始浓度，按照I: IO4-I: IO7改变膜碎片的稀释比，可控制双层中的通道数。可通过将细胞碎片以1:10比例添加至冷却但未固化的1-1. 5%琼脂糖支持物(总体积10 y L)，或者通过将膜移液至水凝胶支持物上，来并入通道。微通道装置是按照先前发表的(Thompson et al, Nano Lett: 7，3875-3878 (2007))由聚(甲基丙烯酸甲酯)显微制造。将装置置于载玻片上，然后将琼脂糖支持物层浸于十六烷-DPhPC溶液(IOmM的无水十六烷中的1，2- 二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，Sigma)中。首先将含液滴的缓冲液移液至单独的脂质在油中的溶液，其允许形成围绕液滴的单层。在这些脂质在油中的溶液中短暂平衡(2-15分钟)后，在水相与疏水的脂质在油中的溶液之间的界面上组装脂质的单层。然后通过移液将液滴置于制得的脂质平衡的琼脂糖基底上。当在水凝胶的表面上与脂质单层接触时，形成双层。利用倒置显微镜(Ti-Eclipse;Nikon Instruments)对液滴双层进行成像。电记录.利用我们之前描述的方法进行整体和单通道记录(Heron et al, JAm Chem Soc: 129，16042-16047 (2007))。利用显微操作器，将电极插入液滴(100 y m直径，Ag/AgCl, Nashege, Japan.图1A)。测量此电极与琼脂糖支持物中的相应Ag/AgCl地电极之间的电流。利用膜片钳放大器(Axopatch200B;Axon Instruments)记录电流。利用NI-DAQ (National Instruments, UK)使信号数字化。获取后过滤电痕迹(100Hz低通 高斯滤波器)，并利用 WinEDR (University of Strathclyde, Institute of Pharmacy andBiomedical Sciences)进行分析。脂质双层典型地能够耐受150mV的电压，同时保持超过100GQ的密封性。电噪声水平典型地为±01. OpA r. m. s的数量级(记录带宽100kHz)。整体电流阻断.在重建各自的细胞系后，测量含有和不含阻断剂的液滴的整体电流，计算平均值和标准偏差，在含有和不含阻断剂的所有情况中，n=5。来自重组过表达的细胞的离子通道的电记录按照本发明的方法，将从过表达细菌钾通道KcsA的无孔蛋白的大肠杆菌菌株分离的膜并入双层中。将膜制备物稀释入等渗缓冲液中，然后并入琼脂糖支持物中。添加Ba2+导致93%的电流阻断(图21a)。当进一步稀释膜制备物时，观察到低开放概率并且电导率为62+/-2. 6pS的单通道(图21a)。使用没有转化的大肠杆菌细胞的对照试验表明没有离子流。重建在液滴双层中的真核细胞离子通道图20显示真核细胞离子通道重建在液滴双层中所需的步骤，其中(I)破碎真核细胞；(2)分离并稀释细胞膜；(3)将膜并入水凝胶中；(4)然后施用磷脂在油中的混合物，在水凝胶-油界面自组装单层；(5)引入纳升水性液滴，这也获得第二脂质单层；(6)当两种单层接触时形成双层。在形成双层时发生离子通道的自发插入。用于重建真核细胞离子通道的这种方法可适用于各种样品和条件。在本文所包括的实施例中，细胞来源于组织(图23b)、血液(图23a、c、d)或细胞培养物(图21b_d、22)；来源于悬浮(图22)或贴壁的细胞系(图21b-d)。利用超声(图21)、冷冻-解冻(图21)、低渗休克(图23a、c、d)或挤出进行细胞破碎。通过在制备支持物时添加细胞碎片，或者通过将膜溶液移液至水凝胶支持物上，将膜并入水凝胶支持物中。通过改变膜碎片的稀释比，还可控制双层中的通道数。为了测试本发明的方法的通用性，选择一系列代表性的真核细胞离子通道。首先，测量跨膜离子通量，该膜来源于过表达电压门控钾通道Kvll. I (基因KCNH2)的细胞。Kvll. I (或hERG)通道对在心脏动作电位18时的再极化至关重要。通过超声处理将过表达hERG的生长停滞HEK293细胞机械破碎，通过离心分离膜，并且洗涤。最后，将膜再悬浮于缓冲液(350mMKCl，IOmM Hepes, pH 7. 5)中并且稀释，然后并入琼脂糖层中。观察电压依赖性整体电流响应，并且通过hERG阻断剂(E-403119)阻断离子电流(97%图21b)。当进一步稀释细胞膜制备物时，记录单通道痕迹，平均电导率为8+/-0. 21pS，与之前报告的值相似(图21b)。还研究配体门控离子型N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体。在等渗缓冲液中洗涤表达重组人NMDA受体的小鼠成纤维细胞(Itk-)，然后机械破裂，分离膜，并稀释(140mMNaCl, IOmM Hepes, pH 7.5)。然后在形成双层之前将膜并入琼脂糖层中。添加谷氨酸(10 u M)和甘氨酸(10 u M)呈现出离子通量增大98%，与受体的活化一致(图21c)。进一步稀释细胞制备物时，观察单通道，呈现出NMDA受体典型的缓慢开放和关闭事件。测得的电导率水平为 47. 3pS (+/-3. 2)并且亚电导率(sub-conductance)水平为 36. 2pS(+/_3. 55)，与文献中先前已报告的值相当。测量跨膜的离子通量，该膜来源于过表达Katp的Min6细胞。这些通道由4个Kj. 2和4个磺酰脲受体亚基组成，它们在膜上组装形成活性复合物。通过特异性Katp通道阻断剂25格列本脲(ImM)阻断整体电流(91%;图21d)。进一步稀释细胞制备物揭示单通道(图21d)，电导率为50+/-3. IpS，与先前在卵母细胞中的观察相似。来自原代细胞和线粒体的离子通道的电记录对来自原代淋巴细胞中内源表达的电压门控钾通道的单通道电流和整体电流的电压依赖性进行记录(图22a)。对于T细胞的免疫应答和调节膜电位和钙信号传导时的信号传导，淋巴细胞钾通道很重要。通过低渗休克裂解SupTl细胞悬浮液，通过离心分离膜，并在等渗缓冲液中洗涤。然后稀释膜，随后沉积于涂布有琼脂糖的盖片上。观察到KvL 3的典型电压门控行为，在较高电压下，开放概率增大(图22b)。利用非特异性(5mM 4-氨基吡啶，96%阻断，图22D)K+和特异性Kv-通道阻断剂(50 u M卡利蝎毒素，99%阻断，图22E)，鉴定Kv1.3。根据此药理学特征和电流电压行为(图22B)，该通道鉴定为KvL 3。本发明的方法的一个优点在于，可测量来自膜的离子电流，这利用常规的膜片钳非常难以实现。利用红细胞和线粒体膜对此进行检查。由于它们的大�。煜赴碜钚∏易钅岩酝üて哟サ南赴�。从全血分离红细胞后，通过低渗休克裂解细胞，并将膜再悬浮于等渗缓冲液中。在有或没有Ca2+(5mM)的情况下进行试验，观察到Ca2+诱导的K+通量，在钙存在下增加7倍，与从Gardos通道得出的电流一致(图23a)。Gardos K+离子通道是红细胞膜中最主要的通道。对来自健康个体和患有镰形细胞疾病的个体的红细胞的膜进行重建。已知镰形的发生是由于红细胞细胞膜的阳离子渗透性的变化而导致细胞脱水；但是，此初始步骤的分子基础仍然是争论的主题。将红细胞膜并入水凝胶中，并且在本发明的方法中进行研究。重建的来自健康个体的膜表现出很小或者没有导电性，来自镰形细胞的膜对Na+、K+和Ca2+的导电性高，具有基本的欧姆响应(图23c)。当进一步稀释(1:20)样品制备物时，从来源于镰形细胞的膜获 得单通道记录，没有对来自健康个体的膜的单通道记录(图23c)。显然仅凭此试验不能将此通道活性归因于特定的通道，但是，它的确突出显示利用此技术可容易地研究红细胞膜内存在的离子通道。利用常规的膜片钳非常难以研究细胞器和小于红细胞的细胞。由于本发明的方法不受研究的细胞的大小的限制，所以将从猪肝分离的线粒体膜重建在本发明的双层中。在机械破裂分离的线粒体后，将膜分离，并在等渗缓冲液中洗涤，然后重建入液滴双层中。利用钾盐或钙盐分辨单通道电流和整体电流(图23b)。讨论和应用本文中所示的数据表明，成功地重建来自各种离子通道类型和样品条件的膜蛋白。这些试验不需要除了灵敏的电流放大器之外的专门的装置，并且在所有的情况中膜蛋白重建是可信且可再现的。利用本发明的方法，含有真核细胞膜蛋白的DHB的制备快速且简单，并且可容易地放大至DHB阵列中的大规模平行测量。可监测来自DHB阵列ri0~12双层cm_2)中存在的单独双层的离子电流和荧光信号。包含真核细胞膜蛋白的DHB阵列允许测量不同膜蛋白对电学和化学刺激的反应。本发明的方法的关键特征是，来自细胞膜的离子通道直接并入合成的脂质双层中 而不需要洗涤剂纯化。自20世纪70年代起，已报导了无洗涤剂的重建方法，但是这些方法不可靠，并且需要相当多的样品制备物。在此领域中缺少近期的研究或许表明利用此方法难以有效的蛋白并入。相对容易地将原核和真核细胞通道并入双层中，表明对于许多试验，本发明的方法是膜片钳的有效替代方法。来自红细胞和线粒体的离子通道的重建还表明，本发明的方法可应用于研究其他的小细胞和细胞区室，这对除了最有经验的膜片钳技术人员之外的所有人员而言，目前尚不可实现。目前，仅可通过膜片移液器(patch pipette)的纳米显微控制，通过利用巨大的脂蛋白体或研究膜组分的非典型的大变体，使较小的对象形成膜片。利用本发明的方法，可实现单通道记录，并且样品制备相对简单，不需要显微定位膜片移液器。离子通道仍然是研究不足的靶类型，主要是因为缺少能够高通量研究通道功能的技术。由于利用本发明简单地制备多个液滴双层，所以其成为潜在的工具，用于利用过表达的靶标和原代细胞来高通量筛选离子通道。例如，可平行地筛选药物文库的数百个克隆的离子通道的结合亲和力，并且分辨率大于整体细胞膜片钳电生理学法。这种方法可获得关于药物开发时潜在的不期望副作用的信息。由于能够快速筛选比现有方法更大量的膜蛋白，还可对膜蛋白不同的同种型和突变体的克隆(在对患者的常规药物测试中不常见)进行安全性试验，即，突变体存在于少数的群体中。由于可重建来自初生组织样品的蛋白，仅需要少量细胞。可针对在递送点处的患者组织的副作用筛选药物。这种技术的具体优点有此重建方法所需的材料量少(小于I个细胞/测量)、电学控制以及到达双层的两侧。能够对双层进行成像，也拓宽膜蛋白反应的光学测量的范围。除了离子通道之外，本发明的方法还可用来研究其他类型的膜蛋白，包括受体激酶、G蛋白-偶联的受体和转运蛋白。药物安全性和长QT筛选心电图的QT间期测量心室的再极化。由于某些药物与离子通道的相互作用，可有害地延长这种间期。QT间期延长可导致快速型心律紊乱和尖端扭转型室性心动快速(torsade-de-point),若这伴随心脏病或其他心脏病症发生,则可导致粹死。hERG(KvlI. I)离子通道的抑制是QT间期延长的最常见原因。因为发现某些FDA批准的药物可诱导这种延迟的心室再极化，若干控制药物审批的国家主体已制订针对hERG筛选新化合物的监管要求。对于制药公司，针对hERG离子电流的不利变化，筛选新化合物是很大的挑战。在制药业中，迫切需要针对hERG通道的低成本高通量筛选分析法。目前，体外筛选方法包括电压钳、荧光或结合测定。在此类方法中，目前仅电压钳电流记录提供在测定hERG抑制中的“金标准”。初步试验已表明，可以1012组双层/cm2的密度制作大至数百双层的DHB原型阵列。可记录来自各个单独双层的单通道或整体电记录。可利用荧光显微镜对来自各个双层的电流响应进行显像。
图12显示可通过从微量移液器619或具有多孔毛细管621的微量移液器注射将试剂引入水性液滴609。这提供将化合物引入现有的液滴的简单方法。制备双层阵列的装置图14显示可用来制备双层阵列的装置。该装置包括基座842和盖841。用底部通道中的琼脂糖填充基座840，然后填充脂质/油溶液，静置平衡，从而在琼脂糖基底上形成单层。可将细胞膜碎片或整体细胞移液至琼脂糖上用以并入双层中。将盖841浸入大量水溶液中，通过与用来制作所述盖的塑料的亲水相互作用，少量液滴保留在盖上。然后使盖下降至基座中，以使液滴保留在油中一定时间进行平衡，接着使盖进一步下降以使液滴与下方的琼脂糖接触。然后在液滴与琼脂糖表面接触时自发地形成双层的阵列。利用通过盖与各液滴相连的电极，以及琼脂糖中的共用电极，可对阵列中的各双层单独进行电学测量。该装置的性质允许利用显微镜从下方对各个双层844进行显像。如图15中所示，可利用六边形PDMS印模形成双层的阵列，用于试验筛选。制作直径150mm的孔，产生360双层/cm2的双层密度。
权利要求
1.一种制备双层的方法，所述方法包括 (a)提供浸于疏水介质中的水合的支持物和亲水体， 其中在所述疏水介质与所述亲水体之间的界面上形成两亲分子的 第一单层，并且在所述疏水介质与所述水合的支持物之间的界面上 形成两亲分子的第二单层；和 (b)使所述第一单层与所述第二单层接触以形成两亲分子的双层， 其中在所述水合的支持物中或上，和/或在所述亲水体中提供包含细胞膜组分的至少部分的细胞膜； 从而在形成所述双层期间或之后将细胞膜的组分并入所述双层中。
2.如权利要求I所述的方法，其中在所述疏水介质中提供两亲分子。
3.如权利要求I或2所述的方法，其中在所述亲水体中和在所述水合的支持物上提供两亲分子。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在形成所述双层之后，在所述水合的支持物中和/或在所述亲水体中提供所述细胞膜。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在形成所述双层之前，在所述水合的支持物中和/或上，和/或在所述亲水体中提供所述细胞膜。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在形成所述双层的同时将所述细胞膜并入。
7.如权利要求I所述的方法，其中步骤(a)包括 提供水合的支持物； 通过将细胞膜层铺于所述水合的支持物上，或者通过以其中细胞 膜混合入所述水合的支持物中的形式提供所述水合的支持物来 提供细胞膜；然后 将所述支持物浸入包含两亲分子的疏水介质中，由此在所述疏水介质与所述水合的支持物之间的界面上形成两亲分子的单层；然后 籲将亲水体浸入所述疏水介质中，由此在所述疏水介质与所述亲水体之间的界面上形成两亲分子的单层。
8.通过权利要求1-7中任一项所述的方法制备的两亲分子的双层。
9.亲水体与水合的支持物之间的两亲分子的双层，其中所述双层包含至少部分的细胞膜。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法或双层，其中所述细胞膜组分提供为整体的细胞膜或细胞膜碎片，或者为亚细胞膜制备物，或者为完整或破碎的亚细胞细胞器，或者为源于细胞膜碎片的脂质体、或源于经纯化的组分的脂质体、或源于细胞的质膜或亚细胞区室的细胞膜碎片的形式。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法或双层，其中所述细胞膜是真核细胞膜，或者其中所述细胞膜是原核细胞膜，或者其中所述膜是病毒膜。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法或双层，其中所述两亲分子是脂质分子。
13.如权利要求12所述的方法或双层，其中所述脂质分子选自包括脂肪酰、甘油脂质、甘油磷脂、鞘脂、留醇、异戊烯醇脂质、聚酮化合物、磷脂和糖脂的组。
14.如权利要求12所述的方法或双层，其中所述脂质包括下组中的任何物质，所述组包括甘油一油酸酷；1，2-ニ油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC) ; 1，2-ニ植烷酰-sn_甘油-3-磷脂酰胆碱(DPhPC);棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC) ;1_棕榈酰-2-油酰-磷脂酰こ醇胺(POPE) ; I-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰こ醇胺和I-棕榈酰-2-油酰磷脂酰甘油(POPE/P0PG)混合物；或者上述物质的混合物。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法或双层，其中ー个或多个所述单层和/或所述双层中的两亲分子为相同或不同的类型。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法或双层，其中所述水合的支持物包含固体或半固体基底。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法或双层，其中所述水合的支持物是亲水的。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法或双层，其中所述水合的支持物是多孔或无孔的。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法或双层，其中所述水合的支持物包含选自粗琼脂、壳聚糖或明胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、交联的聚こニ醇、硝化纤维素、聚碳酸酷、阳极化材料、聚醚砜、こ酸纤维素、尼龙、高氟化树脂材料、中孔ニ氧化硅、水和玻璃，或者上述物质的组合的组中的任何物质。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法或双层，其中所述水合的支持物是蛋白或分析物分离凝胶。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法或双层，其中所述亲水体是液体、固体或半固体或上述形式的混合物。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法或双层，其中所述亲水体包括水溶液的液滴。
23.如权利要求22所述的方法或双层，其中所述液滴的直径为5nm-10cm。
24.如权利要求1-21中任一项所述的方法或双层，其中所述亲水体包含水合的固体或半固体支持物/基底。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法或双层，其中所述疏水介质是油。
26.如权利要求25的所述方法或双层，其中所述油是烃。
27.如权利要求25的所述方法或双层，其中所述油选自包括烷烃、烯烃、氟化的油、基于硅酮的油和四氯化碳的组。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法或双层，其中能够在形成所述两亲分子的双层后调整其面积。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法或双层，其中所述双层中包含ー种或多种膜相关蛋白。
30.权利要求8-29中任一项所述的双层用于检测能够与所述双层中的两亲分子或所述双层中的膜相关蛋白相互作用的化合物/分析物的用途。
31.权利要求8-29中任一项所述的双层用于检测与在所述双层中重建的膜组分相互作用的蛋白或分子的用途。
32.权利要求8-29中任一项所述的双层用于研究和/或筛选细胞膜-蛋白；研究和/或筛选与重建的膜相互作用的分析物；和研究和/或筛选能够与含有源自不同细胞类型的重建的膜的双层相互作用的化合物的用途。
33.权利要求8-29中任一项所述的双层用于研究所述双层中的膜相关蛋白跨膜转运分子的能力的用途。
34.权利要求8-29中任一项所述的双层用于研究所述双层的力学变化对所述双层中的蛋白或对所述双层自身的影响的用途。
35.如权利要求30-34中任一项所述的用途，其中通过将要测试、研究和/或用于筛选的化合物/分析物置于所述亲水体和/或所述水合的支持物和/或所述疏水介质中而将其引入所述双层中。
36.如权利要求30-35中任一项所述的用途，其中所述分析物/化合物获得自或包含于环境或生物学样品中。
37.如权利要求30-36中任一项所述的用途，其中一种或多种检测手段用来检测所述两亲分子的双层或者插入所述双层的膜相关蛋白的化学、生物化学、电学、光学、物理和/或环境性质。
38.如权利要求37所述的用途，其中所述检测手段包括电极，其用来检测所述双层中经过蛋白通道的离子电流的变化，或者所述水合的支持物、亲水体或双层中的分子的电化学性质；酶促測定；免疫測定；放射或荧光标记；外观的可见变化；以及光谱法。
39.ー种增加权利要求8-29中任一项所述的双层中的膜相关蛋白浓度的方法，所述方法 包括 i)提供水合的支持物与亲水体之间的双层； )将膜相关蛋白引入所述双层； iii)减小所述双层的面积并且浓缩所述双层中的蛋白。
40.ー种使双层从第一位置转移至第二位置同时保持所述双层的方法，所述方法包括提供权利要求8-29中任一项所述的双层，然后使所述双层从第一位置转移至第二位置同时保持所述双层。
41.如权利要求40所述的方法，其中在转移所述双层时，通过保持所述亲水体与所述水合的支持物之间的接触来保持所述双层。
42.如权利要求40或41所述的方法，其中通过相对于所述水合的支持物移动所述亲水体，或者通过相对于所述亲水体移动所述水合的支持物，或者它们的组合来转移所述双层。
43.如权利要求40-42中任一项所述的方法，其中在转移所述双层时，所述双层中的一种或多种膜相关蛋白保留在所述双层中。
44.如权利要求40-43中任一项所述的方法，其中在所述第一位置所述双层接触第一测试样品，并且在所述第二位置所述双层接触第二测试样品。
45.如权利要求40-44中任一项所述的方法，其中通过跨过所述水合的支持物移动所述亲水体来转移所述双层，并且其中所述水合的支持物包含两种或更多种要测试的分析物/化合物。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述水合的支持物是蛋白或DNA分离凝胶。
47.两个或更多个权利要求8-29中任一项所述的双层的阵列，其中在两个或更多个亲水体与一个或多个水合的支持物之间，或者在一个或多个亲水体与两个或更多个水合的支持物之间形成所述两个或更多个双层。
48.一种筛选包含重建的细胞膜组分的两亲分子的双层与文库中的ー种或多种化合物之间的相互作用的方法，所述方法包括 i)提供权利要求8-29中任一项所述的双层产品； )跨过水合的支持物的表面转移亲水体，由此转移所述双层；和 iii)检测所述双层与所述水合的支持物和/或亲水体中的化合物之间的任何相互作用。
49.权利要求8-29中任一项所述的双层产品用于鉴定能够与位于所述双层中的源于细胞膜的膜相关蛋白和/或其他膜组分相互作用的物质的用途。
50.权利要求8-29中任一项所述的双层产品在药物开发或医学诊断中用于原代细胞筛选的用途。
51.ー种双层产品，其包含浸于疏水介质中的亲水体和水合的支持物，其中包含两亲分子的双层在所述亲水体与所述水合的支持物之间，其特征在于所述双层包含至少部分的细胞膜。
52.实质上如此处或參照实施例所述的方法、用途、双层或双层产品。
全文摘要
一种制备双层的方法，所述方法包括(a)提供浸于疏水介质中的水合的支持物和亲水体，其中在所述疏水介质与所述亲水体之间的界面上形成两亲分子的第一单层，并且在所述疏水介质与所述水合的支持物之间的界面上形成两亲分子的第二单层；和(b)使所述第一单层与所述第二单层接触以形成两亲分子的双层，其中在所述水合的支持物中或上，和/或在所述亲水体中提供包含细胞膜组分的至少部分的细胞膜；从而在形成所述双层期间或之后将细胞膜的组分并入所述双层中。按照本发明的方法制得的双层，以及该双层的用途。
文档编号G01N33/92GK102687021SQ201080044428
公开日2012年9月19日 申请日期2010年8月4日 优先权日2009年8月7日
发明者J·R·汤普森, M·I·华莱士, S·莱普廷 申请人:埃斯埃斯发明有限公司
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