专利名称：：一种灯盏花素前体脂质体的质量控制方法
技术领域：
：本发明涉及药品
技术领域：
，具体涉及灯盏花素前体脂质体的质量控制方法。
背景技术：
：随着脂质体和前体脂质体在药剂学中的应用，脂质体和前体脂质体作为药物载体的研究己成为热点，甜体脂质体克服了脂质体的稳定性较差、聚集、沉降、融合渗漏等缺陷，因而甜体脂质体作为药物载体更受医药界的重视。包封率是脂质体制剂(包括前提脂质体)的重要质量控制指标之一。脂质体包封率的测定方法较多，有透析法、大孔吸附树脂分离法、鱼精蛋白沉淀法等，但这些包封率的测定方法存在需要的脂质体量大、耗时较长、分离不完全等缺点。而本发明采用凝胶柱色谱法或离心法分离灯盏花素前体脂质体与游离药物，操作简便易掌握，检测准确度和精确度高，增强了灯盏花素前体脂质体的可控性，建立了灯盏花素前体脂质体包封率的分析方法。灯盏花素(6rew'sca贝'/7e)是从菊科飞蓬属植物短葶巨蓬(Kr&er朋ZreKJ'scsp"s(Y朋t.y>#a/7f/-#朋》中提取的，以灯盏乙素(sci/z^Waw'/7)为主并含少量灯盏甲素(spj>e/7&-7-0-^"c"r朋We)及其它黄酮类成分的混合物。灯盏花素的药品在治疗脑梗塞、脑血栓形成、冠心病、心绞痛等心脑血管疾病的上有显著疗效。为提高灯盏花素的生物利用度，对灯盏花素前体脂质体的研究已有一些报道。灯盏花素前体脂质体的制备方法较多，但通常是将灯盏花素先制备成脂质体，再进行特殊处理而制成，如冻融法、重建法、喷雾法、喷雾干燥法、旋转蒸发法。为了更好地控制灯盏花素前体脂质体的质量，本申请人(云南植物药业有限公司)针对本公司生产的灯盏花素前体脂质体药品进行了质量控制方面的系统研究，其中包封率是评价甜体脂质体内在质量(包括脂质体质量)的重要指标和发挥疗效的关键，在此关键技术指标的质量控制方面，本申请人采用凝胶柱色谱法结合高效液相色谱法(HPLC法)或者采用离心法结合高效液相色谱法(HPLC法)对药物进行分离及检测，建立了对灯盏花素前体脂质体包封率的检测技术条件，研究出一套高质量和行之有效的灯盏花素前体脂质体的质量控制方法，保证了本公司生产的灯盏花素前体脂质体药品的质量，也为灯盏花素前体脂质体的质量控制提供了科学技术手段。
发明内容本发明的目的针对包封率是评价灯盏花素前体脂质体药品的关键技术指标问题和克服现有技术中存在包封率的测定需要的脂质体量大、耗时较长、分离不完全的缺陷，在包封率的检测方法上做了改进，提供一种高质量和行之有效的灯盏花素前体脂质体的质量控制方法，增强灯盏花素前体脂质体的质量可控性，保证本公司生产的灯盏花素前体脂质体药品的质量。本发明与现有技术相比的有益效果是-1、本发明采用凝胶柱色谱法或离心法分离灯盏花素前体脂质体与游离药物，水化后的脂质体样品不用稀释即可进行分离，可降低稀释所带来的药物渗漏，分离时，凝胶柱色谱法分离只需脂质体0.5ml，分离时间需2h，离心法分离只需脂质体5ml，分离时间需2h,而透析法进行分离，需要的脂质体量大(50ml)，分离时间较长需8h，(赵远党，章一新，钱云良等5-FU变形脂质体工艺的改进及其体外透�：鄣氖笛檠芯縖J].中国美容整形外科杂志，2008，4，19(2):96-99.)，因此本发明大大节约了成本，节省了检测时间。2、本发明操作简便易掌握、快速、重现性好、检测准确度和精确度高，增强了灯盏花素前体脂质体的可控性，更好地确保了灯盏花素前体脂质体的制剂合格。本发明方法的技术方案是由灯盏花素前体脂质体的制备、凝胶柱色谱分离灯盏花素前体脂质体或者离心分离灯盏花素前体脂质体、高效液相色谱法检测灯盏花素前体脂质体的包封率三个歩骤组成，按以下步骤进行1、灯盏花素前体脂质体的制备按重量份数，精密称取灯盏花素5-10份，大豆磷脂10-40份，维生素E0.5-2份，甘露醇或乳糖20-80份；将大豆磷脂、维生素E溶于无水乙醇50-2000mL中，将其注入至已配好的灯盏花素水溶液0.5-5L中，并用0.lmol/L的NaOH调PH6.8使其溶解，搅拌30min，同时减压至真空压为0.06kPa除去乙醇，之后加入甘露醇或乳糖搅拌溶解，即得灯盏花素脂质体混悬液。将此混悬液按喷干条件为进口温度120。C，流速2.0ml，min—、雾化压力180kPa进行喷干，即得干燥、流动性好的灯盏花素前体脂质体(粉末状态)。2、凝胶柱色谱分离灯盏花素前体脂质体或者离心分离灯盏花素前体脂质体(粉末状态是前体脂质体，水化后的混悬液即变成脂质体)采用凝胶柱色谱分离灯盏花素前体脂质体精密量取步骤1所制备的灯盏花素前体脂质体粉末加纯化水水化配制成10mg/ml的脂质体混悬液，精密量取此脂质体混悬液0.5ral滴加在交联葡聚糖G50凝胶柱上，然后用PH6.8的磷酸盐缓冲液(PBS液)以lml/min的流速洗脱，连续收集80ml。将洗脱液在80。C的低温蒸干，加甲醇lml使其溶解并转移至容量瓶中，用甲醇稀释IOO倍即得供试品溶液A,;另^^精密量取上述脂质体混悬液0.5ml用甲醇稀释1000倍即得供试品溶液A2。所得供试品5溶液A,和供试品溶液A2备用待检测(供试品溶液A,用于检测洗脱液中灯盏花素含量，即用于检测灯盏花素前体脂质体中包封的灯盏花素药物含量；供试品溶液&用于检测灯盏花素前体脂质体中灯盏花素药物总含量)。'或者采用离心分离灯盏花素甜体脂质体精密量取歩骤1所制备的灯盏花素前体脂质体粉末加纯化水水化配制成10mg/ml的脂质体混悬液，精密量取此脂质体混悬液5mL，离心30min，转速18000r/min，共离心3次，每次间隔30min，取上清液，将沉淀脂质体用蒸馏水洗3次，每次4ml，其洗液与上清液合并，将合并后的上清液在8(TC的低温蒸干，分别加甲醇lml使其溶解并转移至容量瓶中用甲醇稀释100倍即得供试品溶液K:。另外精密量取上述脂质体混悬液0.5ml用甲醇稀释1000倍即得供试品溶液K2。所得供试品溶液K,和供试品溶液K2备用待检测(供试品溶液Id用于检测上清液中的灯盏花素含量，即用于检测灯盏花素前体脂质体中未包封的灯盏花素含量；供试品溶液K2用于检测母液中的灯盏花素含量，即检测灯盏花素甜体脂质体中灯盏花素药物总含量)。3、高效液相色谱法检测灯盏花素前体脂质体的包封率(1)对照品溶液的配制精密称取纯度为99%以上的野黄芩苷(灯盏乙素)25mg，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释制成含1000ug/ml的贮备液。精密吸取该贮备液0.5ml，置25ml容量瓶中，流动相为甲醇-乙腈-40mmol/L10^04(磷酸调ffl2.5)且其体积比为20:10:70，加该流动相至刻度，摇匀，制成每lml含20txg的溶液，即得。(2)色谱条件和系统适用性试验色谱柱AgilentZORBAXSB-C184.6rnmX250mm，5^m;以甲醇-乙腈-40mmol/LKH2P04(磷酸调ra2.5)(20:10:70)为流动相；检测波长为335nm;流速1.Oml/min;柱温35。C。理论板数按野黄芩苷计算不低于4000。(3)测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10ul，注入液相色谱仪，测定，按外标法以峰面积计算，即得灯盏花素含量。(4)包封率的计算z①采用凝胶柱色谱分离灯盏花素前体脂质体，其包封率的计算为包封率:WM/WA2X100%，其中Ww为供试品溶液Ai中灯盏花素含量，即灯盏花素前体脂质体中包封的灯盏花素药物含量；WA2为供试品溶液A2中灯盏花素含量，即灯盏花素前体脂质体中灯盏花素药物总含量。②采用离心分离灯盏花素甜体脂质体，其包封率的计算为包封率^WK2-WK,)/WK2X100。/。，其中WK,为上清液中的灯盏花素含量，即灯盏花素前体脂质体中未包封的灯盏花素含量；WK2为母液中的灯盏花素含量，即灯盏花素前体脂质体中灯盏花素药物总含量。上述试药中灯盏花素对照品的含量为99%以上，可由国家规定的药品检验单位提供，乙腈为HPLC级、甲醇为色谱纯、维生素E含量99.8M、磷酸二氢钾及甘露醇为分析纯、大豆磷脂(PC含量〉50。/。)，这些均可从市场上购买。水为纯净水。所用仪器为Waters高效液相色谱仪。具体实施例方式以下用实施例对本发明作进一步的说明，可以更清楚地理解本发明。实施例1本发明灯盏花素前体脂质体的质量控制方法，按以下步骤进行仪器与试药灯盏花素对照品含量为99.2%由云南省药品检验所提供；乙腈(HPLC级)、甲醇(色谱纯)、维生素E(含量99.8M)均由默克公司产品；磷酸二氢钾及甘露醇为分析纯，水为纯净水。大豆磷脂(PC含量〉50。/。)由上海太伟药业有限公司提供。所用仪器为Waters高效液相色谱仪。1、灯盏花素前体脂质体的制备按重量份数，精密称取取灯盏花素5g，大豆磷脂10g，维生素E0.5g，甘露醇20g;将大豆磷脂、维生素E溶于无水乙醇50mL中，将其注入至已配好的灯盏花素水溶液500ml中，并用0.lmol/L的NaOH调ffl6.8使其溶解，搅拌30分钟，同时减压至真空压为0.06kPa除去乙醇，之后加入甘露醇搅拌溶解，即得灯盏花素脂质体混悬液。将此混悬液按喷干条件为进口温度120。C，流速2.0mlmin—、雾化压力180kPa进行喷干，即得干燥、流动性好的灯盏花素前体脂质体粉末。2、凝胶柱色谱分离灯盏花素前体脂质体或者离心分离灯盏花素前体脂质体凝胶柱色谱分离灯盏花素前体脂质体精密量取步骤1所制备的灯盏花素前体脂质体粉末加纯化水水化配制成10mg/ml的脂质体混悬液，精密量取此脂质体混悬液O.5ml滴加在交联葡聚糖G50凝胶柱上，然后用PH6.8的磷酸盐缓冲液(PBS液)以lml/min的流速洗脱，连续收集80ml。将洗脱液在8(TC的低温蒸干，加甲醇lml使其溶解并转移至容量瓶中，用甲醇稀释IOO倍即得供试品溶液A"另外精密量取上述脂质体混悬液0.5ml用甲醇稀释1000倍即得供试品溶液A2。所得供试品溶液A和供试品溶液A2备用待检测，其分离时间用了2h(供试品溶液A,用于检测洗脱液7中灯盏花素含量，即用于检测灯盏花素前体脂质体中包封的灯盏花素药物含量；供试品溶液A2用于检测灯盏花素前体脂质体中灯盏花素药物总含量)。或者采用离心分离灯盏花素前体脂质体-精密量取步骤1所制备的灯盏花素前体脂质体粉水加纯化水水化配制成10mg/ml的脂质体混悬液，精密量取此脂质体混悬液5raL，离心30min，转速18000r/min，共离心3次，每次间隔30min，取上清液，将沉淀脂质体用蒸馏水洗3次，每次4ml，其洗液与上清液合并，将合并后的上清液在8(TC的低温蒸干，分别加甲醇lml使其溶解并转移至容量瓶中用甲醇稀释100倍即得供试品溶液K,。另外精密量取上述脂质体混悬液0.5ml用甲醇稀释1000倍即得供试品溶液K2。所得供试品溶液K,和供试品溶液K2备用待检测，其分离时间用了2h(供试品溶液K,用于检测上清液中的灯盏花素含量，即用于检测灯盏花素前体脂质体中未包封的灯盏花素含量；供试品溶液K2用于检测母液中的灯盏花素含量，即检测灯盏花素前体脂质体中灯盏花素药物总含量)。3、高效液相色谱法检测灯盏花素前体脂质体的包封率(1)含量测定①对照品溶液的配制，精密称取纯度为99.2%的野黄芩苷(灯盏乙素)25mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释制成含1000pg/ml的贮备液。精密吸取该贮备液0.5ml，置25ml量瓶中，以甲醇-乙腈-40mmol/L10^04(磷酸调ffl2.5)(20:10:70)为流动相，加该流动相至刻度，摇匀，制成每lml含20pg的溶液，即得。②色谱条件和系统适用性试验，色谱柱AgilentZORBAXSB-C184.6mmX250■，5nm;以甲醇-乙腈-40mmol/LKH2P(X(磷酸调PH2.5)(20:10:70)为流动相；检测波长为335nm;流速1.Oml/min;柱温35'C。理论板数按野黄芩苷计算不低于4000。③测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10ul，注入液相色谱仪，测定，按外标法以峰面积计算，即得灯盏花素含量。④包封率的计算，采用凝胶柱色谱分离灯盏花素前体脂质体，其包封率的计算公式为包封率二Ww/WA2X10(m，其中Ww为供试品溶液A,中灯盏花素含量，即灯盏花素前体脂质体中包封的灯盏花素药物含量；WA2为供试品溶液A2中灯盏花素含量，即灯盏花素前体脂质体中灯盏花素药物总含量。采用离心分离灯盏花素前体脂质体，其包封率的计算公式为包封率^Wk2-WK1)/WK2X100%，其中Ww为上清液中的灯盏花素含量，即灯盏花素前体脂质体中未包封的灯盏花素含量；WK2为母液中的灯盏花素含量，即灯盏花素前体脂质体中灯盏花素药物总含量。以上样品测定的包封率详见表1。表1.凝胶法和离心法检测灯盏花素前体脂质体的包封率样品进样量(Ul)峰面积(W)包封率Ii367424(WA1)A2404092(WA2)90.9%10Kl79409(WK,)K2509137(WK2)84.4%(2)专属性试验照含量测定项下的色谱条件检测，空白辅料(精密称取空白辅料25mg，制成每lml含20Pg的溶液)，在335nm波长处基本无吸收，也没有明显的溶剂峰，因此，辅料对样品的测定无干扰。(3)理论板数的测定精密吸取上述配制的对南、品溶液10wl，注入液相色谱仪，照含量测定项下的色谱条件检测，记录色谱图。结果测得理论板数按野黄芩苷计算为〉4000，符合规定。(4)线性关系试验精密称取野黄芩苷(灯盏乙素)对照品2.5mg，置25ml量瓶中，加甲醇适量，超声使其溶解，放冷(20°C)，加甲醇至刻度，摇匀，得浓度为20(Vg/ml的贮备液。精密量取贮备液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0ml，置25ml量瓶中，加流动相至刻度(流动相与含量测定项下相同，以下流动相均相同)，得到相应浓度的标准系列溶液，分别精密吸取各标准系列溶液l(Vl注入液相色谱仪，照含量测定项下的色谱条件检测，记录色谱图。线性相关性见表2。表2野黄芩苷含量测定线性相关性试验结果浓度C(ug/ml)进样量"l)峰面积(A)2.00101185474.00102287078.001046046916.001095643232.00101926769线性回归方程为A=60533C-12480r=0.99999野黄芩苷在浓度范围2.00-32yg/ml内浓度和峰面积呈良好的线性相关性。(5)系统重现性试验取浓度为16.00ug/ml对照品溶液，精密吸取10y1注入液相色谱仪，照含量测定项下的色谱条件检测，连续进样6次。结果见表3。表3野黄零苷含量测定系统重现性试验测定结果i^^i§^~~RSD(%)峰面积9696269748859794009885299116039847949791400.69结果表明野黄芩苷的含量测定色谱系统重现性较好。(6)方法稳定性试验取灯盏花素前体脂质体适量(约0.9g)(约相当于灯盏花素100mg)，置10ml容量瓶中，加蒸馏水定容,振摇至无肉眼可见固体微粒，即得灯盏花素脂质体混悬液。将此混悬液用甲醇稀释100倍后，得一澄明溶液，将此澄明溶液用流动相稀释10倍。取此溶液，于室温下(20-24°0放置，每隔2小时进样一次，进样量为IOPI注入液相色谱仪，照含量测定项下的色谱条件检测，试验结果见表4。表4灯盏花素前体脂质体含量测定方法稳定性考察试验结果时间(h)峰面积变化率(％)RSD(%)0759767—27592350.0747533260.850.6667522030.187547720.66107543780.71试验结果表明，含量测定所配制的溶液在10h内是稳定的。(7)加样回收率试验取野黄芩苷90mg，按照含量测定项下的条件和方法，依法操作，精密加入一定量的对照品，加甲醇至刻度(25mL)，得低、中、高三个浓度的回收率样品溶液。进样分析，进样量为10y1注入液相色谱仪，计算测得量。测得量和已知量(已知量是加入的2mg对照品)之差与实际加入量相比较，即得回收率。结果见表5。10表5野黄芩苷含量测定加样回收率试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>99.58结论本法回收率较好。实施例2也为本发明的灯盏花素前体脂质体的质量控制方法，除步骤1灯盏花素前体脂质体的制备不同外，其余步骤均与实施例1相同，不再赘述，测定结果详见表6，其分离时间用了2h。其步骤1灯盏花素前体脂质体的制备如下按重量份数，精密称取取灯盏花素8g，大豆磷脂20g，维生素Elg，甘露醇30g;将大豆磷脂、维生素E溶于无水乙醇100mL中，将其注入至已配好的灯盏花素水溶液2000ml中，并用0.lmol/L的NaOH调PH6.8使其溶解，搅拌30分钟，同时减压至真空压为0.06kPa除去乙醇，之后加入甘露醇搅拌溶解，即得灯盏花素脂质体混悬液。将此混悬液按喷干条件为进口温度12(TC，流速2.0mlmin—'，雾化压力180kPa进行喷干，即得干燥、流动性好的灯盏花素前体脂质体粉末。实施例'3也为本发明的灯盏花素前体脂质体的质量控制方法，除步骤1灯盏花素前体脂质体的制备不同外，其余步骤均与实施例1相同，不再赘述，测定结果详见表7。其分离时间用了2h。其步骤1灯盏花素前体脂质体的制备如下按重量份数，精密称取灯盏花素10g，大豆磷脂40g，维生素E2g，乳糖80g;将大豆磷脂、维生素E溶于无水乙醇2000mL中，将其注入至已配好的灯盏花素水溶液5000ral中，并用0.lmol/L的NaOH调PH6.8使其溶解，搅拌30分钟，同时减压至真空压为0.06kPa除去乙醇，之后加入乳糖搅拌溶解，即得灯盏花素脂质休混悬液。将此混悬液按喷干条件为进口温度120。C，流速2.0ml'min—'，雾化压力180kPa进行喷干，即得干燥、流动性好的灯盏花素甜体脂质体粉末。表6实施例2中凝胶法和离心法检测灯盏花素前体脂质体的包封率进样量(u1)峰面积(W)包封率II353245(WA1)A2421032(WA2)83.9%10Kl70905(WK1)K2510108(WK2)86.1%表7实施例3中凝胶法和离心法检测灯盏花素前体脂质体的包封率进样量U1)峰面积(W)包封率II358927(WA1)A2412087(WA2)87.1%10Kl69013(WK1)K2511209(WK2)86.5%根据以上三个实施例和表中数据可以看出本发明的检测方法大大节约了成本，节省了检测时间，而透析法在检测中需要的脂质体量大(50mL)，且耗时较长(8h)(见赵远党，章一新，钱云良等5-FU变形脂质体工艺的改进及其体外透�：鄣氖笛檠芯縖J].中国美容整形外科杂志，2008,4,19(2):96-99.)。本发明方法还操作简便易掌握，重现性好，检测准确度和精确度高。权利要求1、一种灯盏花素前体脂质体的质量控制方法，由灯盏花素前体脂质体的制备、凝胶柱色谱分离灯盏花素前体脂质体或者离心分离灯盏花素前体脂质体、高效液相色谱法检测灯盏花素前体脂质体的包封率三个步骤组成，其特征在于，按以下步骤进行(1)灯盏花素前体脂质体的制备按重量份数，精密称取灯盏花素5-10份，大豆磷脂10-40份，维生素E0.5-2份，甘露醇或乳糖20-80份；将大豆磷脂、维生素E溶于无水乙醇50-2000mL中，将其注入至已配好的灯盏花素水溶液0.5-5L中，并用0.1mol/L的NaOH调PH6.8使其溶解，搅拌30min，同时减压至真空压为0.06kPa除去乙醇，之后加入甘露醇或乳糖搅拌溶解，即得灯盏花素脂质体混悬液；将此混悬液按喷干条件为进口温度120℃，流速2.0ml·min-1，雾化压力180kPa进行喷干，即得干燥、流动性好的灯盏花素前体脂质体；(2)凝胶柱色谱分离灯盏花素前体脂质体或者离心分离灯盏花素前体脂质体采用凝胶柱色谱分离灯盏花素前体脂质体，即精密量取步骤1所制备的灯盏花素前体脂质体粉末加纯化水水化配制成10mg/ml的脂质体混悬液，精密量取此脂质体混悬液0.5ml滴加在交联葡聚糖G50凝胶柱上，然后用PH6.8的磷酸盐缓冲液以1ml/min的流速洗脱，连续收集80ml；将洗脱液在80℃的低温蒸干，加甲醇1ml使其溶解并转移至容量瓶中，用甲醇稀释100倍即得供试品溶液A1；另外精密量取上述脂质体混悬液0.5ml用甲醇稀释1000倍即得供试品溶液A2；所得供试品溶液A1和供试品溶液A2备用待检测；或者采用离心分离灯盏花素前体脂质体，即精密量取步骤1所制备的灯盏花素前体脂质体粉末加纯化水水化配制成10mg/ml的脂质体混悬液，精密量取此脂质体混悬液5mL，离心30min，转速18000r/min，共离心3次，每次间隔30min，取上清液，将沉淀脂质体用蒸馏水洗3次，每次4ml，其洗液与上清液合并，将合并后的上清液在80℃的低温蒸干，分别加甲醇1ml使其溶解并转移至容量瓶中用甲醇稀释100倍即得供试品溶液K1；另外精密量取上述脂质体混悬液0.5ml用甲醇稀释1000倍即得供试品溶液K2；所得供试品溶液K1和供试品溶液K2备用待检测；(3)高效液相色谱法检测灯盏花素前体脂质体的包封率①对照品溶液的配制，精密称取纯度为99％以上的野黄芩苷25mg，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释制成含1000ug/ml的贮备液；精密吸取该贮备液0.5ml，置25ml容量瓶中，流动相为甲醇-乙腈-40mmol/LKH2PO4且其体积比为20∶10∶70，该流动相用磷酸调至PH2.5，加该流动相至刻度，摇匀，制成每1ml含20μg的溶液，即得；②色谱条件和系统适用性试验，色谱柱AgilentZORBAXSB-C184.6mm×250mm，5μm；以甲醇-乙腈-40mmol/LKH2PO4且其体积比是20∶10∶70为流动相；该流动相用磷酸调至PH2.5；；检测波长为335nm；流速1.0ml/min；柱温35℃；理论板数按野黄芩苷计算不低于4000；③测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，按外标法以峰面积计算，即得灯盏花素含量。全文摘要本发明提供一种灯盏花素前体脂质体的质量控制方法，由灯盏花素前体脂质体的制备、凝胶柱色谱或者离心分离其前体脂质体、高效液相色谱法检测其包封率各步骤组成，属药品
技术领域：
。其前体脂质体含灯盏花素5-10份，大豆磷脂10-40份，维生素E0.5-2份，甘露醇或乳糖20-80份；凝胶柱色谱分离需脂质体混悬液0.5ml，离心分离需脂质体混悬液5mL，离心30min，转速18000r/min；检测包封率以甲醇-乙腈-40mmol/LKH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(20∶10∶70)为流动相；检测波长为335nm；理论板数按野黄芩苷计算不低于4000。该方法大大节约了成本和节省了检测时间，操作简便，检测准确度和精确度高。文档编号G01N30/00GK101493444SQ200910094119公开日2009年7月29日申请日期2009年2月23日优先权日2009年2月23日发明者吕小波,敏周,文李,黄春球申请人:云南植物药业有限公司
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