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专利名称：：乙型肝炎病毒核心抗体IgM化学发光免疫分析测定试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及免疫诊断
技术领域：
，具体地，本发明提供了一种乙型肝炎病毒核心抗体IgM(抗HBc-IgM)化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：乙型肝炎是一种发病率较高，对人类有着巨大�：Φ拇�染性疾病。机体感染乙型肝炎病毒(HBV)后，体液免疫反应首先产生以IgM为主的免疫球蛋白，随后IgM抗体滴度下降，IgG效价迅速上升。因此，抗HBc-IgM的检测可作为HBV感染早期诊断的指标，尤其是对乙肝表面抗原(HBsAg)阴性的急性肝炎病人有鉴别诊断意义。同时抗HBc-IgM与HBV在体内活动性复制成正相关，抗HBc-IgM阳性提示患者近期有乙型肝炎病毒感染或慢性乙型肝炎患者的乙型肝炎病毒有活动性复制，患者血液有很强的传染性。有报道指出，在急性乙型肝炎病毒感染后抗HBc-IgM可持续存在多年，在慢性乙型肝炎病程中，抗HBc-IgM的出现与病情急性活动的高峰一致或者稍晚，并认为随着病情的控制而好转，部分患者的抗HBc-IgM可能阴转，所以抗HBc-IgM阳性还要结合临床症状具体分析。随着医学检验水平的提高，对乙肝患者进行抗HBc-IgM的检测对于乙肝的分型及治疗有着重要的意义。目前用于^r测乙型肝炎病毒核心抗体IgM的免疫方法主要有酶免疫测定(enzymeimmunoassay,EIA)、放射免疫测定(radioimmunoassay,RIA)、免疫萸光测定(enzyme-linkedfluorescenceassay,ELFA)、微粒子酶免发光分析(microparticleenzymeimmunoassay,MEIA)以及直接标记化学发光免疫效']定(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA)。这些超微量检测技术的基本理论大体相同，但是所用示踪剂及所发出的信号各不相同。根据大量的试验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，依次为化学发光免疫分析、荧光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。放射免疫分析技术因其使用放射性元素作为标记物，因此对环境有一定污染性，并存在操作复杂，测定结果不稳定，试剂保存时间短等缺点。酶免疫分析法灵敏度低，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性。化学发光免疫分析法是一种较先进而有效的方法，可使检测灵敏度达到10"s摩尔水平，而且检测范围可达6个数量级，又因为酶标记物稳定，可长期使用，因而得到了越来越多的关注。用酶促化学发光免疫分析检测乙型肝炎病毒核心抗体IgM是先进而有效的方法，有助于促进化学发光免疫分析技术在临床检验、检测中的应用与发展。
发明内容本发明将化学发光技术与乙型肝炎病毒核心抗体IgM的免疫分析有效结合，通过大量的实验冲企^r及临床研究表明本发明的试剂盒具有较高的特异性、敏感性和重复性，为临床诊断、各级血站、采浆站和科研工作提供了一种非常有价值的检测手段。本发明的目的是提供一种乙型肝炎病毒核心抗体IgM的化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。根据本发明的试剂盒包括乙型肝炎病毒核心抗体IgM阴阳性对照品；抗人IgM包被的载体；酶标记的乙型肝炎病毒核心抗体；中和抗原；上述酶所作用的化学发光底物和浓缩洗涤液。才艮据本发明的试剂盒，其中，所述乙型肝炎病毒核心抗体IgM阳性对照品以新生牛血清为基质；所迷抗人IgM包被的载体为微孔板或塑料管；所迷标记乙型肝炎病毒核心抗体的酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶；所述中和抗原为乙肝病毒核心抗原；所述浓缩洗涤液为含吐温20的Tris-HCl緩冲液或含吐温20的磷酸盐緩冲液(PBST)。根据本发明的试剂盒，所述碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记乙型肝炎病毒核心抗体的工作浓度为1:1000-5000，其中，碱性磷酸酶稀释液采用的是含10%新生牛血清，0.1%生物防腐剂Proclin300,150mMNaCl的0.10MTris-HCl緩冲液(pH7.5);辣根过氧化物酶稀释液采用的是含20%新生牛血清，0.1%生物防腐剂Proclin300的0.02M磷酸盐緩冲液(pH7.4)。所述乙肝病毒核心抗原的工作浓度为1:4000-9000,其中所用稀释液同上所述。根据本发明的试剂盒，其中，所述化学发光底物为碱性磷酸酶作用的底物或辣根过氧化物酶作用的底物，其中，碱性磷酸酶作用的底物可以为(金刚烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-曱氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star;辣根过氧化物酶作用的底物包含A液和B液，其中，A液是0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩冲液，包括10mM鲁米诺、0.3mM4-羟基联苯、0.05mM4-碘苯硼酸；B液是0.2MpH7.2磷酸盐緩冲液，包括3.5mM过氧化脲、0.1%Tween20。根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤1)以乙型肝炎病毒核心抗体IgM阴性、阳性人血清配制阴阳性对照品；2)以抗人IgM包被载体；3)用酶标记乙型肝炎病毒核心抗体；4)配制中和抗原；5)配制酶所作用的化学发光底物；6)配制浓缩洗涂液；7)分装上述阴阳性对照品、包被载体、酶标记物、中和抗原、化学发光底物和浓缩洗涤液；8)组装为成品。根据本发明的方法，抗人IgM包被的栽体为微孔板或塑料管；根据本发明的方法，抗人IgM包被载体是通过直接物理吸附法将抗人IgM包被在载体上；根据本发明的方法，酶标记乙型肝炎病毒核心抗体中的酶可以为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。如用碱性磷酸酶进行标记则采用的是戊二醛法；如用辣根过氧化物酶进行标记则采用改良的过硤酸钠法。根据本发明的方法，所述化学发光底物可以为碱性磷酸酶作用的底物或辣根过氧化物酶作用的底物，其中，碱性磷酸酶作用的底物可以为(金刚烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-曱氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star;辣根过氧化物酶作用的底物包含A液和B液，其中，A液是0.2MpH8.7硼酸-硼砂缓冲液，包括10mM鲁米诺、0.3mM4-鞋基联苯、0.05mM4-碘苯硼酸；B液是0.2MpH7.2磷酸盐緩冲液，包括3.5mM过氧化脲、0.1%Tween20。具体的上述试剂盒可以包括抗HBc-IgM阴阳性对照品、抗人IgM包被板、酶标记物、中和抗原、化学发光底物与浓缩洗涤液等。其中，所述抗HBc-IgM阳性对照的原料为抗HBc-IgM阳性人血清；抗人IgM包被板为48或96孔的微孔板条；标记抗HBc-IgM的酶为辣根过氧化物酶；中和抗原为乙肝核心抗原；化学发光底物为鲁米诺体系；浓缩洗涤液为20倍PBST洗液。本发明"乙型肝炎病毒核心抗体IgM化学发光免疫分析测定试剂盒，，采用的是捕获法反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。它具有特异性强，重复性好、稳定等优点，且各项指标均达到同类试剂盒的分析水平，为临床提供了一种检测乙肝病毒核心抗体IgM的更准确、简便、快速的方法，有较好的临床应用价值。具体实施例方式实施例1制备本发明的乙型肝炎病毒核心抗体IgM化学发光免疫分析测定试剂盒一、抗HBc-IgM阴阳性对照品的制备阳性对照品经确切方法确定的高滴度抗HBc-IgM阳性人血清混合成阳性血浆(血浆份数大于5),56。Cl小时加温灭活后，然后使用新生牛血清进行适当稀释，加入生物防腐剂和万分之一(W/V)的食品红使之成为红色，除菌过滤，2-8'C保存。阴性对照品选用抗HBc-IgM检测为阴性的人血清混合(血浆份数大于10)56。Cl小时加温灭活后，除菌过滤，2-8。C保存。二、固相包被板的制备将0.05MpH9.6的碳酸盐包被緩冲液与抗人IgM混合，然后加入微孔板各孔中，每孔IOOPL,4'C放置24h。然后用PBST洗三次，在吸水纸上拍干，再用含1.0%BSA,0.1%Proclin300,0.9%NaCl,3.8mMNaH2P042H20,16.2mMNa2HP0412H20的封闭液进行封闭，每孔分别加入封闭液180pL，室温放置2小时后，甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时后，立即进行封袋，贴签后置28'C保存。三、酶标乙型肝炎病毒核心抗体的制备乙型肝炎病毒核心抗体采用改良的过碘酸钠氧化标记法与辣根过氧化物酶偶联。经PBS緩冲液充分透析后，加等体积甘油，-20°C以下保存备用。用含有20%新生牛血清，0.1%生物防腐剂Proclin300的0.02M磷酸盐緩冲液(pH7.4)酶标记物稀释液按照一定的稀释度进行稀释。采用方阵法选择酶标记物的工作浓度范围为1:1000-5000。四、中和抗原制备本发明使用辣根过氧化物酶时，配制中和抗原所用的稀释液为含有20%新生牛血清，0.1%生物防腐剂Proclin300的0.02M磷酸盐緩冲液(pH7.4)。采用方阵法选择中和抗原的工作浓度范围为1:4000-9000。五、化学发光底物本发明所使用的辣根过氧化物酶的化学发光底物液的配制方法A液是0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，包括10mM鲁米诺、0.3mM4-羟基联苯、0.05mM4-碘苯硼酸；B液是0.2MpH7.2磷酸盐緩沖液，包括3.5mM过氧化脲、0.1%Tween20。使用方法使用前A液与B液根据使用量等体积混合。六、浓缩;先涤、液洗涤液是含有0.1~0.5%Tween-20，0.2%Proclin-300生物防腐剂的0.02M磷酸盐緩沖液(PBST),pH值为7.4,使用时用蒸馏水稀释20倍。七、半成品及成品组成将上迷組分进行分装即为半成品。对半成品进行质量检定，合格后才能组装为成品，即乙型肝炎病毒核心抗体IgM化学发光免疫分析测定试剂盒。成品盒还需进行抽检，其特异性、敏感性、精密性及稳定性等指标检验合格后方可出厂。实施例2制备本发明抗HBc-IgM化学发光免疫分析测定试剂盒除以戊二醛法将乙肝核心抗体与碱性磷酸酶标偶联，以AMPPD作为化学发光底物，用含10%新生牛血清，0.1%生物防腐剂Proclin300,150mMNaCl的0.10MTris-HCl緩冲液(pH7.5)作为酶标物及中和抗原的稀释液，用含0.5%Tween-20,0.2%Proclin-300生物防腐剂，150mMNaCl的0.05MTris-HCl緩沖液(pH7.5)为洗涤液外，其余均以与实施例1相同的方法制备抗HBc-IgM化学发光免疫分析测定试剂盒。实施例3~4制备本发明抗HBc-IgM化学发光免疫分析测定试剂盒除以塑料管作为栽体外，其余均以与实施例1,2相同的方法制备抗HBc-IgM化学发光免疫分析测定试剂盒。实施例5本发明的试剂盒的使用方法以实施例1制备的抗HBc-IgM化学发光免疫分析测定试剂盒进行实验的具体操作如下1.自4。C冰箱中取出试剂盒，室温平衡15分钟；2.设置空白对照一孔，阴、阳性对照各两孔，每孔加对照品各100iaL，将待测血清样品用生理盐水进行1:1000稀释，每孔加入稀释后的待测标本100充分混匀，封板，置37。C温育30分钟；3.弃孔内液体，用稀释后的洗涤液洗板5次，最后在干净的滤纸上扣干；4.每孔加酶标抗体结合物、中和抗原各50juL(空白对照孔除外)，充分混匀，封板，置37。C温育30分钟；5.弃孔内液体，用稀释后的洗涤液洗板5次，最后在干净的滤纸上扣干；6.每孔加等体积混合后的化学发光底物IOOiuL，必须于加化学发光底物液后的第5—30分钟内测量各孔的发光强度(RLU),测量时间1秒/孔；7.将各孔的RLU值与CUTOFF比较，样品测定值>阳性对照孔平均RLU值/30+阴性对照孔平均RLU值，则判断为阳性，否则为阴性。实施例6本发明的试剂盒的方法学检定按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，结果如下1、试剂盒特异性测定按照实施例1的试剂盒检测中国药品生物制品检定所抗HBc-IgM参考品血清盘，考察阴性及阳性参考品的符合率，结果如表1所示，表明实施例1的试剂盒阴阳性参考品的符合率达100%。表1实施例1的试剂盒检测参考品血清盘结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2、试剂盒灵敏度测定使用中国药品生物制品检定所抗HBc-IgM参考品血清盘中的3份系列稀释的灵敏度参考品血清，考察试剂盒的灵敏度。结果如表2所示，表明实施例1的试剂盒的灵敏度良好。表2实施例1的试剂盒的灵敏度<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3、试剂盒精密性测定用中国药品生物制品4企定所抗HBc-IgM参考品血清盘中国家参考品中的精密度血清，考察试剂盒的精密性。按照实施例5的方法重复至少IO孔进行检测，计算变异系数。经检测，精密性血清发光强度平均值为266246,标准偏差为23681,计算变异系数CV。/。为9%,表明所制备的乙型肝炎病毒核心抗体IgM化学发光免疫分析测定试剂盒的精密性良好。4、试剂盒稳定性实验将实施例1的试剂盒于37'C放置3天、7天、15天后，结果表明试剂盒的各项指标均能符合标准。以上说明"乙型肝炎病毒核心抗体IgM化学发光免疫分析测定试剂盒"的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性是完全符合临床要求的。实施例7本发明的试剂盒临床应用与酶免试剂盒比较使用实施例1的抗HBc-IgM测定试剂盒和市售乙肝核心抗体IgM酶联免疫试剂盒对1350例临床血清样品同时进行检测，对本发明试剂盒进行临床检测评估。一、临床血清标本的来源经临床确诊的乙肝大三阳病人血清150例；小三阳病人血清200例；丙型肝炎病毒(HCV)阳性血样78例；曱型肝炎病毒IgM(抗HAV-IgM)阳性血样54例；戊型肝炎病毒IgM(抗HEV-IgM)阳性血样23例；慢性迁延性肝炎病人血清36例；类风湿关节炎病人血清43例；HBsAg携带者血清200例；正常人血清566例。二、实验结果本发明试剂盒与酶免试剂盒检测乙肝及其他疾病及正常人群血清结果比较如表3所示表3本发明试剂盒与酶联免疫试剂盒临床血样测值比对结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>试验结果表明经检测1350例临床血清样本，本发明的"乙型肝炎病毒核心抗体IgM化学发光免疫分析测定试剂盒"与酶联抗HBc-IgM检测试剂盒的结果总符合率为99.78%,酶联抗HBc-IgM才金测试剂盒对566例正常人血清检测时出现3份灰区阳性结果。综上，利用本发明的试剂盒进行;险测，灵敏度高，特异性强，重复性好，无放射性污染，可用于临床乙肝病人血清学检查，对于乙型肝炎的临床诊断、治疗效果评价、严格筛选供血血源、阻断乙型肝炎的传播等有一定的参考价值。权利要求1.一种乙型肝炎病毒核心抗体IgM化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒主要由乙型肝炎病毒核心抗体IgM阴阳性对照品；抗人IgM包被的载体；酶标记的乙型肝炎病毒核心抗体；中和抗原；上述酶所作用的化学发光底物；以及浓缩洗涤液组成。2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述乙型肝炎病毒核心抗体IgM阳性对照品以新生牛血清为基质；所述抗人IgM包被的载体为微孔板或塑料管；所述标记乙型肝炎病毒核心抗体的酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶；所述中和抗原为乙肝病毒核心抗原；所述化学发光底物为碱性磷酸酶作用的底物或辣根过氧化物酶作用的底物；所述浓缩洗涤液为含吐温20的Tris-HCl緩冲液或含吐温20的磷酸盐緩冲液(PBST)。3、如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记乙型肝炎病毒核心抗体的工作浓度为1:1000-5000,其中，碱性磷酸酶稀释液采用的是含10%新生牛血清，0.1%生物防腐剂Proclin300,150mMNaCl的0.10MTris-HCl緩沖液(pH7.5);辣根过氧化物酶稀释液采用的是含20%新生牛血清，0.1%生物防腐剂Proclin300的0.02M磷酸盐緩冲液(pH7.4)。4、如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述乙肝病毒核心抗原的工作浓度为1:4000-9000，其中，酶标记物为碱性磷酸酶时，乙肝病毒核心抗原的稀释液采用的是含10%新生牛血清，0.1%生物防腐剂Proclin300,150mMNaCl的0.10MTris-HCl緩沖液(pH7.5);酶标记物为辣根过氧化物酶时，乙肝病毒核心抗原的稀释液采用的是含20%新生牛血清，0.1%生物防腐剂Proclin300的0.02M磷酸盐緩冲液(pH7.4)。5、如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶作用的底物为(金刚烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-曱氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star;所述辣根过氧化物酶作用的底物包含A液和B液，其中，A液是0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩冲液，包括10mM鲁米诺、0.3mM4-羟基联苯、0.05mM4-械苯硼酸；B液是0.2MpH7.2磷酸盐緩冲液，包括3.5mM过氧化脲、0.1%Tween20。6、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于，以乙型肝炎病毒核心抗体IgM阴性、阳性人血清配制阴阳性对照品；以抗人IgM(y链)包被载体；用酶标记乙型肝炎病毒核心抗体；配制中和抗原；配制酶所作用的化学发光底物；配制浓缩洗涤液，然后分装上述阴阳性对照品、包被载体、酶标记物、中和抗原、化学发光底物和浓缩洗涤液半成品，最后组装为成品。全文摘要本发明公开了一种乙型肝炎病毒核心抗体IgM化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法，属于免疫诊断
技术领域：
。所述试剂盒主要由乙型肝炎病毒核心抗体IgM阴阳性对照品，抗人IgM(μ链)包被的载体，乙型肝炎病毒核心抗体酶标记物，中和抗原，化学发光底物及浓缩洗涤液组成。所述试剂盒的制备方法包括以下步骤以乙型肝炎病毒核心抗体IgM阴性、阳性人血清配制阴阳性对照品；以抗人IgM(μ链)包被载体；用酶标记乙型肝炎病毒核心抗体；配制中和抗原；配制酶所作用的化学发光底物；配制浓缩洗涤液，然后分装上述阴阳性对照品、包被载体、酶标记物、中和抗原、化学发光底物和浓缩洗涤液半成品，最后组装为成品。经过实验室及临床研究，显示本发明试剂盒具有较高的特异性、敏感性和重复性，为临床诊断、各级血站、采浆站和科研工作提供了一种非常有价值的检测手段。文档编号G01N21/76GK101368958SQ20081010326公开日2009年2月18日申请日期2008年4月2日优先权日2008年4月2日发明者唐宝军,应希堂,坤张,黎张,胡国茂,郑金来申请人:北京科美东雅生物技术有限公司