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专利名称：苹果属植物生长素免疫组织定位的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及苹果属植物生长素免疫组织定位的方法及其应用。
背景技术：
植物激素是一些在植物体内合成的能从产生部位运送到作用部位，并在低浓度时 对生长发育具有显著生理作用的微量有机物，其可以调控植物生命活动的整个进程。因此 对植物激素的研究不仅是了解植物生长发育基本规律的途径，而且是对植物遗传、化学和 环境调控的有效手段，所以植物激素的研究与应用具有十分重要的理论意义和广阔的应用 前景。近一个世纪的研究已经比较详细地描述了它们不同的生物学效应，大量的分析化学 结果也阐明了这些生物活性分子的化学本质，但是我们仍不清楚它们的作用机理。植物体 的形成以及生命活动的循环都需要细胞分裂、伸长和分化的严格控制。启动任何一个信号 转导过程的首要前提就是信号的真实存在，一个被广泛接受的主要机制就是控制这些过程 的激素分布(Iten.M，1999)。对激素的定量分析已经揭示了植物的生长发育和生理过程与 激素水平的变化存在相关性，但对于它们在植物器官和组织中的分布情况的了解却仍然很 少。研究激素在特定的细胞和组织内的作用需要能精确描述其分布的技术。植物激素是一 些小分子化合物，缺乏免疫原性，被称为半抗原，需要与载体蛋白偶联后才能诱导宿主动物 对它们产生良好的免疫响应。对于植物激素这类小分子的免疫定位除了在制片过程中力求保持植物结构的原 状外，还应使待检测的小分子保持免疫原性，不发生流失或漂移，力求“原位原量固定”。它 们在植物细胞基质中的固定可以通过适当的化学或物理方法获得。利用化学方法把植物激 素固定到内部蛋白的过程如EDC反应后，ABA和IAA等可以通过偶联剂将它们固定结合在 周围的蛋白质上。经过戊二醛反应后，同样也能通过吲哚环上的氨基部分与蛋白相连。然 而，植物中还没见到有关和通过苯环被固定的报道。植物激素的免疫定位中一抗的结合位点可以通过偶联了荧光物质、电子或光不透 明标记物或酶的二抗来显示。但荧光标记的二抗仅适合于在光镜水平下观察抗原在组织中 的分布，不仅容易受到切片中一些自发荧光的影响，而且切片也不能长期保存，使它的应用 受到一定的限制。植物细胞内存在复杂的信号转导网络体系(networks)。了解不同信号之间的相互 作用对于我们理解这一复杂的信号转导网络体系越来越重要。这一类研究已成为信号转导 领域的研究热点(Chary J, 2001) 0生长素是最早发现的一类植物激素，在植物细胞的信号 转导网络体系中起主导作用，与其他信号协同作用调节植物细胞的分裂、伸长和分化等发 育过程。而对植物特别是木本植物的复杂的应答反应通路中生长素的细胞定位变化研究， 对生长素调节植物信号转导是十分必要的。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种定位检测植物中激素的方法。
本发明所提供的定位检测植物中激素的方法，包括以下步骤(1)对植物组织进行固定，得到固定后的植物组织；(2)在步骤(1)基础上将固定后的植物组织制成石蜡切片，得到植物组织切片；(3)在步骤(2)基础上对得到植物组织切片进行免疫染色，并通过观察阳性信号 的位置确定所述激素在植物组织中的分布。所述步骤(1)中所述对植物组织进行固定的方法包括如下步骤先将植物组织浸 入到1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐水溶液中抽真空，然后将植物组织 在FAA固定液中浸泡；每1OOmL所述FAA固定液由90mL体积百分比浓度为50%的乙醇水溶液、5mL乙酸 和5mL甲醛组成；所述步骤(2)中所述对固定后的植物组织进行制片的方法包括如下步骤对所述 固定后的植物组织依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片和烘片的处理，得到植物组 织切片；所述步骤(3)中所述对得到植物组织切片进行免疫染色的方法包括如下步骤对 得到植物组织切片依次进行脱蜡、复水、过氧化氢孵育、修复、一抗孵育、二抗孵育和染色。所述步骤(3)中，所述一抗孵育的方法包括如下步骤将所述修复后的植物组织 切片加入激素单克隆抗体溶液中，4°C放置10h，得到一抗孵育后的植物组织切片；所述步骤(3)中，所述二抗孵育的方法包括如下步骤将一抗孵育后的植物组织 切片加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体溶液，25°C放置30min，得到二抗孵育后的植 物组织切片；所述步骤(3)中，所述染色的方法包括如下步骤将二抗孵育后的植物组织切片 加入AEC染色剂，放置lOmin，或加入DAB染色剂，放置2min，即得到染色后的植物组织切 片；所述步骤(1)中，所述抽真空的温度为4°C、时间为1小时；所述在FAA固定液中 浸泡温度为4°C、时间为10小时；所述步骤(2)中，所述脱水的方法包括如下步骤将固定后的植物组织依次用不 同浓度的乙醇水溶液和乙醇进行浸泡，得到脱水后的植物组织；所述步骤(2)中，所述透明的方法包括如下步骤将所述脱水后的植物组织依次 用不同浓度的二甲苯和乙醇的混合溶液和二甲苯进行浸泡，得到透明处理后的植物组织；所述步骤(2)中，所述浸蜡的方法包括如下步骤将所述透明处理后植物组织先 在45°C的熔化石蜡中浸渍3天，然后在60°C的熔化纯蜡中浸渍3天，得到浸蜡后的植物组 织；所述步骤(2)中，所述包埋的方法包括如下步骤向盒中倒入60°C的熔化纯蜡，再 将所述浸蜡后的植物组织和纯蜡一起倒入盒中，待纯蜡凝固后即得到包埋好的植物组织；所述步骤(2)中，所述切片的方法包括如下步骤将所述包埋好的植物组织切成 厚度为10 μ m的薄片；所述步骤(2)中，所述粘片的方法包括如下步骤将所述薄片先在温度为37°C的 水中展片，再用防脱载玻片捞片，即得到粘片后的植物组织切片；所述步骤(2)中，所述烘片的方法包括如下步骤将所述粘片后的植物组织切片在40°C -70°C放置1小时-24小时，具体为在70°C放置1小时或在55°C放置6小时或在 65°C放置8小时或在40°C放置M小时，得到烘片后的植物组织切片；所述步骤(3)中，所述脱蜡的的方法包括如下步骤将所述烘片后的植物组织切 片用二甲苯进行浸泡，得到脱蜡后的植物组织切片；所述步骤(3)中，所述复水的方法包括如下步骤将所述脱蜡后的植物组织切片 依次用不同浓度的乙醇水溶液和乙醇进行浸泡，得到复水后的植物组织切片；所述步骤(3)中，所述过氧化氢孵育的方法包括如下步骤将复水后的植物组织 切片放入过氧化氢溶液中放置20min，得到过氧化氢孵育后的植物组织切片；所述步骤(3)中，所述修复的方法包括如下步骤将所述过氧化氢孵育后的植物 组织切片浸入到枸橼酸缓冲液中放置lOmin，得到修复后的植物组织切片；每500mL所述枸 橼酸缓冲液由9mL 0. lmol/L枸橼酸、41mL 0. lmol/L枸橼酸钠和水组成，用水补足体积，pH 值为6.0。所述步骤O)中，所述脱水的方法中，所述不同浓度的乙醇水溶液和乙醇依次为 50 %乙醇水溶液、70 %乙醇水溶液、80 %乙醇水溶液、90 %乙醇水溶液、95 %乙醇水溶液和 100%乙醇；所述浓度为体积百分比浓度；所述用不同浓度的乙醇水溶液和乙醇进行浸泡 的时间为各浓度均为0. 5小时、1. 5小时或2小时；所述步骤O)中，所述透明的方法中，所述不同浓度的二甲苯和乙醇的混合溶液 依次为由体积比为2 1的乙醇和二甲苯组成的混合液、由体积比为1 1的乙醇和二甲 苯组成的混合液和由体积比为1 2的乙醇和二甲苯组成的混合液；所述用不同浓度的二 甲苯和乙醇的混合溶液和二甲苯进行浸泡的时间为各浓度均为0. 5小时、1. 5小时或2小 时；所述步骤(3)中，所述复水的方法中，所述不同浓度的乙醇水溶液依次为100% 乙醇水溶液、90%乙醇水溶液、80%乙醇水溶液和70%乙醇水溶液；所述浓度为体积百分 比浓度；所述用不同浓度的乙醇水溶液和乙醇进行浸泡的时间为各浓度均为10分钟。所述步骤(1)中所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐水溶液的 质量百分比浓度为3% ；所述步骤(3)中所述过氧化氢溶液为质量百分比浓度为3%的过氧化氢溶液；每 IOOmL所述3%的过氧化氢溶液由90mL 0. 01mol/L的PBS缓冲液和IOmL质量百分比浓度 为30%的过氧化氢水溶液组成；每IOOOmL所述0. 01mol/L的PBS缓冲液由8gNaCl、0. 2g KCl、1.44g Na2HP04、0. 2g KH2P04和水组成，用水补足体积。所述植物为多年生植物；所述多年生植物具体为苹果属植物；所述苹果属植物具 体为小金海棠；所述植物组织具体为茎尖。所述激素为生长素；所述激素单克隆抗体为生长素单克隆抗体。本发明的另一个目的是提供所述方法在定位检测植物中激素中的应用。所述植物为多年生植物；所述多年生植物具体为苹果属植物；所述苹果属植物具 体为小金海棠；所述激素为生长素。本发明所提供的苹果属植物生长素免疫组织定位的方法可消除木本植物组织容 易出现非特异性染色的影响，并可清晰地辨识出阳性信号所在。本发明通过该免疫组织定位的方法证实了在缺铁胁迫下，生长素在苹果茎尖和根尖组织上其分布具有组织特异性。


图1为在不同二抗标记及染色系统下的IAA免疫组织定位结果。图2为缺铁诱导刺激下IAA茎尖定位。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。苹果属植物小金海棠(Malus Xiaojinensis Cheng et. Jiang)(公众可从中国 农业大学获得，记载过小金海棠的非专利文献是陈竹，王忆，张新忠，韩德果，韩振海.小 金海棠类黄色条纹蛋白基因(MxYSU)启动子的克隆与表达.农业生物技术学报.2010， 18(6) :1084-1090)。试剂说明除文中标注出处试剂，其余试剂均购自广达恒益公司。实施例1、苹果属植物的IAA免疫组织化学定位一、固定将小金海棠组培苗在生长培养基(MS+0. 5mg/L IBA+0. 2mg/L 6-BA)中培养，待其 生长到茎木质化后，转移至生根培养基(1/2MS+1. Omg/L IBA)，组培苗生出白色根后，移至 1/2全营养液(组成见表2，初始pH值用NaOH调至6.0)中覆膜保湿培养2周，之后转入全 营养液(组成见表1，初始PH值用NaOH调至6. 0)培养一个月，每周换一次全营养液，培养 条件为光照培养16小时(光量子通量密度250 μ E · Μ_2 · S—1)，温度为25士2°C ；黑暗培养 8小时，温度为17士2°C。之后进行缺铁诱导，方法为将植株从全营养液中转至含4 μ mol 狗营养液(组成见表3，初始pH值用NaOH调至6. 0)，转移前去离子水冲洗。然后取经上述 缺铁诱导的小金海棠的茎尖组织约0. 5cm长，浸入到2mL3% (质量百分比)乙基_(3_ 二甲 基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC，购自于北京赛驰生物科技有限公司)水溶液中，4°C 抽真空固定1小时，然后将茎尖组织浸泡在固定液内(固定液组成见表4)，在4°C下固定10 小时。结果表明，FAA固定液容易渗透入茎尖组织，而PFA固定液难于渗透入茎尖组织，说 明FAA固定液的效果较好。全营养液的配方如下表1 :表1全营养液的配方
权利要求
1.一种定位检测植物中激素的方法，包括以下步骤(1)对植物组织进行固定，得到固定后的植物组织；(2)在步骤(1)基础上将固定后的植物组织制成石蜡切片，得到植物组织切片；(3)在步骤( 基础上对得到植物组织切片进行免疫染色，并通过观察阳性信号的位 置确定所述激素在植物组织中的分布。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中所述对植物组织进行固定的方法包括如下步骤先将植物组织浸入到 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐水溶液中抽真空，然后将植物组织在FAA 固定液中浸泡；每IOOmL所述FAA固定液由90mL体积百分比浓度为50%的乙醇水溶液、5mL乙酸和 5mL甲醛组成；所述步骤O)中所述对固定后的植物组织进行制片的方法包括如下步骤对所述固定 后的植物组织依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片和烘片的处理，得到植物组织切 片；所述步骤(3)中所述对得到植物组织切片进行免疫染色的方法包括如下步骤对得到 植物组织切片依次进行脱蜡、复水、过氧化氢孵育、修复、一抗孵育、二抗孵育和染色。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，所述一抗孵育的方法包括如下步骤将所述修复后的植物组织切片 加入激素单克隆抗体溶液中，4°C放置10h，得到一抗孵育后的植物组织切片；所述步骤(3)中，所述二抗孵育的方法包括如下步骤将一抗孵育后的植物组织切片 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体溶液，25°C放置30min，得到二抗孵育后的植物组 织切片；所述步骤(3)中，所述染色的方法包括如下步骤将二抗孵育后的植物组织切片加入 AEC染色剂，放置lOmin，或加入DAB染色剂，放置2min，即得到染色后的植物组织切片；所述步骤⑴中，所述抽真空的温度为4°C、时间为1小时；所述在FAA固定液中浸泡 温度为4°C、时间为10小时；所述步骤O)中，所述脱水的方法包括如下步骤将固定后的植物组织依次用不同浓 度的乙醇水溶液和乙醇进行浸泡，得到脱水后的植物组织；所述步骤O)中，所述透明的方法包括如下步骤将所述脱水后的植物组织依次用不 同浓度的二甲苯和乙醇的混合溶液和二甲苯进行浸泡，得到透明处理后的植物组织；所述步骤O)中，所述浸蜡的方法包括如下步骤将所述透明处理后植物组织先在 45°C的熔化石蜡中浸渍3天，然后在60°C的熔化纯蜡中浸渍3天，得到浸蜡后的植物组织； 所述步骤( 中，所述包埋的方法包括如下步骤向盒中倒入60°C的熔化纯蜡，再将所 述浸蜡后的植物组织和纯蜡一起倒入盒中，待纯蜡凝固后即得到包埋好的植物组织；所述步骤O)中，所述切片的方法包括如下步骤将所述包埋好的植物组织切成厚度 为10 μ m的薄片；所述步骤O)中，所述粘片的方法包括如下步骤将所述薄片先在温度为37°C的水中 展片，再用防脱载玻片捞片，即得到粘片后的植物组织切片；所述步骤O)中，所述烘片的方法包括如下步骤将所述粘片后的植物组织切片在400C -70°C放置1小时小时，具体为在70°C放置1小时或在55°C放置6小时或在65°C 放置8小时或在40°C放置M小时，得到烘片后的植物组织切片；所述步骤(3)中，所述脱蜡的的方法包括如下步骤将所述烘片后的植物组织切片用 二甲苯进行浸泡，得到脱蜡后的植物组织切片；所述步骤(3)中，所述复水的方法包括如下步骤将所述脱蜡后的植物组织切片依次 用不同浓度的乙醇水溶液和乙醇进行浸泡，得到复水后的植物组织切片；所述步骤(3)中，所述过氧化氢孵育的方法包括如下步骤将复水后的植物组织切片 放入过氧化氢溶液中放置20min，得到过氧化氢孵育后的植物组织切片；所述步骤(3)中，所述修复的方法包括如下步骤将所述过氧化氢孵育后的植物组织 切片浸入到枸橼酸缓冲液中放置lOmin，得到修复后的植物组织切片；每500mL所述枸橼酸 缓冲液由9mL 0. lmol/L枸橼酸、41mL 0. lmol/L枸橼酸钠和水组成，用水补足体积，pH值为 6. 0。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，所述一抗孵育的方法中，所述激素单克隆抗体溶液按照包括如下 步骤的方法制备得到用抗体溶解液将激素单克隆抗体进行溶解得到激素单克隆抗体 溶液；所述激素单克隆抗体溶液的浓度为lmg/mL;每IOOmL所述抗体溶解液由0. 73g NaH2PO4 · H2OU. 79g Na2HPO4 · 12Η20、3· 766g NaCl 和水组成，用水补足体积。
5.根据权利要求1-4中任一所述的，其特征在于所述步骤O)中，所述脱水的方法中，所述不同浓度的乙醇水溶液和乙醇依次为50% 乙醇水溶液、70%乙醇水溶液、80%乙醇水溶液、90%乙醇水溶液、95%乙醇水溶液和100% 乙醇；所述浓度为体积百分比浓度；所述用不同浓度的乙醇水溶液和乙醇进行浸泡的时间 为各浓度均为0. 5小时、1. 5小时或2小时；所述步骤O)中，所述透明的方法中，所述不同浓度的二甲苯和乙醇的混合溶液依次 为由体积比为2 1的乙醇和二甲苯组成的混合液、由体积比为1 1的乙醇和二甲苯组 成的混合液和由体积比为1 2的乙醇和二甲苯组成的混合液；所述用不同浓度的二甲苯 和乙醇的混合溶液和二甲苯进行浸泡的时间为各浓度均为0. 5小时、1. 5小时或2小时；所述步骤(3)中，所述复水的方法中，所述不同浓度的乙醇水溶液依次为100%乙醇 水溶液、90%乙醇水溶液、80%乙醇水溶液和70%乙醇水溶液；所述浓度为体积百分比浓 度；所述用不同浓度的乙醇水溶液和乙醇进行浸泡的时间为各浓度均为10分钟。
6.根据权利要求1-5中任一所述的，其特征在于所述步骤(1)中所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐水溶液的质量 百分比浓度为3% ；所述步骤C3)中所述过氧化氢溶液为质量百分比浓度为3%的过氧化氢溶液；每IOOmL 所述3%的过氧化氢溶液由90mL 0. 01mol/L的PBS缓冲液和IOmL质量百分比浓度为30% 的过氧化氢水溶液组成；每IOOOmL所述0. 01mol/L的PBS缓冲液由8gNaCl、0. 2g KCl、 1.44g Na2HP04、0. 2g KH2P04和水组成，用水补足体积。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述植物为多年生植物；所述 多年生植物具体为苹果属植物；所述苹果属植物具体为小金海棠；所述植物组织具体为茎 尖。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述激素为生长素；所述激素单 克隆抗体为生长素单克隆抗体。
9.权利要求1-8中任一所述的方法在定位检测植物中激素中的应用。
10.根据权利要求9中所述的应用，其特征在于所述植物为多年生植物；所述多年生植物具体为苹果属植物；所述苹果属植物具体为 小金海棠；所述激素为生长素。
全文摘要
本发明公开了苹果属植物生长素免疫组织定位的方法及其应用。本发明所提供的植物生长素免疫组织定位方法，包括以下步骤(1)对植物组织进行固定，得到固定后的植物组织；(2)在步骤(1)基础上对固定后的植物组织进行制片，得到植物组织切片；(3)在步骤(2)基础上对得到植物组织切片进行免疫染色，并通过观察阳性信号的位置确定所述激素在植物组织中的分布。本发明所提供的苹果属植物生长素免疫组织定位的方法可消除木本植物组织容易出现非特特异性染色的影响，并可清晰地辨识出阳性信号所在。本发明通过该免疫组织定位的方法证实了在缺铁胁迫下，生长素在苹果茎尖和根尖组织上其分布具有组织特异性。
文档编号G01N33/74GK102147417SQ20111000788
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月14日 优先权日2011年1月14日
发明者吴婷, 张新忠, 王忆, 贾文锁, 韩振海 申请人:中国农业大学