专利名称：检测2型猪链球菌89k毒力岛基因的引物和探针、实时荧光定量pcr方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的引物和探针、实时荧光定量 PCR方法及试剂盒，属于生物工程技术领域。
背景技术：
猪链球菌(Sti^ptococcus suis, S. suis)为革兰阳性兼性厌氧球菌，根据荚膜多糖的抗原性，猪链球菌可分为35个血清型，其中1、2、1/2、7、9和14型具有致病性，并以2 型(S. suis 2)毒力最强，临床检出率最高。2型猪链球菌是一种重要的人畜共患传染病病原体，不仅可导致猪急性败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎及急性死亡，还可通过伤口和呼吸道等传播途径，导致人的感染发病和死亡。2型猪链球菌呈全球性分布，不仅给全世界养猪业造成巨大的经济损失，而且对相关从业人员的健康亦构成严重威胁，已成为重要的新发传染病病原体。2型猪链球菌根据致病力的强弱可分为强毒株，弱毒株或无毒株。然而，弱毒株或无毒株2型猪链球菌在健康猪扁桃体的带菌率可高达42. 6%，这就给病猪诊断和肉品检测带来困难——在检疫检验时，检到2型猪链球菌后还必须鉴定其致病力，进而采取针对性的应对措施，从而防止疫情爆发和蔓延。本专利申请人已针对2型猪链球菌主要毒力因子(CPS2、MRP、EF、Sly)建立了多重常规PCR体系检测2型猪链球菌，并研制出相应的试剂盒，在国内率先提供快速诊断的技术手段(研究成果发表在《中华流行病学杂志》2005年9月第沈卷第九期)。通常，2型猪链球菌在人群中只引起散发的急性脑膜炎和败血症。然而，1998年在江苏省以及2005年在四川省大规模爆发的两起2型猪链球菌感染人的突发公共卫生事件共导致了 240人感染，52人死亡，病人出现链球菌中毒性休克综合征(STSQ的新临床型别， 该型别患病致死率高达80%以上，为历史罕见。本专利申请人率先对来自中毒休克综合症临床病人的1998年江苏分离株 (98HAH12)和2005年四川分离株(0MYH33)分别作了全序列基因测定，经对比分析，在全世界首次发现这两个中国强毒株比欧洲株多出一段89K序列片段，称为89K毒力岛(王长军，A Glimpse of Streptococcal Toxic Shock Syndrome from Comparative Genomics of S. suis 2 Chinese Isolates. PLoS ONE，2007，Issue5，1-9)。本专利申请人在后续研究中发现，该89K毒力岛对菌株毒力因子起到全局性的调控作用(王长军，^activation of Dipeptidyl Peptidase IV Attenuates the Virulence of Streptococcus suis Serotype 2 that Causes Streptococcal Toxic Shock Syndrome. Curr Microbiol，2009，。在敲除89K毒力岛基因后，菌株的致病性显著降低，宿主症状显著改善，存活率显著提高(王长军，SalK/SalR，a Two-Component Signal Transduct ion System, Is Essential for Full Virulence of Highly Invasive Streptococcus suis Serotype 2. PLoS ONE，2008， Volume3，Issue5，1_12)。上述研究表明，89K毒力岛应是这两次流行2型猪链球菌的一种重要致病基因，是引起我国人感染猪链球菌病中毒性休克综合症的关键致病基因。含有89K毒力岛的2型猪链球菌的致病力远远超过传统的强毒株2型猪链球菌， 但目前还没有一种能检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的技术手段，而这种技术手段对于应对由含89K毒力岛2型猪链球菌引起的传染�。乇鹗窃谥泄环⒐参郎录性缙谟贝χ糜珊�89K毒力岛2型猪链球菌导致的疫情，进而抑制疫情爆发和蔓延具有重要的
眉、ο
发明内容
本发明的第一目的是针对现有技术存在的问题，提供一种检测2型猪链球菌89K 毒力岛基因的引物和探针。本发明的第二目的是提供一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的实时荧光定量PCR方法。本发明的第三目的是提供一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的试剂盒。申请人:经研究发现，2型猪链球菌89K毒力岛的二元信号转导系统基因MlK和IV 型分泌系统毒力基因virB4-89K均对2型猪链球菌的致病力起到关键的调节作用。结合上述研究发现，实现本发明第一目的的技术方案如下一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的引物和探针，其特征是，包括由引物对 SalK-F和&11K-R、及探针MlK-probe组成的&ι1Κ引物探针序列集；其中，引物&ilK_F的序列如SEQ ID No. 1所示，引物SalK-R的序列如SEQ ID No. 2所示，探针SalK-probe的序列如SEQ ID No. 3所示；所述探针SalK-probe的5'端标记有报告荧光基团、3'端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团选自FAM、J0E、Cy3、Cy5、TRAMA、TET、R0X、HEX之一，所述淬灭荧光基团为BHQ、ECLIPSE之一。进一步地，还包括由引物对virB4-89K-F和virB4_89K_R、及探针 virB4-89K-probe组成的virB4_89K引物探针序列集，和/或由引物对cps2J_F和cps2J-R、 及探针cps2J-probe组成的cps2J引物探针序列集；其中，引物virB4_89K_F的序列如SEQ ID No. 4所示，引物virB4H-R的序列如SEQ ID No. 5所示，探针virB4_89K-probe的序列如SEQ ID No. 6所示；引物cps2J-F的序列如SEQ ID No. 7所示，引物cps2J-R的序列如SEQ ID No. 8 所示，探针 cps2J-probe 的序列如 SEQ ID No. 9 所示；所述探针 virB4_89K-probe、 探针cpS2J-probe的5'端标记有报告荧光基团、3'端标记有淬灭荧光基团。2型猪链球菌普遍含有基因cps2J，采用cps2J引物探针序列集可以确认2型猪链球菌。采用上述引物和探针进行实时荧光定量PCR反应，即可快速确定2型猪链球菌中是否含有89K毒力岛基因。实现本发明第二目的的技术方案如下一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的实时荧光定量PCR方法，其特征是，包括以下步骤(1)选择引物探针序列集选择由SEQ ID No. 1-3组成的MlK引物探针序列集； 其中，探针MlK-probe的5'端标记有报告荧光基团、3‘端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团选自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA, ΤΕΤ、ROX, HEX之一，所述淬灭荧光基团为BHQ、ECLIPSE 之一；(2)实时荧光定量PCR反应以待测样品的基因组DNA为扩增模板，根据所选引物探针序列集的探针上所标记的报告荧光基团选择荧光通道，利用所选引物探针序列集的引物对和探针进行实时荧光定量PCR反应，同时记录荧光曲线和扩增循环数CT ；其中，所述2型猪链球菌89K毒力岛的基因MlK的阳性判断标准是当CT彡35、 且荧光曲线呈S形时，判断为阳性；否则，判断为阴性。进一步地，所述步骤(1)中还选择由SEQ ID No. 4_6组成的virB4_89K引物探针序列集，和/或由SEQ ID No. 7-9组成的cps2J引物探针序列集；其中探针virB4-89K-probe、 探针cpS2J-probe的5'端标记有报告荧光基团、3'端标记有淬灭荧光基团；其中，所述2型猪链球菌89K毒力岛的基因virB4_89K、所述2型猪链球菌的基因 cps2J的阳性判断标准均为当CTS35、且荧光曲线呈S形时，判断为阳性；否则，判断为阴性。更进一步地，所述实时荧光定量PCR反应的程序为第一阶段初期变性，93°C -95°C 30秒-120秒；第二阶段PCR反应，93°C _95°C变性5_15秒，60°C退火并延伸观_40秒，同时监测荧光曲线；重复30-50个循环。再进一步地，所述实时荧光定量PCR反应的体系由以下组分构成体系终浓度为 1. 25U/20 μ 1的I^remix Ex Taq聚合酶，体系终浓度为5mmol/L的镁离子，体系终浓度为 0. 2 μ mol/L的各引物，体系终浓度为0. 5 μ mol/L的各探针，体系终浓度为0. 2 μ mol/L的 ROX Reference Dye II，待测样品基因组DNA溶液4 μ 1，双蒸水适量；整个体系的总体积为 20 μ 1。实时荧光定量PCR是通过荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，可实时监控反应过程，具有特异性更好、假阳性低、灵敏度更高(是常规PCR的100倍以上)、 操作简便、交叉污染和污染环境机会少等优点，而且整个反应可在0.5- 内完成。多重实时荧光定量PCR是在同一个反应系中加入多个引物和荧光标记探针，同时检测多个目的基因的方法，该方法可以方便的进行一管多检，从而达到省时省力的目的。采用上述方法可以在很短的时间内确定2型猪链球菌中是否含有89K毒力岛基因，从而为应对疫情争取更多的时间。实现本发明第三目的的技术方案如下一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的试剂盒，其特征是，包括由SEQ ID No. 1-3组成的MlK引物探针序列集；其中，探针MlK-probe的5'端标记有报告荧光基团、3'端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团选自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA、ΤΕΤ、 ROX, HEX之一，所述淬灭荧光基团为BHQ、ECLIPSE之一。进一步地，还包括由SEQ ID No. 4_6组成的virB4_89K引物探针序列集，和/ 或由SEQ ID No. 7-9组成的cps2J引物探针序列集；其中探针virB4-89K-probe、探针 cpS2J-probe的5'端标记有报告荧光基团、3'端标记有淬灭荧光基团。更进一步地，还包括2XPremix Ex Taq聚合酶、25mM镁离子溶液、及50XR0X Reference Dye II。采用上述试剂盒可快速确定2型猪链球菌中是否含有89K毒力岛基因。
图1为本发明实时荧光定量PCR方法的检测原理图。图2为本发明实施例4的荧光曲线示意图。图3为本发明实施例5的荧光曲线示意图。图4为本发明实施例6的荧光曲线示意图。
具体实施例方式下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。以下内容中涉及的实验操作，如未注明具体实验条件，则按照常规条件进行，例如，可参照SAMBR00K. J等编著的《分子克隆实验指南》第3版(Molecular Cloning =A Laboratory Manual ；NEW York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中述及的条件，或参照制造厂商所建议的条件。以下内容中涉及的实验材料和试剂，如未特别说明则为市售品。实施例1. SalK, virB4_89K、cps2J引物探针序列集通过分析NCBI (美国国立生物技术信息中心WenBank数据库中2型猪链球菌的 SalK, virB4_89K、cps2J基因序列，使用Beacon Designer等多种生物学软件，结合经验判断和人工比对、修正，进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的核苷酸区域设计三对引物和探针(本发明采用的是TaqMan探针)。引物长度一般为20_30个碱基，探针的长度一般为15-30个碱基(均为DNA碱基)。引物间和引物内无互补序列，而且应分别特异性地针对各靶基因，相互间不存在交叉反应，可以在同一套反应体系中同时应用于检测和区分 &ilK、virB4-89K、CpS2J三组基因。具体的引物对、探针序列见表1。表1引物对、探针序列
权利要求
1.一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的引物和探针，其特征是，包括由引物对 SalK-F和&11K-R、及探针MlK-probe组成的&ι1Κ引物探针序列集；其中，引物&ilK_F的序列如SEQ ID No. 1所示，引物SalK-R的序列如SEQ ID No. 2所示，探针SalK-probe的序列如SEQ ID No. 3所示；所述探针MlK-probe的5'端标记有报告荧光基团、3'端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团选自FAM、J0E、Cy3、Cy5、TRAMA、TET、R0X、HEX之一，所述淬灭荧光基团为BHQ、ECLIPSE之一。
2.根据权利要求1所述检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的引物和探针，其特征是，还包括由引物对 virB4-89K-F 和 virB4_89K_R、及探针 virB4_89K-probe 组成的 virB4_89K 引物探针序列集，和/或由引物对cps2J-F和cps2J-R、及探针cpS2J-probe组成的cps2J引物探针序列集；其中，引物virB4-89K-F的序列如SEQ ID No. 4所示，引物virB4_89K_R的序列如SEQ ID No. 5所示，探针virB4-89K-probe的序列如SEQ ID No. 6所示；引物cps2J_F 的序列如SEQ ID No. 7所示，引物cps2J-R的序列如SEQ ID No. 8所示，探针cps2J-probe 的序列如SEQ ID No. 9所示；所述探针virB4-89K-probe、探针cps2J-probe的5'端标记有报告荧光基团、3'端标记有淬灭荧光基团。
3.—种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的实时荧光定量PCR方法，其特征是，包括以下步骤(1)选择引物探针序列集选择由SEQID No. 1-3组成的MlK引物探针序列集；其中， 探针MlK-probe的5'端标记有报告荧光基团、3'端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团选自 FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA, ΤΕΤ、ROX, HEX 之一，所述淬灭荧光基团为 BHQ、ECLIPSE 之一；(2)实时荧光定量PCR反应以待测样品的基因组DNA为扩增模板，根据所选引物探针序列集的探针上所标记的报告荧光基团选择荧光通道，利用所选引物探针序列集的引物对和探针进行实时荧光定量PCR反应，同时记录荧光曲线和扩增循环数CT ；其中，所述2型猪链球菌89K毒力岛的基因MlK的阳性判断标准是当CT ( 35、且荧光曲线呈S形时，判断为阳性；否则，判断为阴性。
4.根据权利要求3所述检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的实时荧光定量PCR方法， 其特征是，所述步骤(1)中还选择由SEQ ID似.4-6组成的“沖4-891(引物探针序列集， 和/或由SEQ ID No. 7-9组成的cps2J引物探针序列集；其中探针virB4_89K-probe、探针 cpS2J-probe的5'端标记有报告荧光基团、3'端标记有淬灭荧光基团；其中，所述2型猪链球菌89K毒力岛的基因virB4-89K、所述2型猪链球菌的基因cps2J 的阳性判断标准均为当CT ( 35、且荧光曲线呈S形时，判断为阳性；否则，判断为阴性。
5.根据权利要求4所述检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的实时荧光定量PCR方法， 其特征是，所述实时荧光定量PCR反应的程序为第一阶段初期变性，93°C -95°C 30秒-120秒；第二阶段PCR反应，93°C _95°C变性5-15秒，60°C退火并延伸观_40秒，同时监测荧光曲线；重复30-50个循环。
6.根据权利要求5所述检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的实时荧光定量PCR方法， 其特征是，所述实时荧光定量PCR反应的体系由以下组分构成体系终浓度为1. 25U/20y 1 的I^remix Ex Taq聚合酶，体系终浓度为5mmol/L的镁离子，体系终浓度为0. 2 μ mol/L的各引物，体系终浓度为0. 5 μ mol/L的各探针，体系终浓度为0. 2 μ mol/L的ROX Reference Dye II，待测样品基因组DNA溶液4 μ 1，双蒸水适量；整个体系的总体积为20μ 1。
7.一种检测2型猪链球菌89Κ毒力岛基因的试剂盒，其特征是，包括由SEQ ID No. 1-3 组成的MlK引物探针序列集；其中，探针MlK-probe的5'端标记有报告荧光基团、3'端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团选自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA, ΤΕΤ、ROX, HEX之一，所述淬灭荧光基团为BHQ、ECLIPSE之一。
8.根据权利要求7所述检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的试剂盒，其特征是，还包括由SEQ ID No. 4-6组成的virB4_89K引物探针序列集，和/或由SEQ ID No. 7-9组成的 cps2J引物探针序列集；其中探针virB4-89K-probe、探针cpS2J-probe的5'端标记有报告荧光基团、3'端标记有淬灭荧光基团。
9.根据权利要求8所述检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的试剂盒，其特征是，还包括 2XPremix Ex Taq 聚合酶、25mM 镁离子溶液、及 50XROX Reference Dye II。
全文摘要
本发明涉及一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的引物和探针、实时荧光定量PCR方法及试剂盒。该引物和探针包括SalK、virB4-89K、cps2J引物探针序列集。该方法包括选择引物探针序列集、实时荧光定量PCR反应。该试剂盒包括SalK、virB4-89K、cps2J引物探针序列集和其它相关试剂。本发明的引物和探针、PCR方法及试剂盒可在在很短的时间内确定2型猪链球菌中是否含有89K毒力岛基因，从而为应对疫情争取更多的时间。
文档编号G01N21/64GK102312013SQ20111030750
公开日2012年1月11日 申请日期2011年10月11日 优先权日2011年10月11日
发明者唐家琦, 张锦海, 朱静, 潘秀珍, 王长军, 胡丹 申请人:中国人民解放军南京军区军事医学研究所
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