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专利名称：通过对核酸的检测与分级分离来评价疾病状态的方法
技术领域：
本发明涉及用于评价疾病状态的存在于血浆和血清中的非颗粒相关和颗粒相关核酸。
背景技术：
为了辅助对患者疾病的检测、预后判断、诊断、监测和治疗，目前世界上需要简便和准确地评价患者疾病状态的新方法。
近来有发现表明，血浆或血清中的循环核酸与某些疾病状态有关(见Lo YMD等，N Eng J Med 1998；3391734-8；Lo YMD等，Lancet 1997；350485-7；Lo YMD等，Am J Hum Genet 1998；62768-75；Chen XQ等，NatMed 1996；21033-5；Nawroz H等，Nat Med 1996；21035-7；Lo YMD等，Lancet 1998；3511329-30及Lo YMD等，Clin Chem 2000；46319-23)。目前虽然对循环核酸的特性和生物学来源所知甚少。然而细胞死亡(包括凋亡)似乎是一个主要的因素(Fournie等，Gerontology 1993；39215-21与Fournie等，Cancer Lett 1995；91221-7)。由于发生凋亡的细胞会将核酸移至凋亡小体中，因此虽然没有理论支持，但人个体血浆或血清中至少部分的循环核酸为颗粒相关性的是有可能的。在此申请中，第一次证明了循环核酸同时以颗粒相关和非颗粒相关形式存在于人体血清或血浆中。同时还证明，通过将个体血浆或血清中的该循环核酸分离为颗粒相关和非颗粒相关形式，可简便和准确地评价疾病的状态。
发明概述本发明提供了评价患者疾病状态的方法，该患者怀疑患有或已知患有此种疾病状态。在本发明的一个实施方案中，其包括从怀疑患有或已知患有此种疾病状态的患者中获得血液样本，从血液样本中分离血浆或血清，将所述血浆或血清分成包括颗粒相关和非颗粒相关核酸的不同相对浓度的两个或更多的组分，及通过检测一个或更多组分中核酸的含量、浓度或特性，并将一个或更多组分中核酸的含量、浓度或特性与对照组比较来评价所述疾病状态。
本发明的一个方面，所述核酸是mRNA。在一个实施方案中，所述mRNA是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA。在第二个实施方案中，所述mRNA是血小板碱性蛋白(PBP)mRNA。在第三个实施方案中，所述mRNA是人胎盘催乳素(hPL)mRNA。在第四个实施方案中，所述mRNA是人绒毛膜促性腺激素β亚基(βhCG)mRNA。
本发明的第二方面，所述核酸是DNA。在一个实施方案中，所述DNA是线粒体DNA。
本发明的第三方面，评价怀疑患有或已知患有此种疾病状态的患者中的疾病状态的方法还包括扩增所述核酸的步骤。在一个实施方案中，用PCR扩增所述核酸。在第二个实施方案中，用反转录PCR扩增所述核酸。在第三个实施方案中，用实时PCR扩增所述核酸。在第四个实施方案中，用实时反转录PCR扩增所述核酸。
本发明的第四方面，通过过滤将血浆或血清分离成两个或更多组分。在一个实施方案中，所述滤膜孔径大小约为5μm或更小。在第二个实施方案中，所述滤膜孔径大小约为0.22μm。在第三个实施方案中，所述滤膜孔径大小约为0.45μm。
本发明的第五方面，通过离心将血浆或血清分离成两个或更多组分。在一个实施方案中，所述离心为超速离心。
本发明的第六方面，被评价的所述疾病状态选自癌症、中风及损伤。在一个实施方案中，所述癌症是肝细胞癌或鼻咽癌。
本发明的第七方面，患者是孕妇，且所述评价患者或其胎儿的疾病或生理状态的方法能够辅助所述患者或其胎儿的检测、监测、预后判断或治疗。
本发明还提供一种评价患者的疾病状态的方法，所述患者怀疑患有、已知患有或有风险患有肝细胞癌或鼻咽癌。所述方法包括从怀疑患有或已知患有肝细胞癌或鼻咽癌患者中获得血浆或血清，及检测所述样本中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)核酸含量。
本发明还提供一种评价患者的疾病状态的方法，所述患者怀疑患有或已知患有外伤。所述方法包括从怀疑患有或已知患有外伤患者中获得血浆或血清，及检测所述样本中线粒体核酸含量或浓度。
应该理解，不通过从患者中获得样本的步骤，利用先前从患者中获得的样本(如血液样本)，或源自其中的分离样本(如血浆或血清)，也能实施本发明的方法。因此，本发明可以不包括任何对所述患者直接实施的步骤。
还应理解，除非本文中有明确的不同说明，本发明的各种方法、方面及实施方案可以进行组合。
定义短语“评价疾病的状态”是指对患者的疾病状态进行评估。例如，评价所述患者的状态可包括患者疾病的存在或不存在。当确定患者有疾病存在时，评价所述患者疾病状态可包括鉴定患者疾病的严重程度。其还可包括应用上述鉴定结果对疾病作出预后判断，例如活存时间预测或制定治疗计划。评价患者的所述疾病状态还可包括鉴定患者不再患有疾�。�但以往患有该疾病的状态。此时的评价所述疾病的状态还可包括分析该疾病状态的复发率或监测所述患者复发。例如，相互鉴定在几分钟、几小时或几天内发生的两个急性缺血病例。评价所述疾病的状态还包括对患者的疾病信号进行监测。因此评价疾病的状态包括检测、诊断或监测患者疾病的状态，同时确定患者的预后判断和治疗计划。所述评价疾病状态的方法辅助风险分级。
血浆是指经抗凝处理后离心血液所得的全血的组分。血清是指血液样本凝集后留下的水样液体部分。
本发明所使用的短语“将一个或更多组分中核酸的含量、浓度或特性与对照组比较”等同于将一个或更多组分中核酸的含量、浓度或特性与标准品比较。所述短语“将一个或更多组分中核酸的含量、浓度或特性与对照组比较”还可包括组分间的比较。循环核酸同时存在于健康人和疾病患者的血浆或血清中，并同时以颗粒相关和非颗粒相关形式存在。通过将怀疑患有、已知患有或有可能患有疾病患者的颗粒相关和非颗粒相关核酸的相对浓度与健康个体、较早时期的患者样本或另一个已患病个体样本的颗粒相关和非颗粒相关核酸的相对浓度进行比较，可以对疾病的状态进行评价。也可以通过组分间的比较对疾病的状态进行评价。在本发明的一些实施方案中，对照组可以不是另一样本，而可由各种个体的数据平均值来代替，该个体被归类为健康或患有不同疾病(例如外伤和癌症)状态。收集的血液中非颗粒相关核酸不同水平或浓度的数据，可对应疾病的严重程度、预后判断或诊断。例如，使用本发明的方法，本领域所属技术人员可将一个个体组分A中的非颗粒相关核酸的含量或浓度与对照组比较并确定取样个体是否存在或没有疾病。本领域所属技术人员还可通过比较来确定疾病的类型和阶段。本领域所属技术人员还可通过比较来确定疾病的严重程度或预测患者的存活时间。本领域所属技术人员还可通过比较来辅助对患者的疾病状态进行风险分级、监控或治疗。
血浆或血清中的循环核酸能以“颗粒相关”和“非颗粒相关”的两种形式存在。颗粒相关核酸可定义为位于颗粒内部或黏附于或连接到颗粒上或位于颗粒表面的核酸。术语“颗粒”定义为可通过物理手段证实的具有直径为0.1μm～5μm的有限大小的任意物质或经5μm滤膜过滤后再进行超速离心可获得沉淀物的任意物质。直径尺寸超过5μm将包括完整的细胞，因而排除在本发明之外。用来确定颗粒相关核酸大小的物理方法包括但不限于离心、超速离心、沉降、过滤、光学显微镜或电子显微镜。相应地，所述术语“颗粒相关核酸”同时包括存在于血浆或血清中的细胞外和细胞内核酸，规定该核酸与大小为0.1μm～5μm的颗粒结合或者是能够通过超速离心成为沉淀物。例如细胞外核酸可与核糖体、脂质或脂蛋白形成复合体。它们可以是蛋白连接的或存在于凋亡小体中。所述术语“颗粒相关核酸”还可包括与核糖体、脂质或脂蛋白形成复合体的那些细胞外核酸。为实现本发明的目的，凋亡小体中的核酸与结合的核酸复合体一样包括在术语“颗粒相关核酸”中，其大小为0.1μm～5μm。因此，在本发明中颗粒相关核酸是那些在血流中循环并在细胞残余中(包括但不限于由巨核细胞释放的血小板)、与细胞残余复合或与诸如但不限于线粒体的细胞器结合、与凋亡小体结合或与其它大小在0.1μm～5μm的其它颗粒结合的核酸。非颗粒相关核酸是不与细胞残余或凋亡小体复合的循环核酸，但可复合形成小于约0.1μm大小的颗粒。在本发明中，非颗粒相关核酸还包括那些经5μm滤膜过滤再进行超速离心但不产生沉淀的核酸。
“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸聚合体或核糖核酸聚合体，并且除非有其它限定，还包括已知的具有与天然存在的核酸相似功能的天然核酸类似物。
本文所述短语“血浆或血清样本”是指从个体中获得的血浆或血清样本。通常该样本是“临床样本”，其来自患病的、怀疑患病的患者或诸如孕妇(“患者”)的需要医学关注的生理状态。从患者中最初获得的样本可含有除血浆或血清之外的其它成分。例如，所述样本最初可以是需要纯化为血浆或血清成分的全血样本。无论是“新鲜的”血浆或血清，还是冷冻(存放)并随后融化的血浆或血清均可用于本发明的方法中。冷冻(存放)的血浆或血清应优选保存在-20℃～-70℃条件下直到融化使用。
所述术语“杂交特异”或“特异杂交”是指寡核苷酸(例如引物或标记探针)与靶序列间的互补杂交。所述术语特异包括较少的错配，其可通过减少杂交条件的严格性来调节，从而实现PCR反应聚合酶所需的引导或杂交信号的检测。
所述术语“寡核苷酸”是指诸如引物、探针和其它核酸片段的含有两个或更多个脱氧核糖核酸或核糖核酸的分子。依据多种因素和寡核苷酸的最终功能或用途来确定一种寡核苷酸的准确长度。“添加”一种寡核苷酸是指将一种寡核苷酸与另一种核酸连接。通常，使用DNA连接酶来连接寡核苷酸来进行寡核苷酸的添加。
所述术语“引物”是指一种寡核苷酸(无论是天然的还是合成的)，在诱导合成与核酸链互补的引物扩增的产物的条件下，其能够作为DNA合成起始点，即在有4种不同的三磷酸核苷、用于聚合的试剂(如DNA聚合酶或反转录酶)的存在，并在适当的缓冲液中及适合的温度条件下。引物优选单链寡脱氧核糖核酸序列。依据引物的用途来决定引物适合的长度，但通常为约15到约30个核苷酸。短的引物分子一般需要较低的温度来与模板形成充分稳定的杂交复合体。引物没有必要反映出模板的准确序列，但必须充分互补来实现与模板的特异杂交。
“探针”是指通过互补碱基对与靶核酸中的一段序列结合的寡核苷酸。本领域所属技术人员应理解，依据杂交条件的严格性要求，探针通常能够基本结合到与探针序列缺乏完全互补性的靶序列。通常探针可将直接标记(例如利用同位素或荧光物质)或用诸如地高辛或生物素来间接标记。通过检测探针的存在与否，来确定靶标的存在与否。
如上文所述，核酸可以是单链或双链，或含有既有双链序列又有单链序列的部位。单链的描述同时也定义了其互补链的序列，因此本文所述的序列同样也提供其序列的互补序列。所述核酸可以是DNA(无论是基因组还是cDNA)、RNA或杂合体，其中所述核酸可包含脱氧核糖核酸和核糖核酸的组合物及碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等等)的组合物。“转录”通常指天然存在的RNA，例如，前mRNA、hnRNA或mRNA。本文所使用的术语“核苷”包括核苷酸、核苷、核苷酸类似物和诸如氨基修饰核苷的修饰核苷。此外，“核苷”包括非天然存在的类似结构。因此，例如每个含有一个碱基的肽核酸的独立单位，在本文中也指核苷。
所述短语“选择(或特异)杂交”指在严格杂交条件下，当特定序列以复合混合物(例如全细胞或DNA或RNA库)存在时，只针对特定核酸序列的分子的结合、双联或杂交。
所述术语“基本同一”是指两个或更多的核酸序列拥有基本相同的序列。通常，此相同至少约为其序列的90％，优选约为其序列的95％。序列基本同一的另一标志是如果在严格的条件下，其能与相同的核酸序列杂交(参见例如，Sambrook与Russell编辑，Molecular CloningALaboratory Manual，3rd Ed，vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001；及Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，ed.John Wiley& Sons，Inc.New York，1997)。严格条件依赖于序列的情况并在不同的环境中有所不同。通常，严格的条件选自在确定的离子强度和pH时约低于特定序列变性温度(Tm)5℃(或更少)的温度。DNA双链的Tm定义为在DNA变性中，核酸的50％是配对的，并对应分光光度增色转变的中位值时的温度。Tm表示从双螺旋到任意蜷曲的转变。
通常，“严格的条件”是指其中在pH7时，盐浓度约为0.2×SSC、温度至少约为60℃的条件。例如，本发明的核酸或其片段在标准的滤膜杂交中得以鉴定，该杂交是在严格条件下使用所述的核酸进行的，在本文中，包括用0.2×SSC，在至少约为60℃，通常约为65℃，有时在70℃的温度下洗涤20分钟，至少洗涤1次(通常2次)，或等同的条件。对于多聚酶链式反应(PCR)，尽管退火温度依据引物的长度和核酸的组成可在约32℃与72℃间变化，例如40℃、42℃、45℃、52℃、55℃、57℃或62℃，其退火温度约低于Tm5℃，这对于较低严格的扩增是较常用的。对于高度严格的PCR扩增，尽管高度严格的退火温度依据引物和缓冲液的条件可在约50℃～约72℃范围内变化、并通常为72℃，等于或略高于引物Tm(约5℃)的温度是较常用的(Ahsen等，Clin.Chem.471956-61，2001)。无论是高的还是较低的严格扩增，通常的循环条件包括变性阶段为90℃～95℃变性30秒～2分钟，退火阶段持续30秒～2分钟，延伸阶段为约72℃持续1～6分钟。
所述术语“同一”或“百分比同一性”与上下文中的两个或更多的核酸结合，指相同或具有核酸的特定比例相同的两个或更多序列或亚序列(即使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法并设定如下所述的默认参数，或通过手工和视觉观察的方法，针对对比较窗口进行最大相关性比较和比对时，特定区域或设定区域约为70％相同，优选75％、80％、85％、90％或95％相同)。此序列随即称为“基本同一”。此定义还指检测序列的互补序列。优选地，同一性存在于至少约为15、20或25核苷酸长度的区域，更优选50～100核苷酸长度的区域。
对于序列比较，通常将一个序列作为参考序列，用检测序列与其比较。当使用序列比较算法时，将检测序列和参考序列输入计算机，如果需要，设定亚序列相配及序列算法程序参数。可使用默认的程序参数，或设定选择参数。依据程序参数，用序列比较算法随后计算检测序列相对于参考序列的同一性百分率。
本文使用的“比较窗口”包括对邻近位置一定数目的任何一个字段的参照，该邻近位置数目选自15～600(通常为约20～约200，或更通常为约50～约150)，其中，在两个序列最佳对齐后，一个序列可与邻近位置的相同数目的参考序列进行比较。用来比较的序列对齐的方法是本领域所公知的。例如可通过Smith & Waterman，Adv.Appl Math.2482(1981)所述的区域相同算法、Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)所述的相同对齐算法、Pearson & Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 852444(1988)所述的相似性方法的研究、这些算法(Wisconsin GeneticsSoftware Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI所述的GAP，BESTFIT，FASTA及TFASTA)的计算机执行或通过手工对齐和视觉观察(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等编辑，1995 Supplement))，来实施比较序列的最佳对齐。
适合确定序列同一性百分率和序列相似性的百分率的算法优选实施例为BLAST算法与BLAST 2.0算法，该算法分别如Altschul等，Nuc.AcidsRes.253389-3402(1977)与Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)所述。利用BLAST与BLAST 2.0算法结合本文所述的默认参数来确定本文所述的核酸的序列同一性百分率。通过国立生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)可公开获得执行BLAST分析的软件。此算法包括通过识别询问序列中W长度的短句来首先识别高分值的序列对(HSPS)，当与数据库序列中相同长度的句子进行对齐时，其或者匹配或者满足一些阳性赋值的阈值分值T。T指邻近字句分值阈值(Altschul等，supra)。这些邻近字句的命中作为种子来寻找更长的含有此字句的HSPs。字句的命中可沿每个序列的两个方向延伸直至能够增加累计对齐分值。对于核酸序列，使用参数M(一个匹配残基对的奖励分值；通常＞0)和N(不匹配残基的罚分；通常＜0)计算累计分值。每个方向上字句命中的延伸可在下列情况下被阻断在超过其最大实现值的数量X后累计对齐分值衰退；因一个或多个负记分残基积累导致累计对齐分值达到零或更低；或到达任一序列的末端。所述BLAST算法参数W、T和X决定了对齐的速度和敏感度。所述BLASTN程序(针对核酸序列)使用字句长度为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4的默认值，并进行两个链的比较。
所述BLAST算法还可执行两个序列间的相似性的统计学分析(参见例如Karlin & Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 905873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性分析是最小总和概率(P(N))，其通过预测偶然发生的两个核苷酸序列间匹配的可能性来提供这种概率的指示。例如，如果检测核酸与参考核酸比较的最小总和概率小于约0.2(更优选小于约0.01、最优选小于约0.001)可认为一个核酸与参考序列相似。
附图的简要说明

图1为经不同孔径滤膜处理后健康个体血浆/血清mRNA和DNA的浓度A，对应处理分类(X轴)的通过实时定量RT-PCR检测的血浆/血清GAPDH mRNA浓度(pg/ml)(Y轴)图；B，对应处理分类(X轴)的通过实时定量PCR检测的血浆线粒体DNA浓度(拷贝数/ml)(Y轴)图；C，对应处理分类(X轴)的通过实时定量PCR检测的血浆/血清β-球蛋白DNA浓度(基因组-等同量/ml)图；D，对应处理分类(X轴)的通过实时定量RT-PCR检测的血浆/血清PBP mRNA浓度(拷贝数/ml)图。柱中的横线表示中位值。小柱表示第25和第75百分点之间的区间。小把表示第10和第90百分点之间的区间。实心圆表示第10和第90百分点之间以外的数据点。
图2为经过滤和超速离心处理后健康个体血浆mRNA和DNA的浓度A，对应处理分类(X轴)的通过实时定量RT-PCR检测的血浆GAPDHmRNA浓度(pg/ml)(Y轴)图；B，对应处理分类(X轴)的通过实时定量PCR检测的血浆线粒体DNA浓度(拷贝数/ml)(Y轴)图；C，对应处理分类(X轴)的通过实时定量PCR检测的血浆β-球蛋白DNA浓度(基因组-等同量/ml)图。未处理的，指没经处理；过滤的，指0.22μm滤膜过滤；超速离心的，指以99,960×g超速离心。柱中的横线表示中位值。小柱表示第25和第75百分点之间的区间。小把表示第10和第90百分点之间的区间。实心圆表示第10和第90百分点之间以外的数据点。
图3为用或未用0.22μm滤膜过滤处理的健康个体与肝细胞癌(HCC)患者血浆中mRNA和DNA浓度的比较。X轴显示处理分类。A，通过实时定量RT-PCR检测的血浆GAPDH mRNA浓度(pg/ml)为Y轴(一般对数值)绘图；B，通过实时定量PCR检测的血浆β-球蛋白DNA浓度(基因组-等同量/ml)为Y轴(一般对数值)绘图。 表示健康个体而 表示HCC患者。柱中的横线表示中位值。小柱表示第25和第75百分点之间的区间。小把表示第10和第90百分点之间的区间。实心圆表示第10和第90百分点之间以外的数据点。
图4为用或未用0.22μm滤膜过滤处理的健康个体与鼻咽癌(NPC)患者血浆中mRNA和DNA浓度的比较。X轴显示处理分类。A，通过实时定量RT-PCR检测的血浆GAPDH mRNA浓度(pg/ml)为Y轴(一般对数值)绘图；B，通过实时定量PCR检测的血浆β-球蛋白DNA浓度(基因组-等同量/ml)为Y轴(一般对数值)绘图。 表示健康个体而 表示NPC患者。柱中的横线表示中位值。小柱表示第25和第75百分点之间的区间。小把表示第10和第90百分点之间的区间。实心圆表示第10和第90百分点之间以外的数据点。
图5为用或未用0.22μm滤膜过滤处理的健康个体与孕妇血浆中mRNA和DNA浓度的比较。X轴显示处理分类。A，通过实时定量RT-PCR检测的的血浆GAPDH mRNA浓度(pg/ml)为Y轴(常用对数值)绘图；B，通过实时定量PCR检测的血浆β-球蛋白DNA浓度(基因组-等同量/ml)为Y轴(常用对数值)绘图。C，健康人与不同怀孕阶段的孕妇中血浆mRNA浓度。通过实时定量RT-PCR检测的健康人与不同怀孕阶段的孕妇血浆中mRNA浓度。通过实时定量RT-PCR检测的血浆GAPDH mRNA浓度(pg/ml)(Y轴，常用对数值)相对于分类(正常个体以及妊娠3个月、6个月和9个月的孕妇)(X轴)绘图。 表示过滤的血浆，而 表示未过滤的血浆。柱中的横线表示中位值。小柱表示第25和第75百分点之间的区间。小把表示第10和第90百分点之间的区间。实心圆表示第10和第90百分点之间以外的数据点。
图6为用不同孔径滤膜过滤处理的来自于胎盘的孕妇血浆中mRNA浓度。X轴显示处理分类。A，通过实时定量RT-PCR检测的血浆hPLmRNA浓度(拷贝数/ml)为Y轴绘图；B，通过实时定量RT-PCR检测的血浆βhCG mRNA浓度(拷贝数/ml)为Y轴绘图。C，通过实时定量RT-PCR检测的血浆GAPDH mRNA浓度(pg/ml)为Y轴绘图。柱中的横线表示中位值。小柱表示第25和第75百分点之间的区间。小把表示第10和第90百分点之间的区间。实心圆表示第10和第90百分点之间以外的数据点。
图7为通过实时定量RT-PCR检测的GAPDH mRNA浓度。A，以相对于RT-PCR循环数(X轴)的超过本底的荧光强度扩增点(Y轴)绘图。每个点对应用相应的符号标记的特定的靶序列加入量。B，以相对于靶序列的加入量(X轴，常用对数值)的循环阈值点(CT)(Y轴)绘图。所述的加入的靶序列量以人对照RNA的pg表示。
图8为用或未用0.22μm滤膜过滤处理的健康个体与外伤患者血浆中mRNA浓度的比较。相对于处理分类(X轴)绘图的，通过实时定量RT-PCR检测的血浆GAPDH mRNA浓度(pg/ml)(Y轴，常用对数值)。 表示健康个体而 表示外伤患者。柱中的横线表示中位值。小柱表示第25和第75百分点之间的区间。小把表示第10和第90百分点之间的区间。实心圆表示第10和第90百分点之间以外的数据点。
图9为用0.22μm滤膜过滤处理的对照个体与不同程度外伤患者血浆中mRNA浓度的比较。A，相对于分类(健康对照个体以及不同严重程度外伤患者)(X轴)绘图的通过实时定量RT-PCR检测的过滤血浆样本的GAPDH mRNA浓度(pg/ml)(Y轴，常用对数值)。柱中的横线表示中位值。小柱表示第25和第75百分点之间的区间。小把表示第10和第90百分点之间的区间。实心圆表示第10和第90百分点之间以外的数据点。B，用0.22μm滤膜过滤处理的严重外伤患者血浆中mRNA的浓度。相对于分类(存活及死亡)(X轴)绘图的通过实时定量RT-PCR检测的血浆GAPDHmRNA浓度(pg/ml)(Y轴)。●表示未发展为MODS的患者而▲表示发展为MODS的患者。
图10为通过实时定量PCR检测的线粒体DNA定量分析刻度曲线。循环阈值(CT)(Y轴)相对于靶序列的加入量(X轴，常用对数值)来绘图。加入的靶序列量以线粒体DNA扩增的拷贝数表示。
图11为用或未用0.22μm滤膜过滤处理的健康个体与外伤患者血浆中线粒体DNA浓度的比较。X轴显示处理分类。通过实时定量PCR检测的血浆线粒体DNA浓度(拷贝数/ml)为Y轴(常用对数值)绘图。 表示健康个体而 表示外伤患者。柱中的横线表示中位值。小柱表示第25和第75百分点之间的区间。小把表示第10和第90百分点之间的区间。实心圆表示第10和第90百分点之间以外的数据点。
图12为用或未用0.22μm滤膜过滤处理的健康个体与不同严重程度外伤患者血浆中线粒体DNA浓度的比较。X轴显示处理分类(健康对照者以及不同严重程度外伤患者)。A，以通过实时定量PCR检测的未过滤的血浆样本线粒体DNA浓度(拷贝数/ml)为Y轴(常用对数值)绘图。B，以通过实时定量PCR检测的过滤血浆样本线粒体DNA浓度(拷贝数/ml)为Y轴(常用对数值)绘图。柱中的横线表示中位值。小柱表示第25和第75百分点之间的区间。小把表示第10和第90百分点之间的区间。实心圆表示第10和第90百分点之间以外的数据点。
发明的详细说明本发明涉及健康个体与疾病患者血浆或血清中以颗粒相关或非颗粒相关形式存在的循环核酸的令人惊奇的发现，该循环核酸可用来评价疾病的状态。本发明的一个方面，将血浆或血清分成包括颗粒相关和非颗粒相关核酸的不同相对浓度的两个或更多的组分，随后提取这些组分的核酸，可对患者与对照者的血浆或血清样本中的颗粒相关和非颗粒相关的核酸相对浓度进行比较。两个样本间的浓度的不同可用来进一步评价疾病的状态。本发明还提供孕妇血浆或血清中核酸的检测和定量分析的方法，来评价孕妇或其胎儿的疾病或状态。
特别令人惊奇的是，可以将患者血浆或血清中的循环核酸组分的分离用来辅助诊断、检测、治疗、预后判断及疾病状态的监测。尽管现有技术已经发现总核酸水平的增加可作为某些疾病的指示，但还不曾证实，通过将循环核酸分成不同浓度的颗粒相关和非颗粒相关的核酸组分可以进一步评价疾病的状态。特别是还不曾发现，对于那些其循环核酸的总水平不能作为疾病指示的疾病状态，所述的非颗粒相关组分中的核酸相对浓度可用作疾病的指示并进一步用于疾病的评价。
选择患者群本发明提供了评价患者疾病状态的方法，该患者怀疑患有、已知患有或有可能患有此种疾病状态。疾病的状态包括用循环在个体血浆或血清中的非颗粒相关和颗粒相关核酸的增加来作为标志的任何疾病状态。用循环在个体血浆或血清中的非颗粒相关和颗粒相关核酸增加的浓度作为标志的疾病包括但不限于以异常水平的细胞死亡为特征的疾病，例如，与凋亡非适当活化相关的疾病。凋亡的非适当活化可导致多种疾病状态包括但不限于，例如，获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、神经退行性疾病、子痫前期、Alzheimer氏病及缺血性损伤。诸如癌症、preeclampsia、外伤、心肌梗塞、中风和老化的状态能以细胞死亡的异常水平为特征。使用常规的方法(例如临床检查、实验室化验)来鉴定患者是否患有或有可能患有与异常水平细胞死亡相关的疾病状态，例如AIDS、神经退行性疾病、缺血性损伤、外伤、癌症等等。
本发明还提供了评价孕妇或其胎儿的疾病状态的方法。可通过本领域公知的常规技术来确定妇女是否妊娠。
本发明提供评价怀疑患有、已知患有或有可能患有肝细胞癌或鼻咽癌患者的疾病状态的方法。肝细胞癌或鼻咽癌患者可具有本领域所属技术人员公知的鉴别性病理学特征。可根据临床、放射性、内窥镜或实验室检查手段来诊断肝细胞癌或鼻咽癌。
本发明提供评价患者外伤的方法。外伤是一个世界性问题，每年夺取数百万人的生命。由于脓毒血症或多器官衰减综合症(MODS)，通常会在外伤的数天或数周后造成患者的最终死亡。通常认为严重外伤后的初始损伤激发的系统性炎症反应及后续损伤例如激惹性复发、手术或脓毒血症最终引起包括肺、肝、肾、脑、胃肠消化道及造血系统的器官衰竭。抗感染干预经常会造成患者活存率的不理想结果。一种可能的原因是在早期没有准确地鉴定处于高风险的外伤患者从而应用有潜在作用的干预来防止MODS的发生。本发明提供评价怀疑患有、已知患有或有风险患有外伤患者的疾病状态的方法。使用本领域公知的常规的临床、放射性、或实验室检查手段，本领域所属技术人员可对患有或有可能患有外伤的患者作出初步诊断，并可根据本发明的方法来进一步评价外伤的状态。
获得血液样本从本发明所述的患者中获得血液样本。可通过常规的方法将血液吸入例如硅化玻璃管的收集小管中，在制备血清时既可不抗凝又可使用例如EDTA、柠檬酸钠或肝素的抗凝剂。在优选的实施方案中，在冷冻前，从全血中分离血浆或血清组分。可通过常规的方法进行新鲜血浆分离，例如可根据公知的离心方法从全血中分离新鲜的血浆或血清。在一个优选的实施方案中，为使凋亡小体不从血浆或血清中分离出去，离心是温和进行的。本发明的一些实施方案中，例如通过RT-PCR扩增RNA，优选使用肝素酶来预处理肝素化的血液。
核酸的提取使用本领域公知的常规提取方法，例如凝胶提�。�二氧化硅、玻璃小珠或硅藻(diatom)提�。�胍或碱性胍盐的提�。�化学提取方法或分子筛或阴离子交换色谱方法(见美国专利6,329,179及国际专利公开号WO01/42504)，从血浆或血清中提取核酸。核酸(例如DNA)也可使用QIAamp血液试剂盒，根据制造商(Chen XQ等Nat.Med.1996；21033-5)推荐的“血液与体液方法”来提取。
在一种方法中，利用改良的Fournie等(1986 Anal.Biochem.158250-256)的方法，使用凝胶沉淀血浆或血清中的核酸。将凝胶与水混合制备凝胶溶液，将该混合物高压灭菌并用0.2μm的滤膜过滤。所得溶液随后在干冰/乙醇浴中冷冻，并在室温下融化。用所得溶液制备0.3％凝胶溶液。将血浆或血清与EDTA、无菌水混合并乳化。离心后，移去水层，并转移至清洁的小管中。加入0.3％凝胶溶液和乙醇来沉淀DNA，其后在-20℃下孵育。
在另一方法中，使用特异杂交探针通过富集的方法提取核酸，或进一步富集提取的核酸，其中所述的杂交探针固化于例如尼龙或磁株的物质上，其上的含有污染的样品例如非需要的核酸，可通过公知的方法例如严格的洗涤来去除。其它的提取方法包括使用磁场或电场的方法。
在另一方法中，通过在约90℃～约100℃的条件下加热血浆或血清将近20分钟来从血浆或血清中提取核酸。
利用Boom等(Boom等，1991，J.Clin.Microbiol.291804-1811；Boom等1989，J.Clin.Microbiol.28495-503)中所述的玻璃小珠、二氧化硅颗粒或硅藻的方法或适合的方法，可从血浆或血清中提取循环核酸。通过公知的方法将血浆或血清与二氧化硅悬浮液混合。随后将该混合液离心，吸出上清液并丢弃。利用洗涤缓冲液(乙醇和丙酮)洗涤二氧化硅-DNA颗�：螅�将其干燥，其后用含有或不含蛋白酶K的TE缓冲液洗提样品。洗提后，将样品离心并复原含DNA的上清液。
本领域所属技术人员应知道从血浆或血清中提取DNA或RNA的其它公知方法。可在本发明的方法中使用任何从血浆或血清中纯化DNA或RNA的手段。
将血浆或血清核酸分离为两个或更多组分在本发明的一些实施方案中，在将血浆或血清样本分为含不同相对浓度的颗粒相关或非颗粒相关核酸的两个或更多组分后，从血浆或血清中分离核酸。分离前，该血浆或血清样本应同时含有颗粒相关或非颗粒相关核酸种类。分离后，这些组分应含有不同相对浓度的颗粒相关或非颗粒相关核酸。可通过任何分离技术，包括在超速离心后根据它们的大小或形状来分离颗粒的技术，将血浆或血清样本分离为这些组分。
在一种方法中，通过不同孔径的滤膜例如5μm、0.45μm或0.22μm的滤膜来过滤分离这些提取的核酸。颗粒相关核酸例如某种规格大小的凋亡小体中的核酸，将不能通过孔径低于该规格大小的滤膜，然而非颗粒相关核酸或颗粒低于该规格大小的颗粒相关核酸可以通过。为了说明的目的，如果使用0.22μm的滤膜分离含有颗粒大小为0.1μm～5μm(颗粒相关核酸)的含有颗粒相关核酸的血浆或血清，通过滤膜的溶液含有的颗粒相关核酸浓度应低于通过0.45μm滤膜的血浆或血清样本的浓度。
在另一方法中，使用强烈离心力或超速离心来沉淀血浆或血清样本中的颗粒相关核酸。在本发明的方法中，能够将循环核酸分离为颗粒相关或非颗粒相关组分的离心力足以沉淀样本中的几乎所有微粒物质。可以使用70,000g～100,000g的离心力将最初同时含有颗粒相关或非颗粒相关核酸的血浆或血清样本转变为其中非颗粒相关核酸的组分浓度增加了的样本。
任何将颗粒相关核酸分离为不同规格大小样本的方法均可在本发明方法中应用。其它的方法是本领域所属技术人员所公知的，包括荧光激发的细胞分类、磁活化的细胞分类或差异沉降。
核酸的检测方法本发明方法检测的核酸通常约为40个核苷酸长度到几千个核苷酸长度。通常为约80～约200个核酸。
在核酸(例如DNA或RNA)从血浆或血清中分离后，可通过本领域所属技术人员公知的方法来检测所述的核酸。还可以在分离为非颗粒相关和颗粒相关组分后检测所述核酸。任何常规的DNA或RNA检测方法可用于例如核酸的含量或浓度的检测和定量。在优选的实施方案中，任何用于检测低拷贝数核酸的手段可用于本发明的核酸检测。低拷贝数核酸的检测和定量手段包括诸如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层层析(TLC)、高扩散色谱(hyperdiffusion chromatography)、质谱分析(mass spectroscopy)等等的生物化学分析方法。这些方法是本领域所属技术人员所公知的，因此在此不作详述(参见如美国专利号第6,013,422、6,261,781、6,268,146或5,885,775)。
本发明的方法通常使用但不总是依赖于扩增或信号扩增的方法来对所述核酸进行检测。本领域所属技术人员应认识到可通过诸如连接酶链式反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增、转录扩增及自我持续的序列复制的任何公知的方法来实现样本中靶序列的扩增，其中每种方法都能提供充分的扩增。
PCR的方法是本领域所属技术人员公知的。预了解PCR的方法和方案可参见例如Innis等编辑的PCR Protocols.A Guide to Methods andApplication(Academic Press，Inc.，San Diego，CA.1990)。PCR反应试剂和方案也可从诸如Roche Molecular Systems的供应商处得到。
上述检测的核酸可以是DNA或RNA分子。在本发明特定的实施方案中，检测了RNA。所检测的RNA分子也是从基因组序列转录的RNA，但其不编码功能多肽。扩增的第一步是所扩增区域的DNA拷贝(cDNA)的合成。可通过分开的步骤，或在同源的反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)(一种改良的扩增RNA的聚合酶链式反应)中来实现反转录。核糖核酸的PCR扩增的适合方法如Romero与Rotbart的DiagnosticMolecular BiologyPrinciples and Applications pp.401-406，Persing等编辑，(Mayo Foundation，Rochester，MN 1993)及Rotbart等的美国专利第5,075,212号以及Egger等，J.Clin.Microbiol.331442-1447(1995))中所述。
本发明方法所使用的引物优选至少约为15核苷酸到约50核苷酸长度，更优选约15～约30个核苷酸长度。
为了通过PCR扩增样本中的靶核酸序列，该序列必需接触到扩增系统中的成分。通常，可从样品中分离核酸来实现这种接触性。从生物样本中提取核酸的各种技术是本领域所属技术人员公知的并如上所述。
每一PCR循环的第一步包括由引物延伸而形成的双链核酸的分离。当所述链分离后，PCR的下一步包括将分离链与侧翼连接于靶序列的引物的杂交。随后引物开始延伸形成靶链的互补复制。对于成功的PCR扩增，所设计的引物应是每条引物沿双链序列杂交的位置能够从一条引物合成延伸产物(互补序列)，当从模板分离时，其可作为另一条引物延伸的模板。多次重复变性、杂交和延伸的循环直到获得所需要的扩增核酸(扩增体)的含量。
在PCR步骤优选的实施方案中，通过将反应体系加热到足够高的温度(～95℃)达足够长的时间使所述的双链变性但不引起聚合酶的不可逆变性，来实现链的分离(参见美国专利第4,965,188号)。PCR反应中的引物的模板依赖性延伸是在有充足含量的4种三磷酸脱氧核糖核酸(通常为dATP、dGTP、dCTP及dTTP)存在下，在含有适合的盐、金属阳离子及pH缓冲系统的反应介质中，通过聚合试剂催化完成的。适合的聚合试剂是公知的催化合成模板依赖性DNA的酶。在本发明中，引物延伸用的初始模板通常为从RNA转录的第一条cDNA链。适合从RNA模板合成cDNA的反转录酶(RTs)是本领域所公知的。
PCR在热稳定酶的作用下最通常以自动处理步骤来实现。在此步骤中，通过变性过程、引物的退火过程和延伸反应过程来自动地循环反应混合物的温度。
同样可使用本领域所属技术人员公知的其它的常规技术来检测本发明中的核酸。尽管通常在检测的步骤之前进行扩增的步骤，但在本发明的方法中扩增并不是必需的。例如，可以通过大小的分离(例如，凝胶电泳)来鉴定所述的核酸。当与对照者比较时，样本中出现不同的或附加条带是存在本发明中的靶核酸的指示。可选择地，通过公知的技术进行测序来鉴定靶核酸。可选择地，也可使用靶核酸特异寡核苷酸探针来鉴定特异片段的存在。
如下文的详细解释，使用本发明的方法产生的扩增片段的大小通常足以鉴定与特定疾病相关的一个或多个条带的存在。因此，本发明的一些实施方案中，由给定的样本所产生的扩增片段的大小分离(例如凝胶电泳)可用于区分与特定疾病相关的片段。这通常利用与扩增目的样本相同的引物来扩增对照组来进行。当在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳中扩增序列，并使用例如公知技术(参见Sambrook等)中的溴乙非啶溴化物或其它诸如荧光染料(例如SYBR greenTM)(分子探针)染色剂来将所述核酸染色后，比较所述样本与对照组的条带类型。当与对照组比较时，所述样本中出现不同或附加的条带，即为疾病相关条带出现的指示。
序列特异探针杂交是公知的检测样本中目的核酸的方法，该样本含有细胞、生物液体等等。在充分严格的杂交条件下，探针只与基本互补的序列进行特异杂交。可放宽杂交条件的严格程度，使其能允许不同数量序列的错配。如果预先扩增靶序列，使用这种序列特异的杂交来鉴定扩增产物能够保证只有准确扩增的靶序列能被鉴定，因此降低了假阳性的产生率。
一些杂交的形式是本领域所属技术人员公知的，包括但不限于溶液相、固相、寡核苷酸芯片、混合相或原位杂交分析。在溶液(或液体)相杂交中，靶核酸与探针或引物都可在反应混合物中进行自由的相互作用。诸如实时PCR系统的技术也已经发展为能够进行PCR反应扩增产物的分析(例如定量分析)。在此反应类型中，与特异寡核苷酸探针的杂交发生在鉴定靶核酸存在的扩增阶段。因有热力学控制的两个阶段的转换，寡核苷酸探针的杂交可保证其高度特异性。此种类型分析的例子为荧光共振能量转换杂交探针(fluorescence resonance energy transfer hybridizationprobes)、分子信标(molecular beacons)、Scorpions分子标记(molecularscorpions)及核酸外切酶杂交探针(见Bustin SM.J.Mol.Endocrin.25169-93(2000)的综述)。
在固相杂交分析中，无论是靶序列或是探针均连接于固体支持物上，在其上能够与液体中的互补核酸杂交。固相形式的例子包括Southern或Northern杂交、斑点杂交、微阵列、芯片等等。原位技术特别适用于鉴定染色体物质(例如在中期或间期细胞中)中的核酸。以下的文章概括了各种杂交分析形式Singer等，Biotechniques 4230(1986)；Haase等，METHODS IN VIROLOGY，Vol.VII，pp.189-226(1984)；Wilkinson，INSITU HYBRIDIZATION，D.G.Wilkinson编辑，IRL Press，Oxford UniversityPress，Oxford；及NUCLEIC ACID HYBRIDIZATIONA PRACTICALAPPROACH，Hames，B.D.& Higgins，S.J.编辑，IRL Press(1987)。
可根据公知的技术来检测杂交复合体，其并不是本发明的关键部分。可使用通常用于检测杂交核酸存在的一些方法中的任意一个来标记能够与靶序列特异杂交的核酸探针。常用的检测方法是使用3H、125I、35S、14C或32P等等标记的探针的放射性自显影技术。根据合成的容易程度、稳定性和所选择的同位素半衰期确定的研究参数来选择放射性同位素。其它标记物质包括化合物(例如生物素和地高辛)，其能与标记有荧光团、化学发光剂及酶的抗配体或抗体连接。可选择地，探针可直接与诸如荧光团、化学发光剂或酶的标记物连接。根据敏感性要求、与探针连接的容易程度、稳定性要求及可使用的仪器来决定标记物的选择。
可利用公知的技术来合成和标记本发明的探针和引物。根据Beaucage，S.L.& Caruthers，M.H.，1981，Tetrahedron Letts.，22(20)1859-1862中第一次描述的固相氨基磷酸三酯(phosphoramidite trimester)方法，利用Needham-VanDevanter，D.R.，等1984，Nucleic Acids Res.，126159-6168所述自动合成仪可化学合成作为探针和引物使用的寡核苷酸。可通过例如Pearson，J.D.& Regnier，F.E.，1983，J.Chrom.，255137-149中所述的天然丙稀酰胺凝胶电泳或阴离子交换HPLC方法，来纯化寡核苷酸。
还可通过信号扩增技术来实现核酸序列的检测。例如，对分枝的DNA分析是使用靶序列特异的探针来鉴定靶序列的存在。利用对探针的修饰来扩增该信号，该探针能允许多种荧光检测剂DNA分子与靶核酸杂交(Chiron Diagnostics)。
以颗粒相关和非颗粒相关形式存在的任何核酸种类均能被检测到并可作为本发明方法中的标志。在一个优选的实施方案中，用所述标志人的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA、血小板碱性蛋白(PBP)mRNA、或线粒体DNA进一步评价疾病的状态。本发明中用于检测GAPDHmRNA、PBP mRNA或线粒体DNA的探针和引物可通过本领域所属技术人员公知的技术来合成(从Perkin Elmer获得的TaqMan探针和扩增引物)。
疾病状态的评价在将血浆或血清核酸分离为两个或更多组分，从而使每个组分中的颗粒相关和非颗粒相关核酸浓度有所不同，并通过公知的方法对每个组分中的核酸进行检测和定量分析之后，可对所述的疾病状态进行评价。
通过分析一个或更多组分中核酸的含量或浓度并将其与对照组比较来评价所述的疾病状态。本领域所属技术人员可通过比较来评价患者的疾病状态。例如，当通过超速离心处理一个组分时，其中上清液中应只含有非颗粒相关核酸，与相同方法处理的对照组比较，样本中非颗粒相关核酸的不同浓度显示患者的异常状态。患者与对照组的非颗粒相关核酸的浓度差异程度越大，所述异常状态越严重。通过比较患者与对照组中非颗粒相关核酸的相对不同，本领域所属技术人员可判断一个个体是否具有发展为某种疾病的风险。通过比较患者与对照中非颗粒相关核酸的相对不同，本领域所属技术人员可诊断患者的疾病、鉴定疾病的发展阶段、或进行疾病的预后判断。
例如，在一些患者中，循环在她或他的血浆或血清中的非颗粒相关核酸浓度可以与对照组相同。在其他一些患者中，样本中非颗粒相关核酸的含量或浓度可略高于对照组，例如，高于50％。在另一些患者中，样本中非颗粒相关核酸的含量或浓度可以是对照组的2倍。而在一些患者中，样本中非颗粒相关核酸的含量或浓度显著高于对照组，例如高于对照组8～15倍。根据样本与对照组中非颗粒相关核酸的浓度的相对不同，可确定患者不同的住院时间、不同的治疗方式或监控计划。例如，如果样本中非颗粒相关核酸的浓度与对照组相同，患者将会有较好的预后判断并可出院。在另一个例子中，如果样本中非颗粒相关核酸的浓度略高于对照组，患者可以出院但需要进一步的监控。如果样本中非颗粒相关核酸的浓度显著高于对照组，例如高于对照组15～100倍，患者的预后不好并需要更积极的治疗。
在本发明的一个方面，可以用循环在患者血浆或血清中的非颗粒相关核酸浓度的增加来评价患者的癌症。从怀疑患有、已知患有或可能(有风险)患有癌症的患者中获得血液样本。通过本发明的方法将所述血浆或血清分为两个或更多组分，其中每个组分含有与其它组分不同相对浓度的颗粒相关核酸。通过公知的方法来提取和鉴定这些组分中的核酸。将对应每个组分的核酸浓度与对照组比较。在一优选的实施方案中，可使用GAPDH mRNA标志来评价疾病。依据患者与对照组样本中核酸的相对差异，可诊断并进一步评价癌症。在一些实施方案中，可诊断并进一步评价鼻咽癌。在另一些实施方案中，可诊断并进一步评价肝细胞癌。
在本发明的一些实施方案中，将所述核酸分为两个或更多组分不是进一步评价鼻咽癌或肝细胞癌患者所必需的。在这些实施方案中，通过将鼻咽癌或肝细胞癌患者的血浆或血清样本中的总GAPDH mRNA浓度与对照组血浆或血清样本中的GAPDH mRNA浓度进行比较，可鉴定和进一步评价该癌症。例如，样本中GAPDH mRNA浓度的增加显示患者患有癌症。
在本发明的另一个实施方案中，可以用循环在孕妇血浆或血清中的颗粒相关和非颗粒相关核酸的相对或绝对浓度的异常来评价患者或其胎儿的疾病或生理状态。从孕妇获得血液样本并将其分为不同组分。通过本发明中的方法将这些组分分离，通过此方法分离的组分可含有不同相对浓度的颗粒相关和非颗粒相关核酸。随后使用公知的方法提取、鉴定并分析这些组分中的核酸。将这些组分中核酸的浓度相互比较并与对照组比较。在一些实施方案中，优选的标志为GAPDH mRNA。依据这些组分之间或与对照组比较中的核酸浓度的差异，可诊断或进一步评价患者或其胎儿的疾病或生理状态。
在本发明的一个方面，可以用循环在患者血浆或血清中的非颗粒相关核酸浓度的增加来评价患者的外伤。从外伤患者获得血液样本。分离血浆或血清并将其分为含有不同相对浓度的颗粒相关和非颗粒相关核酸的两个或多个组分。使用公知的方法提取、鉴定并分析这些组分中的核酸。将这些组分中的核酸浓度与对照组比较。用于评价疾病的优选的标志为GAPDH mRNA或线粒体DNA。依据这些来自外伤患者与对照组样本的组分中的核酸浓度的相对差异，可进一步评价外伤。例如，通过将外伤患者中主要含有非颗粒相关核酸的组分中的核酸浓度与对照组进行比较，可确定外伤的严重程度。在一些患者中，与对照组比较，其血浆或血清非颗粒相关核酸的浓度增加4～6倍，可显示患者患有轻度的外伤。在其他患者中，7～10倍的增加应显示患者患有中度的外伤，而在其他患者中，11～15倍的增加应显示患者患有严重的外伤。
信息学通常，生物信息学是指计算机与统计学技术在生物信息处理方面的应用和研究。发展建立和研究含有生物信息的数据库的系统和方法，该生物信息包括健康与患病个体血浆或血清中颗粒相关和非颗粒相关循环核酸浓度，以及发展使用这些生物信息来评价疾病状态的能力显得越来越重要。
因此，在一个实施方案中，本发明提供用于建立进一步鉴定医学特性的数据库的方法。所述方法包括建立怀疑患有、已经患有、有可能(有风险)患有特定疾病的患者的血浆或血清中颗粒相关和非颗粒相关核酸浓度的数据库，并使用软件程序来将其与对照组比较。本发明还通过收集来自健康人和患病者的数据，以及其用来判断存在或不存在疾病、疾病的严重程度、疾病预后判断、疾病适当的治疗计划或风险分级的血浆或血清中颗粒相关和非颗粒相关核酸的对应浓度的数据，来提供产生对照组的方法。
在另一个实施方案中，本发明还提供使本发明方法自动化的设备，所述设备含有计算机和能将输入的怀疑患有、已经患有、有可能(有风险)患有特定疾病患者的血浆或血清核酸浓度与对照组进行比较的软件程序系统。核酸浓度数据以计算机可读形式输入并以计算机可检索的形式保存。本发明还提供用数据集编码的计算机可读介质，该数据集包括怀疑患有、已经患有、有可能(有风险)患有特定疾病的患者的颗粒相关和非颗粒相关的血浆或血清核酸的浓度水平。
本发明所述定量个体血浆或血清中颗粒相关和非颗粒相关核酸浓度的方法，其中提供了与病理状态、疾病的易患病体质、治疗监控、预后判断、风险分级等等对应的信息。尽管从本发明中产生的数据也适合以用手工观察和分析，但在一个优选的实施方案中，使用高速计算机来进行数据的预处理。
索引和检索生物分子信息的一系列方法是本领域所属技术人员公知的。例如美国专利第6,023,659号和第5,996,712号揭示了用于储存生物分子序列信息相关数据库，并可根据一种或多种蛋白功能层级将序列分类并搜寻生物分子序列。
本发明还提供计算机数据储存设备中用于储存和检索血浆或血清核酸浓度集合，该设备包括磁盘、光盘、磁-光盘、DRAM、SRAM、SGRAM、SDRAM、RDRAM、DDR RAM、磁泡沫记忆装置以及包括CPU注册与on-CPU数据储存系列的其它数据储存设备。
本发明还优选提供磁盘，诸如IBM兼容(DOS、Windows、Windows95/98/2000、Windows NT、OS/2)或其它格式(例如，Linux、SunOS、Solaris、AIX、SCO Unix、VMS、MV、Macintosh等等)的软盘或硬盘(fixed，Winchester)设备，包括从本发明方法中收集的位模式编码数据，该数据放在适合检索并处理计算机化序列分析、比较或相对定量方法的文件格式中。
本发明还提供一个网络连接，包括多种通过数据连接的计算设备，该连接诸如Ethernet缆(coax or 10BaseT)、电话线、ISDN线、无线网络、光纤或其它适合信号传输的介质，通过其至少一个网络设备(例如计算机、碟盘阵列等等)包括磁性区域(例如磁盘)和/或含有从本发明方法中获得的位模式编码数据形式负载区域(例如动态随机存取储存器的阵列)。
本发明还提供传输浓度数据的方法，包括在电子通信设备上产生电信号，该电子通信设备诸如调制解调器、ISDN终端适配器、DSL、电缆调制解调器、ATM转换等等，其中信号包括(原态或密码形式)本发明方法中收集的位模式编码数据。
在一优选的实施方案中，本发明提供用于比较患病个体与对照组血液中血浆或血清中颗粒相关和非颗粒相关核酸浓度的计算机系统。中央处理器优选初始安装并执行用于分析结果对齐和/或比较的计算机程序。通过I/O设备将数据输入中央处理器。计算机程序的执行可使中央处理器从数据文件中检索数据。
目标数据或记录以及计算机程序可转化为第二存储，其通常为随机存取的存储(例如，DRAM、SRAM、SGRAM或SDRAM)。例如，中央处理器可以是常用的计算机(例如，Intel Pentium、PowerPC、Alpha、PA-8000、SPARC、MIPS 4400、MIPS 10000、VAX等等)；程序可以是商业销售的或公用的分子生物学软件包(例如，UWGCG序列分析软件，Darwin)；数据文件可以是光或磁盘、数据服务器、存储设备(例如，DRAM、SRAM、SGRAM、SDRAM、EPROM、bubble memory、闪存等等)；I/O设备可以是包括视频显示与键盘、调制解调器、ISDN终端适配器、Ethernet端口、打孔卡读卡机、磁条读卡机或其它适合I/O的设备。
本发明还优选提供诸如上述的计算机系统的应用，其包括(1)计算机；(2)从本发明方法获得的核酸浓度集合的储存的位模式编码，其可以存储在计算机中；(3)比较对照组；(4)用于比较的程序。应理解，本发明所述的实施例与实施方案仅仅是为了说明的目的，其各种修改和变化将是本领域所属技术人员所能预见到的，并包含在本申请的精神和范围内，同时也是本发明权利要求的保护范围。本文所引用的所有出版物、专利和专利申请在此全部引入作为本文的参考。
实施例实施例1健康个体血浆或血清中颗粒或非颗粒相关循环核酸的检测将17例从健康受试者获得的血浆样本用于分析人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA与人β-球蛋白DNA浓度。在17个血浆样本中，对其中的14个进一步检测了人线粒体DNA浓度。将源自17例健康受试者的10个血清样本用于分析人GAPDH mRNA与人β球蛋白DNA浓度。在定量分析前，将每个样本的小份各自通过5μm、0.45μm及0.22μm孔径的滤膜。图1A的数据显示过滤对血浆或血清样本中的GAPDH mRNA浓度具有清楚的显而易见的作用(Friedman检验，对于血浆或血清样本P＜0.001)。配对分析进一步显示，具有这些滤膜孔径的每对中可检测到具有统计学意义的显著差异(Student-Newman-Keuls检验，每对P＜0.05)。总体上，当将未过滤的配对样本与经0.22μm过滤组配对样本进行比较时，血浆与血清GAPDH mRNA浓度分别以15倍(四分位区间范围10～24倍)及8.7倍(四分位区间范围6.6～11.5倍)的中位值降低。因此，我们的数据清楚地显示可过滤的GAPDH mRNA物质存在于人的血浆或血清中。图1B的数据显示，对于血浆样本中的线粒体DNA浓度可获得相似的过滤效果。在经不同孔径过滤的血浆样本中可发现线粒体DNA浓度的显著差别(Friedman检验，P＜0.001)。配对分析表明，除一组配对比较组之外，全部检测到了显著性差异(Student-Newman-Keuls检验，P＜0.05)。通过5μm孔径滤膜处理的血浆与未处理的血浆没有显著性差异(Student-Newman-Keuls检验，P＞0.05)。总体上，当将未过滤配对样本与经0.22μm过滤组配对样本进行比较时，血浆线粒体DNA浓度以8.9倍(四分位区间范围2.8～23.7倍)的中位值降低。与此结果相反，在经不同孔径滤膜过滤的血浆或血清样本中，β-球蛋白的DNA浓度没有统计学意义的显著性差异(Friedman检验，血浆样本P＝0.455；血清样本P＝0.516)(图1C)。除了对GAPDH mRNA的颗粒相关特性进行研究之外，我们还分析了称为血小板碱性蛋白(PBP)的人体基因转录产物。源自17例健康受试者的8个血浆和血清样本用于此分析。图1D显示，再次清楚地观测到了过滤对PBP mRNA浓度的影响。总体上，当将未过滤配对样本与经0.22μm过滤组配对样本进行比较时，血浆与血清PBP mRNA浓度分别以160倍(四分位区间范围41～427倍)及38倍(四分位区间范围15.7～52倍)的中位值降低。因此这些结果表明，血浆或血清中GAPDH mRNA、PBP mRNA及线粒体DNA的显著比例差别部分为颗粒相关的。另一方面，循环β-球蛋白DNA是非颗粒相关的。
为研究血浆中的核酸是否以非颗粒相关形式存在，我们通过超速离心进行了第二系列的试验。用从另外10例健康受试者中获得的血浆样本来分析GAPDH mRNA与β-球蛋白DNA浓度。在此10个血浆样本中，其中7个用于进一步分析线粒体DNA浓度。在定量分析前，每个样本的小份需经0.22μm过滤步骤或者以99,960×g超速离心处理。在以往的研究中，Yamamoto等曾经使用70,000×g的离心力来沉淀各种颗粒(Yamamoto M等，J Clin Microbiol 1995；331756-8)。本研究使用的更加强烈的离心力(99,960×g)因此能够沉淀实质上全部的颗粒物质。图2A与图2B的数据显示，在未过滤的血浆、0.22μm滤膜过滤的血浆及超速离心的血浆中，GAPDH mRNA与线粒体DNA浓度均具有统计学意义的显著差异(Friedman检验，对于GAPDH mRNA与线粒体DNA，P＜0.001)。配对比较表明，在未过滤的血浆与0.22μm滤膜过滤的血浆之间(Student-Newman-Keuls检验，对于GAPDH mRNA与线粒体DNA，P＜0.05)，和在未过滤的血浆与超速离心的血浆之间(Student-Newman-Keuls检验，对于GAPDH mRNA与线粒体DNA，P＜0.05)，均具有显著性差异。然而，在0.22μm滤膜过滤的血浆与超速离心的血浆之间，GAPDH mRNA与线粒体DNA浓度没有显著性差异(Student-Newman-Keuls检验，对于GAPDH mRNA与线粒体DNA，P＞0.05)(图2A与2B)。另一方面，在经不同处理的血浆样本中，β-球蛋白DNA浓度的差异没有达到具有统计学意义的显著性(Friedman检验，P＝0.122)(图2C)。有趣的是，尽管通过此超速离心步骤，仍然在上清液中可检测到一定含量的GAPDH mRNA与线粒体DNA。这些信号显示非超速离心血浆样本中存在的GAPDH mRNA与线粒体DNA浓度的中位值分别为7.4％(四分位区间范围4.3％～13％)与15.4％(四分位区间范围5.3％～39.3％)，并很可能代表了非颗粒相关循环核酸种类。
实施例2肝细胞癌(HCC)临床状态中血浆循环核酸的颗粒相关和非颗粒相关特性的存在从16例HCC患者中获得的血浆样品用于分析。图3A显示，在HCC患者血浆中存在颗粒相关GAPDH mRNA。事实上，通过0.22μm滤膜过滤可使血浆中GAPDH mRNA浓度以9.3倍(四分位区间范围6.9～31.1倍)的中位值减少。从16例HCC患者中收集7例，所收集的血浆样本量足够用于附加的包括β-球蛋白DNA定量的试验。在HCC患者与健康个体进行比较，无论是过滤的或是未过滤的，其血浆β-球蛋白DNA浓度没有统计学意义的显著性差异(Mann-Whitney排列总和检验，过滤血浆样本P＝0.525，未过滤血浆样本P＝0.418)(图3B)。因此，通过0.22μm滤膜过滤可使HCC患者血浆中GAPDH mRNA浓度显著降低(图3A)。有趣的是，我们还发现过滤或未过滤处理后HCC患者血浆中的GAPDH mRNA浓度显著高于健康个体的浓度(Mann-Whitney排列总和检验，对于过滤样本，P＜0.05；对于未过滤样本P＜0.005)(图3A)。这些结果表明，HCC患者血浆中的颗粒相关和非颗粒相关mRNA的浓度是增加的。对于颗粒相关mRNA，一种可能的原因是癌症患者中肿瘤细胞的凋亡可释放包裹有RNA的凋亡小体进入到血浆中。
实施例3鼻咽癌(NPC)临床状态中血浆循环核酸的颗粒相关和非颗粒相关特性的存在为证实在其它癌症中是否也存在颗粒相关核酸，从7例NPC患者中获得的血浆样本用于分析GAPDH mRNA与β-球蛋白DNA浓度。如图4A中的数据显示，颗粒相关GAPDH mRNA可存在于NPC患者的血浆中。通过0.22μm滤膜过滤可使血浆中GAPDH mRNA浓度以3.3倍(四分位区间范围3倍～7.5倍)的中位值减少。与HCC患者相似，无论是过滤的或是未过的，NPC患者中的GAPDH mRNA浓度显著高于健康个体的浓度(Mann-Whitney排列总和检验，过滤及未过滤血浆样本，P＜0.05)(图4A)。相反，无论是过滤的或是未过滤的，NPC患者与健康个体的β-球蛋白DNA浓度未发现有统计学意义的显著性差别(Mann-Whitney排列总和检验，对于过滤样本，P＝0.065；对于未过滤样本，P＝0.155)(图4B)。
实施例4妊娠临床状态中血浆循环核酸的颗粒相关和非颗粒相关特性的存在从妊娠16周～20周的15个孕妇中获得的血浆样本用于分析GAPDHmRNA与β-球蛋白DNA浓度。图5A的数据清楚地表明，颗粒相关GAPDHmRNA同样可存在于孕妇的血浆中。通过0.22μm滤膜过滤可使血浆中GAPDH mRNA浓度以16.6倍(四分位区间范围14倍～28.3倍)的中位值减少。与HCC和NPC患者不同，无论是过滤的或是未过滤的，孕妇血浆中的GAPDH mRNA浓度显著低于健康个体的浓度(Mann-Whitney排列总和检验，过滤的及未过滤血浆样本，P＜0.001)(图5A)。类似地，无论是过滤的或是未过滤的，孕妇与健康个体的β-球蛋白DNA浓度没有统计学意义的显著性差别(Mann-Whitney排列总和检验，对于过滤样本，P＝0.265；对于未过滤样本，P＝0.628)(图5B)。
为确定颗粒相关RNA是否存在于妊娠的全过程，分别从妊娠3个月、6个月与9个月的10例、22例、4例孕妇中获得的血浆样本用于分析GAPDH mRNA。如图5C所示的数据表明，颗粒相关GAPDH mRNA可存在于妊娠各个阶段的母体血浆中。对于妊娠的所有阶段，可观察到血浆样本经0.22μm滤膜过滤后其GAPDH mRNA浓度显著降低(Mann-Whitney排列总和检验，妊娠3个月、6个月、9个月样本，P＜0.001)。
除GAPDH mRNA之外，还对母体血浆的2种胎盘mRNA、人胎盘催乳素(hPL)mRNA及人绒毛膜促性腺激素β-亚基(βhCG)mRNA进行了颗粒相关特性分析。从妊娠7～14周的14例孕妇中收集了血浆样本。每个样品的小部分各自通过5μm和0.45μm孔径的滤膜或不过滤。随后对它们进行hPL、βhCG及GAPDH mRNA的定量分析。图6中的数据显示，过滤对血浆hPL(图6A)与βhCG(图6B)mRNA浓度具有显著的作用(Friedman检验，对于hPL与βHCG mRNA，P＜0.001)。配对分析表明，在5μm与0.45μm过滤组间，具有统计学意义的显著性差异(Dunn′s检验，对于hPL与βhCG mRNA，P＜0.05)。总体上，当未过滤配对样本与0.45μm的过滤组配对样本进行比较时，血浆hPL与βhCG mRNA水平分别以3.9倍(四分位区间范围1.8倍～5.5倍)及3.5倍(四分位区间范围2.8倍～9.0倍)的中位值减少。图6C显示相应的母体血浆样本的GAPDH mRNA浓度。如所预料的，在经不同处理的各组间检测出显著的差异(Friedman检验，P＜0.001)。配对分析显示，5μm与0.45μm过滤组间具有显著的差异(Dunn′s检验，P＜0.05)。这些数据证明，具有显著性比例差别的来自胎盘的mRNA，即hPL与βHCG mRNA与母体血浆中的亚细胞颗粒性物质相关。
实施例5外伤临床状态中血浆循环核酸的颗粒相关和非颗粒相关特性的存在从依据Wales医院原则需要急诊复苏室治疗的有外伤损伤的患者中获得血浆。从香港中文大学研究道德委员会获得研究道德批准。由急诊室确定总的解剖损伤的范围，并使用损伤严重程度评分(Injury SeverityScore(ISS))进行客观计算(Baker SP等，J.Trauma 1974；14187-196)。根据ISS，将外伤患者分为3组轻度损伤(ISS＜9)，中度损伤(ISS＝9～15)及重度损伤(ISS＞15)。只在急诊室进行损伤鉴定时才考虑损伤的严重程度分数，并不包括计算机断层扫描中的发现。
将5～10ml的血液样本收集到EDTA-小管中。在4℃以1500g离心，并小心地从EDTA小管中移出血浆，并转移至普通的聚丙烯小管中。在移出血浆样本时，应加倍小心保证淡黄色的包被层不混乱。每个血浆样本分为两个组分一半以0.22μm滤膜过滤，剩下部分不过滤。
通过RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)提取血浆样本中的RNA。将600～1000μl血浆与1.2ml Trizol LS试剂(Invitrogen)及0.2ml氯仿混合。以11,900g离心此混合物15分钟，并将上清层移至新的管中。加入与上清层相同体积的70％乙醇。随后将此混合物加到RNeasy小柱，并根据说明书指导进行处理。将总RNA溶于15μl无RNase的水中之后，用DNase I(Invitrogen)处理。将RNA冻存于-80℃直到下一步骤。
使用Applied Biosystems 7700 Sequence Detector检测仪(Foster City，Calif.，U.S.A.)进行实时定量RT-PCR分析，该仪器将温度循环仪/荧光检测仪结合了光学监控单独PCR反应进程的能力。根据5′核酸酶分析(nuclease assay)(Holland P.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1991；887276-7280)(Perkin-Elmer销售的TaqMan assay)来使用扩增和产物报告系统。在此系统中，除常规PCR中的2条扩增引物外，还包括双标记的荧光杂交探针(Livak KJ等Nat.Genet.1995；9341-342)。一种荧光染料作为报告者(FAM，即6-羧基荧光素)使用，而其发散光谱被另一种荧光染料(TAMRA，即6-羧基-四甲基若丹明)熄灭。在PCR的延伸阶段，Taq DNA聚合酶的5′～3′核酸外切酶的能力能够从探针上切除报告者，并使其从淬灭物中释放，在518nm处产生荧光强度的增加。该Applied Biosystems7700 Sequence Detector检测仪在DNA扩增时，能够连续检测96扩增孔的荧光谱，并将数据捕获至Macintosh计算机中(Apple Computer，Cupertino，Calif.，U.S.A.)。
一步实时定量RT-PCR系统可用于血浆mRNA浓度的分析。在此系统中，rTth DNA聚合酶同时具有反转录酶与DNA聚合酶的作用。GAPDHTaqMan系统包括扩增引物GAPDH-F，5’-GAA GGT GAA GGT CGGAGT-3’；GAPDH-R，5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’；及双标记荧光TaqMan探针GAPDH-P，5’-(FAM)CAA GCT TCC CGT TCT CAGCC(TAMRA)-3’。从GenBank序列数据库Sequence Database(登录号M33197)获得人GAPDH基因的序列数据。
RT-PCR在体积为50μl的反应体系中进行，由EZ rTth RNA PCR试剂盒与TaqMan��GAPDH对照试剂(Applied Biosystems)提供反应试剂(除了TaqMan探针与扩增引物)。由Applied Biosystems商业合成该GAPDHTaqMan探针。由Genset Oligo(Singapore)合成PCR引物。每个反应包括10μl 5×EZ缓冲液；200nM每种引物；100NM荧光探针；3mM Mn(OAc)2；dATP、dCTP、dGTP每种300μM；600μM dUTP；5单位rTth聚合酶；及0.5单位AmpErase尿嘧啶N-糖基化酶。使用3μl提取的RNA进行扩增。为了随后的浓度计算，应记录准确用量。严格预防RT-PCR的污染。在所有液体操作中使用抗浮尘的移液枪头。使用分开的区域进行扩增反应的建立、RNA模板的加入及扩增反应的实施。该7700 Sequence Detector检测仪提供了额外的保护，即其光学检测系统在扩增反应完成后能排除重开反应管的需要，因此将污染的可能最小化。此外，TaqMan分析还包括进一步的抗污染检测，其使用破坏尿嘧啶的尿嘧啶N-糖基化酶进行预扩增来实施。在96孔反应板中进行扩增，该板由制造者打磨从而防止光线的反射，并利用设计的盖子闭合来防止光线的散射。在每个分析中，每个样本分析2次，并包括多个阴性水的空白对照。针对RT-PCR分析，通过对人的对照RNA(Applied Biosystems)的系列稀释，在RNA浓度为15ng～0.23pg的范围内，制作GAPDH定量的刻度曲线。制造商估计1pg此类RNA通�：�有大约100个拷贝的GAPDH转录产物。
GAPDH系统的温度范围为在反转录前，在尿嘧啶N-糖基化酶存在下，以50℃开始反应2分钟，随后在60℃、30分钟内进行反转录步骤。在95℃变性5分钟后，进行40个循环的PCR反应，其变性步骤为94℃反应20秒，退火/延伸步骤为60℃反应1分钟。扩增数据由7700Sequence Detector检测仪收集并储存在Macintosh计算机中，随后通过由Applied Biosystems开发的序列分析系统(Sequence Detection System(SDS))软件进行分析。每2次重复分析的平均值用于进一步的浓度计算。浓度以pg/ml表示并使用下列公式计算C＝Q×VRNA/VPCR×1/Vext，其中C＝血浆靶序列浓度(pg/ml)；Q＝RT-PCR反应中通过序列检测分析的靶序列量(pg)；VRNA＝提取的RNA总量，每次Qiagen提取通常为15μl；VPCR＝RT-PCR反应中使用的RNA溶液量，通常为3-5μl；Vext＝血浆的提取量，通常为600-800μl。
使用含有PCR产物分析的Sigma Stat 2.03 software(SPSS)软件进行统计学分析。
为评价分析的线性关系，通过GAPDH RT-PCR系统对对照RNA的系列稀释组进行了分析。RT-PCR系统的灵敏度可以满足能够检测出当对照RNA含量为0.23pg(即约23个拷贝)时存在与其中的GAPDH转录产物(图7A)。刻度曲线显示出相关系数为0.995(图7B)。为评价RNA提取与步骤的准确性，对从健康个体获得的血浆样本进行10次重复提取并对提取的RNA样本进行实时定量RT-PCR分析。这些重复分析的Ct值变异系数为1.66％。称为循环阈值(CT)的参数可定义为，高于从循环1～15中计算的平均基线荧光10个标准偏离，并与扩增的初始靶序列拷贝数成一定比例。循环阈值(CT)的点相对于加入的靶序列量，并以常用对数值较近的点作图，其证明实时定量RT-PCR的较大动力学范围和准确性。
对外伤患者血浆RNA的颗粒相关特性进行了研究。分析了来自8例外伤患者的未过滤的及0.22μl滤膜过滤的配对血浆样本的GAPDHmRNA浓度。如图8所示，在外伤患者中存在颗粒相关GAPDH mRNA。通过0.22μm滤膜过滤可使血浆中GAPDH mRNA浓度以70.1倍(四分位区间范围13.03倍～112.8倍)的中位值减少。同样发现，过滤的外伤患者血浆样本中的GAPDH mRNA浓度显著高于对照个体的浓度(Mann-Whitney排列总和检验，P＜0.05)，相反未过滤的外伤患者血浆样本中的GAPDH mRNA浓度与对照组的浓度无显著性差别(Mann-Whitney排列总和检验，P＝0.962)(图8)。与对照组比较，过滤的外伤患者血浆中的GAPDH mRNA浓度以9.9倍的中位值增加。我们的数据表明，当与健康对照组比较时，外伤患者血浆中的非颗粒相关GAPDH mRNA也增加了。此增加可能是因外伤后损伤的细胞主要释放非颗粒相关RNA导致的。
根据损伤严重程度评分(ISS)，将提供过滤血浆样本的17例外伤患者分为重度损伤(6例)、中度损伤(5例)及轻度损伤(6例)。图9A中的数据表明，在正常对照组与不同损伤程度的患者中，0.22μl过滤的血浆GAPDHmRNA浓度具有显著性差别(Kruskal-Wallis检验，P＜0.001)。还发现GAPDH mRNA浓度与所判断的损伤的严重程度成正相关。当与正常对照组比较时，轻度损伤、中度损伤及重度损伤组的GAPDH mRNA浓度中位值分别以6倍、17.4倍及20.6倍增加。这些数据进一步显示，血浆中非颗粒相关GAPDH mRNA对于外伤患者的风险分级和疾病的监控可能具有重要意义。
在6例重度外伤的患者中，4例活存、2例最终死亡。4例存活中的1例、以及该3例最终死亡中的1例发展为多器官衰减综合症(MODS)。他们的过滤血浆GAPDH mRNA浓度如图9B所示。值得注意的是，虽然活存组与未活存组间没有显著性差异(Mann-Whitney排列总和检验，P＝0.133)，但是当与活存组比较时，未活存组GAPDH mRNA浓度的中位值增加5.9倍。
实施例6外伤临床状态血浆循环核酸的颗粒相关和非颗粒相关特性的线粒体DNA的存在已有研究表明，外伤患者血液样本中的循环血浆DNA在损伤后早期增加，并且此增加与后期的外伤综合症有关(Lo YMD等Clin.Chem.2000；46319-323)。在损伤后第一小时，与健康对照组比较，血浆DNA水平增加100倍。与无综合症的损伤患者比较，在发展为器官衰竭(OF)、多器官衰竭综合症(MODS)、急性肺损伤(ALI)及死亡的患者中，以10～18倍的中位值水平增加。尽管在最佳分界点(cutoff point)，具有74％～100％的敏感性和特异性，对于OF，循环血浆DNA可产生63％～77％的阳性预测值、对于MODS为33％～40％(Rainer TH等Ann.NY Acad.Sci.2001；945211-220)。将血浆DNA预测值与其它变量(例如，天冬氨酸转移酶)结合作为预测指南，该预测方式可能提供87％～93％的全部准确的分类以及对于OF的85％阳性预测值和对于MODS的50％阳性预测值。
因为每个细胞含有成百上千个线粒体而每个线粒体又含有多个拷贝的线粒体DNA，同样发现释放到外伤患者血浆中的线粒体DNA显著高于正常对照组。针对外伤状态下的线粒体DNA的分析和定量可用于外伤状态的预测、监控、评价以及风险分级敏感标记。
从依据Wales医院原则需要急诊复苏室治疗的有外伤损伤或中风的患者中获得血浆。从香港中文大学研究道德委员会获得研究道德批准。由急诊室确定总的解剖损伤的范围，并使用损伤严重程度评分(ISS)进行客观计算(Baker SP等，J.Trauma 1974；14187-196)。根据ISS，将外伤患者分为3组轻度损伤(ISS＜9)，中度损伤(ISS＝9～15)及重度损伤(ISS＞15)。只在急诊室进行损伤鉴定时才考虑损伤的严重程度分数，并不包括计算机断层扫描中的发现。
将5～10ml的血液样本收集到EDTA小管中。样本以1500g离心10分钟，并小心地从EDTA小管中移出血浆，再转移至普通的聚丙烯小管中。在移出血浆样本时，应加倍小心保证淡黄色的包被层不混乱。每个血浆样本以0.22μm滤膜过滤并冻存于-20℃直到下一步骤。
利用QIAamp全血试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)通过制造商提供的“血液与体液步骤”，从血浆中提取DNA。每小柱装有400μl～800μl血浆样本用于提取DNA。
线粒体DNA TaqMan系统包括已报道(Parfait等，Biochem Biophys ResCommun 1998；24757-59)的扩增引物Mit 3130F，5’-AGG ACA AGAGAA ATA AGG CC-3’，及Mit 3301R，5’-TAA GAA GAG GAA TTG AACCTC TGA CTG TAA-3’。应用引物表达软件(Applied Biosystems)设计TaqMan探针序列，Mit 3153T，5’-FAM-TTC ACA AAG CGC CTT CCCCCG TAA ATG A-TAMRA-3’。从GenBank数据库(登录号J01415)获得线粒体DNA片段序列数据。除引物与探针之外，所有PCR反应试剂由TaqMan PCR核心试剂盒(Applied Biosystems)提供。根据制造商说明书，PCR反应在体积为50μl的反应体系中进行。在每个反应混合物中加入5μl的血浆DNA，该混合物含有5μl 10×缓冲液A；300nM每种引物；50nMTaqMan探针；4mM MgCl2；dATP、dCTP及dGTP每种200nM；400nMdUTP；1.25U AmpliTaq Gold；及0.5U AmpErase尿嘧啶N-糖基化酶。通过线粒体DNA扩增子的系列稀释，制作线粒体DNA定量的刻度曲线，该扩增子亚克隆在质粒载体中(TOPO��TA克隆试剂盒，Invitrogen)。该刻度曲线在100,000个拷贝到1个拷贝的线粒体DNA的浓度范围内，其制作与每个分析试验平行，且为分析试验的两倍用量。使用AppliedBiosystems 7700 Sequence Detector检测仪进行实时定量PCR。使用以下的温度范围在50℃孵育2分钟，随后在95℃进行第一变性步骤10分钟，并以95℃持续15秒，55℃持续1分钟进行45个循环。每个样本分析2次。使用每个样本重复分析的平均值进行进一步的浓度计算。浓度以拷贝数/ml表示并使用下列公式计算C＝Q×VDNA/VPCR×1/Vext，其中C＝血浆靶序列浓度(拷贝数/ml)；Q＝PCR反应中通过序列检测仪分析的靶序列量(拷贝数)；VDNA＝提取的DNA总量，每次Qiagen提取通常为50μl；VPCR＝PCR反应中使用的DNA溶液量，通常为5μl；Vext＝血浆的提取量，通常为600-800μl。
使用Sigma Stat 2.03 software(SPSS)软件进行统计学分析。为确定实时定量PCR的动力学范围，通过线粒体DNA TaqMan系统对相当于每个反应100,000个拷贝到1个拷贝的线粒体DNA浓度的克隆质粒DNA的系列稀释组进行了分析。该分析在5个顺序量级范围内成线性(图10)，其敏感性可以进行1个拷贝的线粒体DNA检测。
研究了外伤患者血浆中线粒体DNA的颗粒相关特性。对来自37例外伤患者血浆样本的未过滤的及0.22μm滤膜过滤的配对的线粒体MRNA浓度进行了分析。图11中的数据显示，颗粒相关线粒体DNA同样存在于外伤患者的血浆中。通过0.22μm滤膜过滤可使血浆中线粒体DNA浓度以266.7倍(四分位区间范围75.0倍～558.4倍)的中位值降低。我们还发现过滤或未过滤处理后外伤患者血浆线粒体DNA浓度显著高于对照个体的浓度(Mann-Whitney排列总和检验，对于过滤样本和未过滤样本，P＜0.05)。当与对准组比较时，过滤或未过滤处理外伤患者血浆的线粒体DNA浓度分别以6.3倍和5.3倍的中值水平增加。我们的数据表明，当与健康对照组比较时，外伤患者血浆过滤或未过滤处理的线粒体DNA均明显升高。这种升高可能是由于外伤后，损伤细胞释放颗粒相关和非颗粒相关线粒体DNA进入循环系统所致。
对分别从重度损伤(27例)、中度损伤(18例)与轻度损伤(42例)外伤患者中获得的未过滤血浆样本，以及分别从重度损伤(19例)、中度损伤(12例)与轻度损伤(24例)外伤患者中获得的通过0.22μm滤膜过滤的血浆样本进行线粒体DNA浓度的分析。无论是未过滤的还是过滤的血浆样本，在正常对照组与不同损伤程度的外伤患者中，线粒体DNA浓度均具有显著性差异(Kruskal-Wallis检验，P＜0.001)(图12)。对于未过滤的血浆样本，当与正常对照组比较时，轻度、中度及重度损伤组的线粒体DNA浓度的中位值分别以9.9倍、6.4倍、6.4及11.4倍的水平增加(图12A)。对于过滤的血浆样本，当与正常对照组比较时，轻度、中度及重度损伤组的线粒体DNA浓度的中位值分别以2.5倍、6.4倍及9.9倍的水平增加(图12B)。
权利要求
1.一种评价患者的疾病状态的方法，所述患者怀疑患有或已知患有上述疾病，所述方法包括(i)从所述怀疑患有或已知患有疾病状态的患者中获得血液样本，(ii)从所述血液样本中分离血浆或血清，(iii)将所述血浆或血清分成包括颗粒相关核酸和非颗粒相关核酸不同相对浓度的两个或更多的组分，及(iv)通过检测该一个或更多所述组分中核酸的含量、浓度或特性，并将一个或更多组分中核酸的含量、浓度或特性与对照组比较来评价所述疾病状态。
2.如权利要求一所述的方法，其中所述的核酸是mRNA。
3.如权利要求两所述的方法，其中所述的mRNA是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述的mRNA是血小板碱性蛋白mRNA。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述的mRNA是人胎盘催乳素mRNA。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述的mRNA是人绒毛膜促性腺激素β亚基mRNA。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述的核酸是DNA。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述的DNA是线粒体DNA。
9.如上述任一权利要求所述的方法，还包括扩增所述的核酸的步骤。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述的核酸通过PCR或反转录PCR扩增。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述的核酸通过实时PCR或实时反转录PCR扩增。
12.上述任一权利要求所述的方法，其中所述的组分通过过滤分离。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述的滤膜的孔径大小约为5μm或更小。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述的滤膜的孔径大小约为0.22μm。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述的滤膜的孔径大小约为0.45μm。
16.如权利要求1～11中任一权利要求所述的方法，其中所述的组分通过离心分离。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述的离心是超速离心。
18.如上述任一权利要求所述的方法，其中所述的疾病状态选自癌症、中风及外伤。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述的癌症为肝细胞癌或鼻咽癌。
20.如上述任一权利要求所述的方法，其中所述的患者是孕妇，所述的评价患者或其胎儿的疾病或生理状态的方法能够辅助所述患者或其胎儿的检测、监测、预后判断或治疗。
21.一种评价患者的疾病状态的方法，所述的患者怀疑患有、已知患有或有风险患有肝细胞癌或鼻咽癌，所述的方法包括(i)从所述怀疑患有或已知患有肝细胞癌或鼻咽癌患者中获得血浆或血清样本，及(ii)检测所述样本中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)核酸含量。
22.一种评价患者的疾病状态的方法，所述患者怀疑患有或已知患有外伤，所述方法包括(i)从所述怀疑患有或已知患有外伤患者中获得血浆或血清样本，及(ii)检测所述样本中线粒体核酸含量或浓度。
全文摘要
本发明涉及用于评价疾病状态的存在于血浆和血清中的非颗粒相关和颗粒相关核酸。
文档编号G01N33/48GK1653192SQ03810951
公开日2005年8月10日 申请日期2003年5月14日 优先权日2002年5月14日
发明者卢煜明, 吴启安, 徐宝贤, 赵慧君, 陈婉珊, 谭伟恩, 林毓兰 申请人:香港中文大学