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专利名称：一种葡聚糖凝胶层析法测定硫酸长春新碱脂质体包封率的方法
技术领域：
本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种硫酸长春新碱脂质体包封率测定方法，特别是涉及一种葡聚糖凝胶层析法测定硫酸长春新碱脂质体包封率的方法。
背景技术：
长春新碱(Vincristine)是长春花碱类抗肿瘤药物,主要用于治疗急性淋巴细胞白血病、何杰金氏病、恶性淋巴肿瘤等疾病。目前临床用药为硫酸长春新碱注射液，其抗肿瘤作用良好，但由于严重的神经毒性和组织刺激性等不良反应，使其临床应用受到限制。脂质体作为一种理想的药物载体，具有生物相容性、靶向性、缓释性、降低药物毒性等特点。大量研究表明，将硫酸长春新碱制备成脂质体，可以提高其治疗指数，降低或减少药物的不良反应。包封率是评价脂质体质量的重要指标。赵妍等人(赵妍等，主动载药法制备硫酸长春新碱脂质体及其包封率的测定[J]，中国药学杂志，2005，40 (20):1559 1562)报道了采用PH梯度法制备硫酸长春新碱脂质体，以阳离子交换树脂分离脂质体和游离药物，用RP-HPLC法测定脂质体的包封率，作者同时指出葡聚糖凝胶G-50微型柱法无法完全分离脂质体和游离药物。本发明人研究发现葡聚糖凝胶G-50层析柱法也存在脂质体与游离药物分离度差的问题，详细数据见对比实施例1 3。本发明的目的就是解决葡聚糖凝胶G-50层析柱法测定硫酸长春新碱包封率时存在的脂质体与游离药物分离度差的问题。

发明内容
本发明目的是提出一种葡聚糖凝胶层析法测定硫酸长春新碱脂质体包封率的方法，解决葡聚糖凝胶G-50层析柱法测定硫酸长春新碱包封率时存在的脂质体与游离药物分离度差的问题。发明人通过试验研究发现，葡聚糖凝胶G-50的产地和凝胶球的粒径对脂质体和游离药物的分离度影响很大，粒径太大或太小都不利于分离。发明人通过试验考察与方法验证，产生了本发明的技术方案，具体方案如下:—种葡聚糖凝胶层析法测定硫酸长春新碱脂质体包封率的方法，包括如下步骤:(I)取适量葡聚糖凝胶G-50，加适量去离子水室温溶胀至少24小时。待充分溶胀后，大量去离子水洗涤，直至上层液澄清为止。将溶胀的葡聚糖凝胶G-50装入内径为I厘米，长度为30厘米的层析柱中，填装柱高20厘米。(2)取硫酸长春新碱脂质体适量上样于葡聚糖凝胶层析柱顶端，以去离子水为洗脱介质进行洗脱，收集脂质体部分，加适量10%的Triton-XlOO溶液破膜，用水定量稀释，以HPLC法测定脂质体部分含硫酸长春新碱的量。(3)取硫酸长春新碱脂质体适量，直接加适量10%的Triton-XlOO溶液破膜，用水定量稀释，以HPLC法测定脂质体含硫酸长春新碱的总量。(4)脂质体部分含硫酸长春新碱的量与脂质体含硫酸长春新碱的总量的比值即为硫酸长春新碱脂质体的包封率。所述的葡聚糖凝胶G-50为Pharmacia生产,其湿胶球的粒径规格为Medium,范围在100 300微米。所述的HPLC法可以是本发明具体实施方式
中的分析方法，也可以其他文献中公开的方法。本发明解决了葡聚糖凝胶G-50层析柱分离脂质体和游离药物分离度差的问题。本发明的硫酸长春新碱包封率测定方法可使脂质体和游离药物分离完全，且游离药物洗脱完全，洗脱速度快，节省分析时间。该方法准确度高，重复性好，可用于硫酸长春新碱脂质体的处方工艺研究和质量控制。


图1为实施例1载药脂质体的洗脱曲线；图2为对比实施例1载药脂质体的洗脱曲线；图3为对比实施例2载药脂质体的洗脱曲线；图4为对比实施例3载药脂质体的洗脱曲线。
具体实施例方式下面的实施例将对本发明作更具体的解释，但本发明并不仅仅局限于这些实施例，同样这些实施例也不以任何方式限制本发明。采用高效液相色谱测定硫酸长春新碱的含量，色谱条件如下:色谱柱:DiamonsilC18(200mmX4.6mmX5 μ m);流动相:甲醇-水-三乙胺(体积比70: 30: 0.5，用磷酸调pH值7.0);紫外检测波长:297nm;柱温:40°C ;流速:1.2mL.mirf1 ;进样量:20 μ L。实施例1取Pharmacia生产的规格为medium 100-300 μ m的葡聚糖凝胶Sephadex G-50适量，加适量去离子水室温溶胀至少24小时。待充分溶胀后，大量去离子水洗涤，直至上层液澄清为止。将Sephadex G-50装入层析柱(1.0cmX 30cm)中，填装柱高20cm。取硫酸长春新碱脂质体溶液0.5mL，滴加于凝胶层析柱上，以水为介质进行洗脱，流速0.5mL.min—1，每2mL收集一份流出液，分别置IOmL量瓶中，共收集15份。向上述IOmL量瓶中，加水适量，混匀后加入适量Triton-XlOO，振摇破乳，去离子水定容至刻度。照上述色谱条件操作，记录每份流出液的主峰面积，以峰面积对洗脱体积作图，即得载药脂质体的洗脱曲线，见图1。图谱显示，脂质体部分和游离药物部分分离良好，游离药物洗脱快速，完全。对比实施例1取Pharmacia生产的规格为coarse 200-610 μ m的葡聚糖凝胶Sephadex G-50适量，加适量去离子水室温溶胀至少24小时。待充分溶胀后，大量去离子水洗涤，直至上层液澄清为止。将Sephadex G-50装入层析柱(1.0cmX 30cm)中，填装柱高20cm。取硫酸长春新碱脂质体溶液0.5mL，滴加于凝胶层析柱上，以水为介质进行洗脱，流速0.5mL.min—1，每2mL收集一份流出液，分别置IOmL量瓶中，共收集15份。向上述IOmL量瓶中，加水适量，混匀后加入适量Triton-XlOO，振摇破乳，去离子水定容至刻度。照上述色谱条件操作，记录每份流出液的主峰面积，以峰面积对洗脱体积作图，即得载药脂质体的洗脱曲线，见图2。图谱显示，脂质体部分和游离药物部分不能完全分离。对比实施例2取Pharmacia生产的规格为fine 40-160 μ m的葡聚糖凝胶Sephadex G-50适量，加适量去离子水室温溶胀至少24小时。待充分溶胀后，大量去离子水洗涤，直至上层液澄清为止。将Sephadex G-50装入层析柱(1.0cmX 30cm)中，填装柱高20cm。取硫酸长春新碱脂质体溶液0.5mL，滴加于凝胶层析柱上，以水为介质进行洗脱，流速0.5mL每2mL收集一份流出液，分别置IOmL量瓶中，共收集15份。向上述IOmL量瓶中，加水适量，混匀后加入适量Triton-X 100，振摇破乳，去离子水定容至刻度。照上述色谱条件操作，记录每份流出液的主峰面积，以峰面积对洗脱体积作图，即得载药脂质体的洗脱曲线，见图3。图谱显示，脂质体部分和游离药物部分不能完全分离。对比实施例3取北京凌峰源生物科技有限公司生产的，粒径规格为50-150 μ m的葡聚糖凝胶Sephadex G_50适量,加适量去尚子水室温溶胀至少24小时。待充分溶胀后，大量去尚子水洗涤，直至上层液澄清为止。将S印hadex G-50装入层析柱(1.0CmX30Cm)中，填装柱高20cm。取硫酸长春新碱脂质体溶液0.5mL，滴加于凝胶层析柱上，以水为介质进行洗脱，流速
0.5mL.mirT1，每2mL收集一份流出液，分别置IOmL量瓶中，共收集15份。向上述IOmL量瓶中，加水适量，混匀后加入适量Triton-X 100，振摇破乳，去离子水定容至刻度。照上述色谱条件操作，记录每份流出液的主峰面积，以峰面积对洗脱体积作图，即得载药脂质体的洗脱曲线，见图4。图谱显示，脂质体部分和游离药物部分不能完全分离，游离药物不容易洗脱完全。`实施例2采用浊度法考察实施例1中制备的葡聚糖凝胶柱对空白脂质体的吸附情况。将空白脂质体稀释至浓度为2.5,5.0、10.0mg-mr1.取0.5mL上述3种空白脂质体各两份，一份用水于25mL量瓶中直接定容；另一份加于葡聚糖凝胶柱顶端，用水洗脱并收集0-13mL洗脱液于25mL量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。用紫外分光光度计在450nm下测定脂质体浊度，平行操作3次。结果见表I。由表可知，葡聚糖凝胶层析柱对空白脂质体基本无吸附，回收率在97%以上，符合方法学要求。表I实施例1中制备的葡聚糖凝胶柱对空白脂质体的回收(η = 3)
权利要求
1.一种葡聚糖凝胶层析法测定硫酸长春新碱脂质体包封率的方法，包括如下步骤: (1)取适量葡聚糖凝胶G-50，加适量去离子水室温溶胀至少24小时，待充分溶胀后，用大量去离子水洗涤至上层液澄清，将溶胀的葡聚糖凝胶G-50装入层析柱； (2)取硫酸长春新碱脂质体适量上样于葡聚糖凝胶层析柱顶端，以去离子水为洗脱介质进行洗脱，收集脂质体部分，加适量10%的Triton-X 100溶液破膜，用水定量稀释，以HPLC法测定脂质体部分含硫酸长春新碱的量； (3)取硫酸长春新碱脂质体适量，直接加适量10%的Triton-X100溶液破膜，用水定量稀释，以HPLC法测定脂质体含硫酸长春新碱的总量； (4)脂质体部分含硫酸长春新碱的量与脂质体含硫酸长春新碱的总量的比值即为硫酸长春新碱脂质体的包封率。
2.根据权利要求1所述的一种葡聚糖凝胶层析法测定硫酸长春新碱脂质体包封率的方法，其特征在于所述的葡聚糖凝胶G-50为Pharmacia生产，其湿胶球的粒径规格为Medium,范围在100 300微米。
3.根据权利要求1或2所述的葡聚糖凝胶层析法测定硫酸长春新碱脂质体包封率的方法，其特征在于，所述的HPLC法的色谱条件如下:色谱柱:为 Diamonsil C18(200mmX4.6mmX 5 μ m)； 流动相:甲醇:水:三乙胺体积比为70: 30: 0.5 ; 检测器:紫外检测器。
4.根据权利要求3所述的葡聚糖凝胶层析法测定硫酸长春新碱脂质体包封率的方法，其特征在于，所述紫外检测器检测波长为297nm。
5.根据权利要求3所述的葡聚糖凝胶层析法测定硫酸长春新碱脂质体包封率的方法，其特征在于，所述流动相pH值为7.0。
全文摘要
本发明涉及一种葡聚糖凝胶层析法测定硫酸长春新碱脂质体包封率的方法，该方法采用特定的葡聚糖凝胶G-50，可解决葡聚糖凝胶层析法测定包封率时存在的脂质体与游离药物分离度差的问题。该方法准确度高，重复性好，可用于硫酸长春新碱脂质体的处方工艺研究和质量控制。
文档编号G01N30/88GK103185761SQ20111044454
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者杨志强, 王杏林, 张俊伟, 尹东东, 宋丽明 申请人:天津药物研究院