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专利名称：检测人类免疫缺陷病毒的方法及试剂盒的制作方法
检测人类免疫缺陷病毒的方法及试剂盒所属领域本发明涉及检测临床样品中艾滋病病原体人类免疫缺陷病毒(Human Imraimodificidncy Virus, HIV) HIV I型(HIV-1)的方法及试剂盒，特别是涉及以实时定量荧光聚合酶链反应 技术早期诊断HIV-l感染的方法及所使用的试剂盒。发明背景艾滋病的全称叫获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS), 是一种由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的传染病。HIV主要型别为HIV-1和HIV-2，艾滋病 大多由HIV-1引起。HIV感染人体后特异性地侵犯并损耗T淋巴细胞造成肌体细胞免疫损伤。 HIV感染的初期，感染者可以是无症状的病毒携带状态。但感染发展到一定程度，感染者的 免疫系统受到相当程度的损害时，病人将出现持续性全身淋巴结肿大综合征(PGL)和艾滋病 相关综合征(ARC),最后并发各种严重机会性感染和恶性肿瘤，成为艾滋病。目前无特效治 疗，病死率极高。自1981年在美国洛杉矶首次发现艾滋病病例后，艾滋病正在全世界迅速流行。据世界卫 生组织2004年12月报告提供的数据，全世界感染艾滋病病毒者达3940力'，其中仅2004年 死于艾滋病的人数就达到310力。现在艾滋病流行正以每天8500个新感染者的速度发展。尤 其是占亚洲人口近50%的中国、印尼和越南的艾滋病病毒感染人数急剧增长。在中国，自从1985年6月发现第--例艾滋病患者以来，艾滋病病毒己蔓延到所有31 个省、自治区和直辖市。到2004年12月底，中国累积报告HIV感染人数89067人，AIDS 病例数20786例，死亡5024人。据中国CDC及WHO预测，HIV/AIDS实际感染人数约84万 人。1999年，分子流行病学调查证实我国已有HIV-2型病毒存在，并首次从基因水平上确认 我国存在HIV-1和HIV-2的混合感染，但目前我国存在的主要是HIV-1型感染，HIV-2型感染目前只有个别病例报道。HIV感染的病毒学诊断技术一般包括病毒分离和病毒成份(如抗原、核酸)的检测。实验 室检査包括病毒分离培养、病毒核酸检测、病毒蛋白抗原检测、HIV抗体检测等方法。
从早期的病毒分离培养，到FDA批准了第 一个HIV抗体筛选试剂并用应用于献血员筛选 形成第一代的抗体检测试剂以来(1985年3月1 H)，迄今已经发展到第四代HIV抗体/抗原 试剂，窗口期从最初3个月縮短到大约两周。提高检测的敏感性，縮短窗口期是HIV抗体检 测试剂持续发展的方向。利用PCR检测病毒RNA具有早期发现、灵敏度和特异性高等优点。RT-PCR方法虽然灵敏并 能在早期对病毒进行检测，但是因其歩骤繁琐且容易造成污染，从而使其使用上受到一定限 制。实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起来的。与传统的(终 点检测)PCR技术相比，实时定量监测方法不仅实现了低拷贝数靶多核苷酸的定量分析，而且 还具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点。实时荧光PCR技术是在聚合酶链反应(PCR)体系中加入荧光标记探针，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪。通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光。收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。通过对扩增曲线以及循环阈值(Ct)的分析，即可以对检测样品进行定性和定量分析。实时荧光PCR将DM扩增与检测过程融合为--体动态检测DNA扩增的全过程，省掉了 PCR后处理过程大大縮短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便。由于实时荧光PCR采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污染和山此的造成的假阳性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种(Mackay 1M " a/. Rea卜time PCR in virology..Nucleic Acids Res. 2002 5;30(6):1292-1305; Lie, Y.S.， Petropoulos, C. J. ， Advancesin quantitative PCR technology: 5' nuclease assays. Current Opinion in Biotechnology1998. 9， 43 - 48.)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。利用新兴的荧光定量技术，能够对样本进行定量检测，对病情检测尤其是处在"窗口期" 病人的检测十分有利。研究表明，感染5天就能在外周血中检出HIV RNA，因此在现有基础 上检测HIV RNA可以实现进一歩早期诊断。HIV荧光定量检测在艾滋病辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效判定、预测疾病进程等方面均具有非常重要的作用。 然而，在目前国内外已经批准用于HIV-1的核酸检测的试剂中，尚未使用套式PCR方法。 本发明选取人类免疫缺陷病毒(HIV-1)基因组中高度保守的单拷贝基因序列为扩增耙区域， 设计特异性引物及荧光探针进行靶序列扩增，扩增片段长度达148bp。使用逆转录体系将RNA 逆转录为cDNA后，对cDNA进行套式PCR扩增。然后，利用实时荧光定量PCR技术，定量检 测血清样本中人类免疫缺陷病毒(HIV-1) RNA。临床考核结果表明，本发明的方法可用于人 类免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的辅助诊断和艾滋病病人药物治疗的疗效监控。由于临床上HIV-1的病毒载量通常较低(100 10000IU/ml)，因此本发明应用浓縮裂解 病毒和灵敏的套式PCR方法，巧妙地解决了短时间内准确定量的方法学问题。实验结果显示， 根据本发明方法生产的产品灵敏度达到100IU/ral。众所周知，在使用已知的实时荧光定量PCR技术检测和定量分析临床样品中某特定靶核酸 的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性， 一个关键 性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的引物和寡核苷酸探 针。本发明人在以往多年从事PCR技术特别是实时荧光定量PCR技术研究的基础上，将该技术 应用于H工V-l的基因组多核苷酸的检测和定量分析，成功地完成了本发明。发明的目的本发明的一个目的是提供一种使用实时荧光定量PCR技术定量检测样品中HIV病毒的方 法，该方法包括(1)提供包括样品、核酸扩增体系，和荧光监测体系在内的反应与检测混 合物，(2)通过扩增反应循环扩增所说的靶多聚核苷酸，(3)使所说的荧光发生基团与被扩 增的靶多核苷酸间接结合，(4)确定荧光发生基团所产生的荧光量，(5)根据循环反应中产 生的荧光量，结合定量标准曲线确定靶多核苷酸的存在及其相对量(即靶核酸序列的拷贝数)； 其中核酸扩增系统包括可与靶多核苷酸结合的寡核苷酸引物，并且荧光实时监测系统包括一 个可与靶多核苷酸特异性结合的寡核苷酸探针；特征在于所使用的是套式PCR，正向和反向 寡核苷酸外引物分别是5' - GTT AAG GCC (;CC TGT TGG T -3' (SEQ ID NO: l)和5' 一 TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3， (SEQ ID NO: 2)，正向和反向寡核苷酸内引物分别是5'— CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3 (SEQ ID NO: 3)，和5， -CCT GCA CTG TAC CCC (XA ATC C-3' (SEQ ID NO: 4)并且所使用的寡核苷酸探针是5' -ACAGC AGTAC AAAT(; GCAGT ATTCA TTCAC-3'(SEQ ID NO: 5)。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的样品是可疑HIV病毒感染者的临床血液样 根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的靶多核苷酸来自HIV-l病毒。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的核酸扩增系统是套式聚合酶链反应系统， 并且所说的第 一次扩增反应循环是大约重复15次的聚合酶链反应循环；第二次扩增反应循环 是大约重复35次的聚合酶链反应循环。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的核酸扩增体系包括(a)耐热DNA聚合酶、 (b) 2'-脱氧核苷三磷酸、(c)能够与双链靶多核苷酸的第 -条链结合的正向引物，和(d) 能够与双链耙多核苷酸的第二条链结合的反向引物。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的荧光实时检测体系包括能够与靶多核苷酸 结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。根据本发明的一个优选实施方案，所说的方法进一歩包括(1)确定样品中的靶多核苷 酸经扩增后所产生的荧光水平达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数；(2)将已确定 的样品中靶多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中己知量靶多核苷酸的阈循环次数相比较，以 计算出样品中靶多核苷酸的相对量。本发明的另一个目的是提供一种使用实时荧光定量PCR技术定量检测临床样品中HIV病毒 的试剂盒，该试剂盒包括(1)分别装有RNA提取液A、 RNA提取液B、逆转录酶系、逆转录酶 反应体系、经焦碳酸乙二酯处理的纯水(DEPCH20)、 PCR扩增反应液I (用于第一次PCR扩增 反应)、PC財广增反应液Il (用于第二次PC时广增反应)、稀释液、阴性对照样品、强阳性标准 品和RNA阳性对照品，以及加盖密封的多个试剂瓶或离心管。(2)分隔并集中包装这些试剂瓶 或离心管的包装盒。RNA提取液A是Si02经DEPC水处理后，高压灭菌后4'C保存并分装的市售标准试剂。RNA提 取液B山GuSCN (异硫氰酸胍)120g， 0. 1M Tris-HC1 (pH 6.4) 100ml 0. 2M， EDTA (PH8. 0) 22ml混合组成，4t保存。PCR反应液I由正向和反向寡核苷酸外引物(25pmo]/ul)各O. lul、 2mM dNTPs 5 ul 、 5XRT Buffer 4 ul组成，共18 ul混合，-20。C保存。PCR扩增反应液II 由正向和反向寡核苷酸内引物(25pmol/ul)各0.4ul、荧光探针SEQ ID NO. 3 (20Pmol/ul) 0. 5ul 、 2mM dNTPs 5 ul 、 5XRT Buffer 10 u] 、 ddH20 29. 10. 4ul组成，-20。C保存。根据本发明的再-个优选实施方案，所使用的是套式PCR，其中用于靶多核苷酸扩增 体系的正向和逆向寡核苷酸外引物分别是5' - GTT AAG GCC GCC TGT TGG T -3' (SEQ 1D NO: l)和5' - TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3' (SEQ ID NO: 2)，正向和反向寡核苷 酸内引物分别是5' - CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3(SEQ ID NO: 3)'和5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3'(SEQ ID N'O: 4)。根据本发明的再一个优选实施方案，其中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探
针是5'-ACAGC AGTAC AAATG GCA〔;T ATTCA TTCAC-3，(SEQ ID NO: 5)。


图l显示Std curve窗口下的标准曲线。针对模板数为10' l(r拷贝的反应体系进行TaciMan PCR分析。当100拷贝数为100时，检测样品得Ct值在20左右，即检测下限灵敏度可到达100拷 贝。绘制得到的标准曲线斜率为-3.01, R = -0.998168。图2显示强中弱三个阳性标本曲线。三个标本的Ct值分别是11.07, 14.11， 17.07;结合 扩增曲线为S形，均能够判定位阳性。图3显示阴性标本曲线。三个标本的扩增曲线为比较平直的折线，与荧光检测阈值线没 有交点，或者显示Ct值为30并且扩增曲线不具有S形特征。图4显示5个临床阳性标本曲线，CT值均小于:K)，扩增曲线为S形，均能够判定为阳性。发明的详细内容本发明涉及实时定量荧光PCR方法及试剂盒，特别是涉及实时定性定量荧光聚合酶链反应 方法及其试剂盒在HIV病毒感染的早期实验室诊断中的应用。本发明提供了一种使用实时荧光定量PCR技术定性定量检测临床样品中HIV病毒存在的 方法，该方法包括(1)提供包括HIV病毒基因组核酸的样品、逆转录反应体系、核酸扩增 体系，和荧光监测体系的反应与检测混合物，(2)通过逆转录反应得到PCR扩增的靶DNA序 歹ij， (3)通过扩增反应循环扩增所说的靶多核苷酸，(4)使所说的荧光发生基团与被扩增的 靶多核苷酸间接结合，(5)确定荧光发生基团所产生的荧光量，(6)分析扩增循环后产生的 荧光量以确定靶多核苷酸的存在及其相对量；其中核酸扩增体系包括可与靶多核苷酸结合的 寡核苷酸引物，并且荧光检测体系包括可与靶多核苷酸结合的寡核苷酸探针；特征在于所使 用的是套式PCR，正.向和反向寡核苷酸外引物分别是5' - GTT AAG GCC GCC TGT TGG T -3' (SEQ ID NO: l)和5' — TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3' (SEQ ID NO: 2)，正向和反 向寡核苷酸内引物分别是5' - CAA TCC CCA AA(; TCA AG(; AGT-3(SEQ ID NO: 3)'和 5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3' (SEQ ID NO: 4)并且所使用的寡核苷酸探针是5' -ACAGC AGTAC AAATG GCAGT ATTCA TTCAC-3'(SEQ ID NO: 5)。与基于扩增反应完成后进行单一终点检测的传统PCR方法不同，实时定量聚合酶链反应方 法可以在扩增反应的进程中随时监测扩增产物的产生，从而大大提高了定量检测的准确性和 精密度。如众所周知，实时荧光定量PCR是在PCR扩增中，同时加入引物和5' 、 3'末端分别 标记有荧光报告基团(例如6-F層amidite羧基荧光素6)和荧光淬灭基团(例如6-羧基四甲基若丹明)的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补结合，其序列保持完整，报告基团发射的荧光信号将被淬灭基团吸收，所以没有荧光信号产生；而当PCR扩增反应进行时，DNA聚合酶的5' -3'外切酶活性将降解荧光探针，导致荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，因而荧光监测系统可接收并记求到荧光信号。每扩增一条DNA链即有 一个荧光分子产生，从而实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同歩，实时地监测整个PCR反应进程，并可借助标准曲线对未知靶多核苷酸(模板)进行定量分析。与通常的实时定量荧光PCR技术相似，本发明的检测样品中HIV病毒基因组双链靶多核苷酸存在的方法中同样包括(1)提供包括(a)待检样品，(b)耐热DNA聚合酶和(c) 2-脱氧核苷三磷酸(dNTP)的扩增反应体系，以及包括(a)能够与待检双链靶多核苷酸的第--条互补链结合的正向引物，(b)能够与待检双链耙多核苷酸的第二条互补链结合的反向引物，以及(c)能够与双链靶多核苷酸的任一条链结合并且两末端分别标记有荧光发生基团和荧光淬火基团的寡核苷酸探针的荧光检测体系；(2)通过一次或多次聚合酶链反应扩增所说的靶多核苷酸；(3)退火后使所说的荧光发生基团通过探针与靶多核苷酸结合并产生荧光信号；(4)检测并确定荧光发生基团所产生的荧光量；(5)分析一次或多次扩增循环所发出的荧光量，以检测耙多核苷酸的存在；特征在于其中所说的靶多核苷酸是HIV病毒基因组多核苷酸，所使用的PCR技术是套式PCR技术，TF.向和反向寡核苷酸外引物分别是5' - GTT AAG GCC GCCTGT TGG T -3'(SEQ ID NO: l)和5' - TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3'(SEQ ID NO:2)，正向和反向寡核苷酸内引物分别是5' -CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3(SEQIDNO: 3)，和5' -(XT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3'(SEQ ID NO: 4)并且所使用的寡核苷酸探针是5，-ACAGC AGTAC AAATG GCAGT ATTCA TTCAC-3'(SEQ ID NO: 5)。如前所述，为了检测出临床样品中可能存在的所有HIV病毒株，并能够准确有效地将HIV 病毒感染与人乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒、乙型肝炎黄 病毒、以及甲型肝炎病毒等其他常见相关病毒等感染鉴别开来，设计并制备实现这些目的的 寡核苷酸引物和探针是一个非常重要的技术环节。为此，我们在使用适当的核酸分析软件对 己知的HIV—1病毒的基因组核苷酸序列进行分析，进一歩使用适当的引物设计软件(例如 Primer Express 2)选择并设计具有下示核苷酸序列的寡核苷酸引物l: 5' - GTT AAG GCC GCC TGT TGG T -3' (SEQ ID NO: 1)、引物2: 5' - TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3， (SEQ ID NO: 2)，引物3: 5' - CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3(SEQ ID NO: 3)'， 引物 4: 5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3' (SEQ ID NO: 4);以及具有下示序列的寡核 苷酸探针5'-ACAGC AGTAC AAATG GCAGT ATTCA TTCAC-3'(SEQ ID NO: 5)。
其中引物1位于来自加拿大的HIV-1病毒株CANB6FULL (基因存取号为AY779556)的 3885-3903位，包括19个碱基；引物2位于4091-4112位，含22个碱基;引物3位于3938-3958 位，含21个碱基；引物4位于4079-4100位，含22个碱基；荧光探针FPHIV位于4029-4058 位，含30个碱基，扩增区段均位于HIV基因的POL蛋白的编码区。外引物所对应的扩增区段长度为228bp。内引物所对应的扩增区段长度为163bp。可使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速液相层析法(FPLC)纯化后 进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5'端标记作为荧光发生基团 (报道基团)的6-FAM amidite，并在其3'端标记借助活性连接臂偶联的作为荧光淬灭或抑 制基团的TAMRA。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后，使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝 胶(20%)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。使用常规RNA提取方法或市售的RNA提取试剂盒，从得自受试者的早期血清样品中提取 RNA，然后使用逆转录反应体系(在每微升由250mMTris-HCL(pH8. 0)、 250mMKCL、 20mM MgCU 和50 mM DTT组成的缓冲液中含有50单位mMLV酶和l单位RNA酶)将所提取的RNA转化成。DNA， 并将此逆转录产物用于继后的PC財广增。在含有引物1和2 (各20pmo1)、 DNA模板(PCR扩增靶序列)、dNTP (lOrnM)、耐热DNA聚合 酶(Plantini, DNA聚合酶)、PCR缓冲液和水的反应体系中，使用ABI 7000型或其他结构类 型的自动荧光检测热循环仪上对如上得到的(DNA序列进行第一次PCR扩增。所使用的反应条 件是50°C—5分钟；93'C预变性3分钟；93°C 30秒一55°C 30秒一72°C 30秒，共进行15个循 环。在含有引物3和4 (各20 pmol)、核酸探针、DNA模板(PCR扩增靶序列)、dNTP (10mM)、 耐热DNA聚合酶(Plantinium DNA聚合酶)、PCR缓冲液和水的反应体系中，使用ABI 7000型 或其他结构类型的自动荧光检测热循环仪上对如上得到的t.DNA序列进行第二次PCR扩增。使 用PE GeneAmp 5700 (AB1 Prism 7300、 ABI Prism 7000、 DA—7600、 Line Gene、 iCycler 参照此方法)所使用的反应条件是93'C预变性2分钟后，9、TC 45秒，55°C l分钟，进行IO 次循环；然后93。C 30秒，55°C 45秒，进行30个循环。使用Light Cycler所使用的反应条件 是93t 2分钟；93°C 5秒57°C 45秒，共40个循环；最后置37。C下保温1秒。1. 阴性结果判定如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为空白，则实验结果判为样品的HIV RNA含量小于检测极限。2. 阳性结果判定如果增长曲线呈S型曲线且CT值〈40，则实验结果按以下方法判断 反应完成后，借助装置上配置的自动分析系统分析结果。在本研究中，对PEGeneAmp 5700(ABI Prism 7300、 ABI Prism 7000、 DA—7600、 Line Gene、 iCycler参照此方法)而由、
如果增长曲线不呈S型或循环阈(Ct)值等于30，结果即为阴性；如果增长曲线呈S型且Ct值 小于30，结果则为阳性。对Light Cycle而言，如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为空白，结 果即为阴性；如果增长曲线呈S型曲线且CT值小于40，结果则为阳性。其中以反应的前15个循 环所产生的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置为3-15个循环的荧光信号的标 准偏差的10倍。 一般说来，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数呈线性关系。起始 拷贝数越多，Ct值越小。因为在扩增反应的Ct值之前的阶段，扩增系统中的酶、引物、探针 和dNTPs均大大过量，而且系统的p值和离子浓度等也相对稳定，所以此时扩增反应的效率是 一个与模板数无关的饱和定值。与Ct值相关的只有起始模板数(多聚核苷酸样品的拷贝数) 和与样品无关的PCR系统效率。可利用已知起始拷贝数的标准品制作标准曲线，其中以靶多核苷酸起始拷贝数的对数为 横坐标，并以如上测得的Ct值为纵坐标。获得未知量靶多核苷酸的Ct值后，即可从基于平行 实验得到的数据制作的标准曲线上得知其起始拷贝数的对数，然后计算出该靶多核苷酸的起 始拷贝数(当扩增循环达到Ct值即初始进入指数扩增期时，Ct值的重现性极好，即同一靶多 核苷酸在不同时间扩增或同一时间在不同管内扩增所得到的Ct值总是恒定的)。也就是说，为 了基于上述的扩增反应结果推算出靶多核苷酸的量(起始拷贝数)，本发明的方法还进一歩包 括(1)确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的 阈循环次数；(2)将已确定的样品中靶多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量靶多核苷酸的阈循环次数相比较，从而计算出样品中靶多核苷酸的量。本发明的另一个目的是提供一种使用实时荧光定量PCR技术定量检测临床样品中HIV病毒的试剂盒，该试剂盒包括(1)分别装有RNA提取液A、 RNA提取液B、 HIV-l逆转录酶反应液、逆转录酶系、经焦碳酸乙二酯处理的纯水(DEPC H20)、由己知常规成分组成的PCR扩增反应液I (第一次PCR反应液)和II (第二次PCR反应液)、阴性质控品、HIV临界阳性质控品)HIV强阳性质控品和HIV阳性定量参考品，以及加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。根据本发明的再一个优选实施方案，其中用于靶多核苷酸扩增体系的if.向和逆向外引物分别是5' - GTT AAG GCC GCC TGT T(;G T -3' (SEQ ID NO: l)和5， — TAC TAT TCT TTC CCCTGCACTG-3' (SEQIDN0: 2)， if.向和反向寡核苷酸内引物分别是5' - CAA TCC CCA AAGTCA AGG AGT-3(SEQ ID NO: 3)'禾P 5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3'(SEQ ID NO:4)根据本发明的再一个优选实施方案，其中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸是 5'-aCAGC AGTAC AAATG GCAGT ATTCA TTCAC-3'(SEQ ID NO: 5)。
如甜所述，为了检测出临床样品中可能存在的所有HIV病毒变异体，并能够准确有效地将 HIV病毒感染与人乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒、乙型肝炎 黄病毒、以及甲型肝炎病毒等其他常见相关病毒等感染鉴别开来，本发明基于HIV-l和相关病 毒基因组核苷酸序列的同源性比较，特别设计了适用本发明检测试剂盒的寡核苷酸引物和探 针。使用这些引物和探针完成的实时定量检测，大大减小了HIV病毒多核苷酸检测的假阳性和假阴性。我们的实验证明，本发明检测Hiv病毒基因组核苷酸的精确度几乎为iooy。，灵敏度达到100个拷贝/mJ。值得特别说明的是，为了确保本发明的HIV病毒检测方法的准确性，我们使用了根据已知 的HIV病毒RNA序列合成的单链DNA作为阳性标准品。并且，还使用携带有HIV病毒核苷酸(,.DNA) 序列的重组质粒作为DNA定量检测标准品。借助这些额外标准品制作所谓的外标定量标准曲 线，以进一歩提高本发明试剂盒的检测精确度和准确性。实施例实施例l: HIV检测试剂盒及其使用(1) 制备包括下列组成成分的试剂盒RNA提取液A (100 ul /管)l管、RNA提取液B (4000 ul /管)l管、H1V-l逆转录反应液(180ri/管)l管、逆转录酶系(20 ul /管)1管、第一次PCR反应管(l人份/管)若干、第二次PCR反应管(l人份/管)若干、DEPCH20 (2000 lU/管)l管、强阳性标准品(1000 ul /管)l管、临界阳性标准品(1000ul/管)l管、阴 性对照(1000 "l/管)l管、HIV阳性定量参考品(1X咖/ml， ,1/管)l管、H1V阳性定 量参考品(lXL0'IU/ml，醇l/管)l管、HIV阳性定量参考品axiO'IU/ml， 10W/管)l狩、 HIV阳性定量参考品(lX105IU/ml， 10W/管)l管。(2) 标本采集、运送和保存无菌操作取疑似艾滋病人发病早期的血清标本，然后将血 清通过漏斗样纸杯收集到无菌塑料试管中并置于低温冰箱(一7(TC或一2(TC)中冷冻保存。 如集中检验，标本需在(TC以下环境中运送并于24小时内送达实验室。(3) 检测歩骤和结果分析向新的经高压灭菌处理过的O. 5ml离心管中加入10u 1充分混匀的RNA提取液A(RNA提取液 A易沉淀，取样前需用移液器反复吸打混匀后吸取)。再加入100u l血清标本或阴性或临界、 强阳性质控品，然后加入200w l的RNA提取液B并充分混匀。室温放置5分钟后，8000转/分(rpm) 离心1分钟，小心吸去上清；再次加200W RNA提取液B，充分混匀(用移液器吹打)，8，000rpm 离心1分钟，小心吸去上清；并用75%的预冷乙醇(用DEPC水配制)洗沉淀两次(取75%乙醇4()0ul洗沉淀，充分震荡混匀，8000转/分(rpm)离心l分钟后去上清后再用75。/。乙醇400ii l洗-次)，65。C干燥并沉淀10分钟。其中，配制75%乙醇时须使用试剂盒中提供的焦碳酸二乙酯处 理的纯水(DEPC H20)。然后，在沉淀管加入18yl逆转录反应液以及逆转录酶系2u ]，震荡混匀，瞬时(3秒) 离心后37'C放置45分钟，95'C加热3分钟。8000rpm离心l分钟后，吸取5 y l逆转录产物加入第 -次PCR反应管中进行第一次PCR反应。将HIV阳性定量参考品8000rpm离心数秒，备用。然后分别取PC財广增一的扩增产物5nl (标本或阴性或临界、强阳性质控品)或阳性定量 参考品5w 1加入第二次PCR反应管中，进行第二次PCR扩增。PCR循环条件是95"预变性2 分钟后，94°C 45秒，55°C l分钟，进行10次循环；然后93。C 30秒，55°C 45秒，进行30 个循环(使用ABI Prism 7000)。反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节分析参数使标准曲线(Std curve ) 窗口下的标准曲线图达到最佳(即相关性数值<-0.95)(参见图4)。由图2和图3可分别看出， 阳性标本的荧光曲线与设定的阈值线有一交点，而阴性标本的荧光曲线则低于阈值。最后由 仪器自动分析装置计算出的未知标本的测定数值(Qty)，即标本中H1V病毒的RNA含量，为2. 07 X 10'IU/ml。实施例2:使用本发明的试剂盒检测150例临床血清样品的结果及分析委托山西山西省疾病预防控制中心考核了300个临床标本。以Genelabs公司出品的免疫印迹试剂——H1V Blot检测试剂盒为参考，以罗氏(ROCHE)公司出品的The AMPLICOR H]V-1MONITOR⑧Test (vl.5)试剂复核。考核结果表明阳性病例(达安PCR为阳性)共103个，数值分布为l. 86X10' — 4.61X105IU/ml。其中102个Western Blot结果均为阳性，符合，结果一致；l个Western Blot结果为阴性，结果不 一致。阴性病例(达安PCR为阴性)共197个，其中 178个Western Blot结果为阴性，结果一致；19个Western B]ot结果为阳性，结果不一致。总符合率93. 3%。以罗氏(R0CHE)公司出品的The AMPLICOR 1UV-1 MONITOR Test (vl.5)试剂复核，PCR结果与复核结果一致的判断为真阴(阳)性，PCR结果与复核结果不--致的判断为假阴(阳)性。标本复核结果为20个不一致的标本中，真阴性18个，假阳性1个，假阴性1个。因此本次考核假阳性有l个，假阴性1个，真阳性102个，真阴性196个。根据灵敏度计算公式以Genelabs公司出品的免疫印迹试剂——HIV Blot检测试剂盒为参考，以罗氏(ROCHE)公司出品的The AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test (vl.5)试剂复核，本发明的试剂盒准确度为99. 33%。而相反，以本发明的试剂盒为参考，以罗氏(ROCHE)公司出品的The AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test (vl.5)试剂复核，Genelabs公司出品的免疫印迹试剂——HIV Blot检测试 剂盒准确度为94%。以罗氏(ROCHE)公司出品的The AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test (vl.5)试剂复核，本 发明的试剂盒准确度高于HIV Blot检测试剂盒。 序列表<110〉中山大学安达基因股份有限公司<120>检测HIV的方法及试剂盒<140>〈141〉<160>5〈210〉 1 <211> 19 <212> DNA 〈213〉人工序列 〈220〉〈223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400〉 1gttaaggccg cct.gt:tggt〈210> 2 <211>22 〈212> DNA <213〉人工序列 <220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400〉 2tactattctt tcccctgcac tg<210> 3 〈211>21 〈212〉 DNA 〈213>人工序列 〈220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 3caatccccaa agtcaaggag t〈210〉 4<211>22 ' <212> DNA <213〉人工序列 《220〉<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400〉 4cctgceictgt accccccaat cc<210〉 5 <211>30 〈212> DNA 〈213〉人工序列 <220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 <400>5acagcagtac aaatggcagt attcattcac
权利要求
1、 一种使用实时荧光定量聚合酶链反应技术定量检测样品中HIV-1病毒存在的方法，该方法包括(1)提供包括样品、包括耐热DNA聚合酶、2，-脱氧核苷三磷酸、能够与双链靶多 核苷酸的第一条链结合的TH向引物和能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物的核 酸扩增体系，以及荧光监测体系的反应与检测混合物，(2)通过扩增反应循环扩增所说的耙 多核苷酸，(3)使所说的荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸间接结合，(4)确定荧光发生 基团所产生的荧光量，(5)分析扩增循环后产生的荧光量以确定靶多核苷酸的存在及其相对 量；其中核酸扩增系统包括可与靶多核苷酸结合的寡核苷酸引物，并且荧光监测系统包括可 与耙多核苷酸结合的寡核苷酸探针；特征在于所使用的是套式PCR，核酸扩增体系中TH向和反 向寡核苷酸外引物分别是5， — GTT AAG GCC GCC TGT TGG T -3' (SEQ ID NO: 1)和5' — TAC TATTCTTTCCCCTGCACTG-3' (SEQ ID N0: 2)，正向和反向寡核苷酸内引物分别是5' - CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3(SEQ ID NO: 3)'和5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3， (SEQ ID NO: 4)并且其荧光监测体系中所使用的寡核苷酸探针是5' -ACAGC AGTAC AAATG GCAGT 八TTCA TTCAC-3， (SEQ ID NO: 5)。
2、 根据权利要求l的方法，其中所说的核酸扩增体系包括(a)耐热DNA聚合酶、(b) 2'-脱氧核苷三磷酸、(c)能够与双链靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物5' -GTT AAG GCC GCC TGT TGG T -3'，和(d)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物5' - TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3' , (e)能与扩增子双链靶多核苷酸的第一条链结合的IH向引 物5'-CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3， (f)能与扩增子双链靶多核苷酸的第二条 链结合的反向引物5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3'。
3、 根据权利要求l的方法，其中所说的荧光检测体系包括能够与靶多核苷酸结合并且两 末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针5'-ACAGC AGTAC AAATG GCAGT ATTCA TTCAC-3'。
4、 根据权利要求1的方法，其中第(5)步骤中所说的方法进一歩包括(1)确定样品 中的耙多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数；(2) 将已确定的样品中靶多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量靶多核苷酸的阈循环次数相 比较，以计算出样品中靶多核苷酸的量。
5、 根据权利要求l的方法，其中所说的靶多核苷酸来自HIV-1病毒。
6、 使用实时荧光定量聚合酶链反应技术定量检测临床样品中HIV-1病毒的试剂盒，改试 剂盒包括(1)分别装有RNA提取液A、 RNA提取液B、逆转录酶反应体系、经焦炭酸乙 二脂处理的纯水、扩增反应液I、扩增反应液II、稀释液、阴性对照样品、强阳性标准品和 RNA阳性对照品并加盖密封的多个试剂瓶或离心管，(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或离心 管的包装盒，特征在于靶多核苷酸扩增体系的正向和反向寡核苷酸外引物分别是5' -GTTAAG GCC GCC TGT TGG T -3，和5， - TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3' ， j下向和反向寡核 苷酸内引物分别是5， - CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3'和5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3'，并且其中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针是5'-ACAGC AGTAC AAATG GCAGT ATTCA TTCAC-3'。
全文摘要
本发明涉及检测临床样品中艾滋病的病原体人类免疫缺陷病毒(HIV)I型(HIV-1)存在的方法及试剂盒，特别是涉及以实时定量荧光聚合酶链反应技术早期诊断HIV-1感染的方法及所使用的试剂盒。
文档编号G01N21/00GK101144771SQ20061003759
公开日2008年3月19日 申请日期2006年9月11日 优先权日2006年9月11日
发明者何蕴韶, 周新宇, 钢 程 申请人:中山大学达安基因股份有限公司