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专利名称：多重样品中的甾族化合物的质谱法的制作方法
同位素变体较正常PTAD重6个质量单位并可用于一些实施方式。通过Cookson型试剂进行的留族化合物——包括维生素D和维生素D相关化合物——的衍生可通过任何适当的方法进行。参见，例如，Holmquist，et al.，2007年12月28日提交的美国专利申请系列号 11/946765 ；Yeung B, et al.，J Chromatogr. 1993，645(1):115-23 ；Higashi T, et al. , Steroids. 2000, 65(5):281-94 ；Higashi T, et al.,Biol PharmBull. 2001，24(7) :738-43 ；Higashi Τ, et al.，J Pharm Biomed Anal. 2002，29(5) :947-55 ；Higashi Τ, et al. , Anal. Biochanal Chem, 2008，391:229-38 和 Aronov,et al. , AnalBioanal Chem, 2008，391:1917-30。 在本文公开的方法的某些优选实施方式中，质谱法以阳离子方式进行。可选地，质谱法以阴离子方式进行。各种电离源，包括例如大气压化学电离(APCI)或电雾化电离(ESI)，可用于本发明的实施方式。在某些实施方式中，以阳离子方式利用APCI测量包括维生素D和维生素D相关化合物在内的留族化合物。 在优选实施方式中，样品中提供了一个或多个单独可检测的内标，还在样品中测定了该内标的量。在这些实施方式中，将样品中存在的所有或部分感兴趣的分析物(一 种或多种)和内标(一种或多种)离子化以产生多种在质谱仪中可检测的离子，并通过质谱法检测从每种产生的一种或多种离子。示例性的内标(一种或多种)包括维生素D2-[6，19，19]-2H3、维生素 D2-[24，24，24，25，25，25]-2H6、维生素 D3-[6，19，19]-2H3、维生素D3-[24，24，24，25，25，25]」H6、250HD2-[6, 19，19]」H3、250HD2-[24, 24，24，25，25，25]-2H6'250HD3-[6, 19，19]」H3、250HD3-[24, 24，24，25，25，25]-2H6U α，250HD2-[6, 19，19]-2H3,
Iα，2 50HD2- [24，24, 24, 25, 25, 25] -2H6, I α，2 50HD3- [6，19，19] -2H3, I α，250HD3-[24, 24，24，25，25，25]-2H6。在用Cookson型衍生试剂处理样品之前可在样品中提供一种或多种单独可检测的内标。在这些实施方式中，一种或多种内标可连同内源性留族化合物一起经历衍生，在该情况下，衍生的内标的离子通过质谱法来检测。在这些实施方式中，从感兴趣的分析物产生的离子的存在或量可与样品中感兴趣分析物的量的存在相关。在一些实施方式中，内标可以是在研究下留族化合物的同位素标记的形式。例如，在维生素D代谢物是感兴趣的分析物的测定中，250HD2- [6，19，19] -2H3或250HD3- [6，19，19] -2H3可用作内标。在250HD2-[6，19，19] -2H3用作内标的实施方式中，在质谱仪中可检测的PTAD-250HD2-[6, 19，19]-2H3 离子选自具有 573. 30±0· 50 和 301. 10±0· 50 的质荷比(m/z)的阳离子。在相关实施方式中，PTAD-250HD2-[6，19，19]-2H3先驱离子具有573. 30±0. 50的m/z，碎片离子具有301. 10±0. 50的m/z。在250HD3-[6，19，19]-2 用作内标的实施方式中，质谱仪中可检测的PTAD-250HD3-[6, 19，19]离子选自具有561. 30±0· 50和301. 10±0· 50的质荷比(m/z)的阳离子。在相关实施方式中，PTAD-250HD3-[6, 19, 19]先驱离子具有561·30±0· 50 的 m/z，碎片离子具有 301. 10±0· 50 的 m/z。如本文所用，当用质谱技术分析时，相对于未标记的分子，“同位素标记”在标记的分子中产生质量漂移。适合的标记的例子包括氘(2H)、13C和15N。例如，250HD2-[6，19，19]和250HD3-[6，19，19]具有较250HD2和250HD3高约3个质量单位的质量。同位素标记可在分子中的一个或多个位置处掺入，并且一种或多种同位素标记可用于相同同位素标记的分子。
在其它实施方式中，维生素D代谢物离子的量可通过与一种或多种外参考标准比较而测定。示例性的外参考标准包括掺入250HD2、250HD2- [6，19，19]、250HD3和250HD3-[6, 19，19]中的一种或多种的空白血浆或血清。外标通常将经历与将被分析的任何其它样品相同的处理和分析，包括在质谱法之前用一种或多种Cookson型试剂的处理。在某些优选实施方式中，250HD2的定量限值(LOQ)在I. 9ng/mL至10ng/mL范围内，包括端值；优选在I. 9ng/mL至5ng/mL范围内，包括端值；优选约I. 9ng/mL。在某些优选实施方式中，250HD3的定量限值(LOQ)在3. 3ng/mL至10ng/mL范围内，包括端值；优选在
3.3ng/mL至5ng/mL范围内，包括端值；优选约3. 3ng/mL。如本文所用，除非另外说明，单数形式“一(a)”、“一(an)”、“所述(the)”包括复数参考。因此，例如，提及“一蛋白(apiOtein)”包括多个蛋白分子。如本文所用，术语“纯化(purification)”或“纯化(purifying)”不是指从样品中 去除除了感兴趣的分析物(一种或多种)外的所有物质。相反，纯化指相对于样品中可能干扰感兴趣的分析物检测的其它组分，富集一种或多种感兴趣的分析物的量的过程。通过各种手段的样品纯化可允许一种或多种干扰物质——例如，可能或可能不干扰通过质谱法的选择的母离子或子离子检测的一种或多种物质一的相对减少。当该术语使用时，相对减少不要求将被纯化的材料中与感兴趣的分析物一起存在的任何物质通过纯化被完全去除。如本文所用，术语“固相萃取法”或“SPE”指由于溶解或悬浮于溶液(即，流动相)中的组分对溶液通过或流经的固体(即，固相)的亲和力而将化学混合物分成各组分的过程。在一些实例中，当流动相通过或流经固相时，流动相的不期望的组分可保留在固相中，导致流动相中分析物的纯化。在其它实例中，分析物可保留在固相中，允许流动相的不期望的组分通过或流经固相。在这些实例中，然后将第二流动相用于将保留的分析物从固相洗脱下来用于进一步的处理或分析。SPE—包括TFLC—可通过单一模式或混合模式机制运行。混合模式机制在同一柱中利用离子交换和疏水保留；例如，混合模式SPE柱的固相可显示强阴离子交换和疏水保留；或可显示强阳离子交换和疏水保留。如本文所用，术语“色谱法”指由于流过固定的液相或固相时化学实体的差别分布而将液体或气体携带的化学混合物分成各组分的过程。如本文所用，术语“液相色谱”或“LC”指当流体通过精细分开的物质的柱或通过毛细管通道均匀地滤过时流体溶液的一种或多种组分的选择性阻滞的过程。阻滞由当流体相对于固定相(或多个)运动时，一个或多个固定相和大量流体(即，流动相)之间的混合物的各组分分布产生。“液相色谱”的实例包括反相液相色谱法(RPLC)、高效液相色谱法(HPLC)和湍流液相色谱(TFLC)(有时被称作高湍流液相色谱(HTLC)或高通量液相色谱)。如本文所用，术语“高效液相色谱法”或“HPLC” (有时被称作“高压液相色谱”)指这样的液相色谱，其中通过在压力下迫使流动相通过固定相，通常是紧密填充的柱，而增加分离的程度。如本文所用，术语“湍流液相色谱”或“TFLC”(有时被称作高湍流液相色谱或高通量液相色谱)指一种形式的色谱，其利用通过柱填充而正被测定的物质的湍流作为进行分离的基础。在通过质谱法分析之前，TFLC已应用于制备包含两种未命名的药物的样品。参见，例如，Zimmer et al. , J Chromatogr A 854:23-35(1999);还参见，美国专利号5，968，367,5, 919，368,5, 795，469 和 5，772，874，其进一步解释 TFLC0 本领域普通技术人员了解“湍流”。当流体慢慢地并流畅地流动时，该流动被称作“层流”。例如，以低流速通过HPLC柱的流体是层状的。在层流中流体的颗粒运动是有秩序的，具有通常以直线运动的颗粒。在较快的速度下，水的惯性克服流体摩擦力并产生湍流。不与不规则边界接触的流体“超过”被摩擦减慢或被粗糙表面偏离的流体。当流体以湍流流动时，它以漩涡和涡动(或旋涡)流动，较流动是层状时具有更多的“阻力(drag)”。可获得许多参考资料用于辅助确定什么时候流体流动是层状的或瑞流(例如，Turbulent Flow Analysis !Measurementand Prediction, P. S. Bernard & J. M. Wallace, John Wiley & Sons, Inc. , (2000) ; AnIntroduction to Turbulent F low, Tean Mathieu & Julian Scott, Cambridge UniversityPress(2001))。如本文所用，术语“气相色谱”或“GC”指这样的色谱，其中将样品混合物蒸发并注射进通过包含固定相——由液体或颗粒固体组成——的柱运动的载气(如氮气或氦)流，并根据化合物对固定相的亲合力分成其各组成化合物。如本文所用，术语“大颗粒柱”或“萃取柱”指包含大于约50 μ m的平均粒径的色谱柱。如本文所用，术语“分析柱”指具有足够色谱板以引起样品中物质分离的色谱柱，该物质从柱洗脱足以允许测定分析物的存在或量。在优选实施方式中，分析柱含有直径约5μπι的颗粒。这样的柱常常区别于“萃取柱”，萃取柱具有从非保留的物质中分离或萃取保留的物质以获得纯化的样品用于进一步分析的目的。如本文所用，术语“联机(on-1 ine ) ”和“在线(ini ine ) ”，例如如“联机自动方式”或“联机萃取”中所用，指不需要操作员干预而进行的程序。相比之下，如本文所用，术语“脱机(off-line)”指需要操作员的人工干预的程序。因此，如果将样品进行沉淀，然后将上清液手动装载到自动进样器中，沉淀和装载步骤与随后的步骤是脱机的。在方法的各种实施方式中，一个或多个步骤可以以联机自动方式进行。如本文所用，术语“质谱法”或“MS”指通过化合物的质量鉴定化合物的分析技术。MS指基于离子的质荷比或“m/z”，过滤、检测和测量离子的方法。MS技术通常包括⑴电离化合物以形成带电荷的化合物；和(2)检测带电荷的化合物的分子量和计算质荷比。化合物可被电离和通过任何适合的方法检测。“质谱仪”通常包括电离源和离子检测器。一般而言，将一种或多种感兴趣的分子电离，并随后将离子引入质谱仪器，在质谱仪器中由于磁场和电场的联合，离子顺着空间中取决于质量(“m”)和电荷(“z”)的路径走。参见，例如，名称为“Mass Spectrometry From Surfaces” 的美国专利号 6，204，500 ;名称为“Methodsand Apparatus for Tandem Mass Spectrometry，，的6，107, 623 ;名称为“DNA DiagnosticsBased On Mass Spectrometry” 的 6，268，144 ;名称为 “Surface-Enhanced PhotolabileAttachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes，，的 6，124，137 ；Wright et al. , Prostate Cancer and Prostatic Diseases 1999，2:264-76 ;和Merchantand Weinberger, Electrophoresis 2000,21:1164-67。如本文所用，术语“以阴离子方式运转”指产生和检测阴离子的那些质谱法方法。如本文所用，术语“以阳离子方式运转”指产生和检测阳离子的那些质谱法方法。如本文所用，术语“电离(ionization)”或“电离(ionizing)”指产生具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。阴离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的那些离子，而阳离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的那些离子。如本文所用，术语“电子电离”或“EI ”指这样的方法，其中气相或汽相的感兴趣的分析物与电子流相互作用。电子与分析物的撞击产生分析物尚子，然后可将该分析物尚子经历质谱法技术。 如本文所用，术语“化学电离”或“Cl ”指这样的方法，其中将试剂气体(例如铵)进行电子碰撞，通过试剂气体离子和分析物分子的相互作用形成分析物离子。如本文所用，术语“快速原子轰击”或“FAB”指这样的方法，其中高能原子束(通常Xe或Ar)撞击不挥发的样品，解吸和电离样品中包含的分子。将试验样品溶解于粘稠的液体基体如甘油、硫甘油、间位硝基苄醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯辛醚、环丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。化合物或样品的合适基体的选择是经验过程。如本文所用，术语“基体辅助激光解吸电离”或“MALDI”指这样的方法，其中将不挥发的样品暴露于激光辐射，其通过各种电离途径——包括光电离、质子化作用、脱质子化
作用和簇衰变(cluster decay)-解吸和电离样品中的分析物。为了 MALDI,将样品与
吸收能量的基体混合，该基体促进分析物分子的解吸。如本文所用，术语“表面增强激光解吸电离”或“SELDI ”指另一种方法，其中将不挥发的样品暴露于激光辐射，其通过各种电离途径——包括光电离、质子化作用、脱质子化作用和簇衰变(cluster decay)——解吸和电离样品中的分析物。为了 SELDI，通常将样品结合到优先保留一种或多种感兴趣的分析物的表面。如在MALDI中，该过程还可利用吸收能量的物质以促进电离。如本文所用，术语“电雾化电离”或“ESI ”指这样的方法，其中将溶液沿着小段毛细管传送，将高的正或负的电势施加到毛细管末端。使到达管末端的溶液汽化(雾化)成溶剂蒸汽中溶液的非常小滴的射流或喷雾。该滴的雾流过蒸发室，其被轻微加热以防止凝结和使溶剂蒸发。随着滴变�。�电表面电荷密度增加直到这样的时间——同样的电荷之间的天然排斥引起离子以及中性分子释放。如本文所用，术语“大气压化学电离”或“APCI”指与ESI相似的质谱法方法；然而，通过在大气压发生在等离子体内的离子-分子相互作用，APCI产生离子。等离子体通过喷雾毛细管和对电极之间的放电来保持。然后通常利用一组差示泵出的撇乳器阶段(skimmerstages)将离子通常提取到质量分析器。干燥和预热的队气的逆流可用于提高溶剂的去除。APCI中的气相电离可较ESI更有效地用于分析极性较低的种类。如本文所用，术语“大气压光电离”或“APPI”指一种形式的质谱法，其中分子M的光电离的机制是光子吸收和电子喷射以形成分子离子M+。因为光子能量通常刚好高于电离电势，所以分子离子比较不易离解。在许多情况下，可能分析样品而无需色谱，因此节省大量时间和花费。在存在水蒸汽或质子溶剂的情况下，分子离子可吸取H以形成MH+。如果M具有高的质子亲合力，这趋于发生。这不影响定量准确度，因为M+和MH+之和是恒定的。通常将质子溶剂中的药物化合物观察为MH+，而非极性化合物如萘或睾酮通常形成M+。参见，例如，Robb et al.，Anal. Chem. 2000，72 (15) : 3653-3659。如本文所用，术语“电感耦合等离子体”或“ICP”指这样的方法，其中样品与部分电离的气体在充分高的温度相互作用以便使大部分元素原子化和电离。如本文所用，术语“场致解吸”指这样的方法，其中将不挥发的试验样品放到电离表面上，强电场用于以产生分析物离子。如本文所用，术语“解吸”指从表面去除分析物和/或分析物进入气相。激光二极管热解吸(LDTD)是这样的技术，其中包含分析物的样品通过激光脉冲热解吸到气相。激光撞击用金属基托特别制备的96孔板的背面。激光脉冲加热基托，热使样品转换成气相。然后将气相样品吸进电离源，在那里将气相样品在制备中电离，用于在质谱仪中分析。当利用LDTD时，气相样品的电离可通过本领域已知的任何合适的技术完成，如通过用电晕放电的电离(例如通过APCI)。如本文所用，术语“选择性离子监测”是质谱仪器的检测方式，其中只有相对窄的质量范围的离子——通常约一个质量单位——被检测到。如本文所用，“多反应方式”有时被称作“选择的反应监测”，是质谱仪器的检测方式，其中先驱离子和一种或多种碎片离子被选择性地检测。如本文所用，术语“定量的下限(lower limit of quantification)”、“定量的下 限(lower limit of quantitation)”或“LLOQ”指测量变得在数量上有意义的点。在该LOQ的分析物响应是可识别的、离散的和可再现的，具有小于20%的相对标准偏差(RSD%)和80%至120%的准确度。如本文所用，术语“检测限值”或“L0D”是这样的点，在该点测量值较与其相关的不确定度大。LOD是这样的点，在该点，值超过与其测量相关的不确定度并被定义为在零浓度平均值的RSD的三倍。如本文所用，体液样品中分析物的“量”通常指反映样品体积中可检测的分析物质量的绝对值。然而，量还考虑与另一个分析物量相比的相对量。例如，样品中分析物的量可以是大于通常存在于样品中的分析物的对照或正常水平的量。如本文所用，提到不包括离子质量测量的定量测量，术语“约”指加或减10%的指示值。质谱法仪器在测定给定分析物的质量时可轻微变化。术语“约”在离子的质量或离子的质荷比的上下文中指+/-0. 50原子质量单位。上面描述的发明概述是非限制的，根据以下本发明的详细描述和根据权利要求，本发明的其它特征和优势将是明显的。附图简述图 IA-D 分别显示 PTAD-250HD3、PTAD-250HD3-[6, 19，19]」H3(内标)、PTAD_250HD2和PTAD-250HD2-[6，19，19]-2H3(内标)的示例性色谱图。详情在实施例3中讨论。图2A和2B显示通过实施例3中描述的方法测定的血清样品中的250冊2和250HD3的示例性校正曲线。图3A显示变异系数对250HD2和250HD3浓度的图。图3B显示在LLOQ附近放大的相同的图。详情在实施例4中描述。图4A-B显示用于比较具有和没有PTAD衍生的250HD2的质谱测定的线性回归和Deming回归分析。详情在实施例10中描述。图5A-B显示用于比较具有和没有PTAD衍生的250HD3的质谱测定的线性回归和Deming回归分析。详情在实施例10中描述。图6A-D显示比较多重样品和未混合的样品(具有相同的衍生剂)的分析结果的图。详情在实施例14中描述。
图7A-D是比较用不同的衍生剂处理的相同样本的分析结果的图(但比较混合的对混合的，或未混合的对未混合的样品)。详情在实施例14中描述。图8A-D是比较用不同的衍生剂处理的相同样本的分析结果的图，一个分析来自混合的样品，一个来自未混合的样品。详情在实施例14中描述。图9A显示25-羟基维生素D2先驱离子的示例性Ql扫描谱(覆盖约350至450的m/z范围)。图9B显示具有约395. 2的m/z的25-羟基维生素D2先驱离子碎裂的示例性产物离子谱(覆盖约100至396的m/z范围)。详情在实施例15中描述。图IOA显示25-羟基维生素D3离子的示例性Ql扫描谱(覆盖约350至450的m/z范围)。图IOB显示具有约383. 2的m/z的25-羟基维生素D3先驱离子碎裂的示例性产物离子谱(覆盖约100至396的m/z范围)。详情在实施例15中描述。图IlA显示PTAD-25-羟基维生素D2离子的示例性Ql扫描谱(覆盖约520至620的m/z范围)。图IlB显示具有约570. 3的m/z的PTAD-25-羟基维生素D2先驱离子碎裂 的示例性产物离子谱(覆盖约200至400的m/z范围)。详情在实施例15中描述。

图12A显示PTAD-25-羟基维生素D3离子的示例性Ql扫描谱(覆盖约520至620的m/z范围)。图12B显示具有约558. 3的m/z的PTAD-25-羟基维生素D3先驱离子碎裂的示例性产物离子谱(覆盖约200至400的m/z范围)。详情在实施例15中描述。图13A显示PTAD-I α，25- 二羟基维生素D2离子的示例性Ql扫描谱(覆盖约520至620的m/z范围)。图13B显示具有约550. 4的m/z的PTAD-I α，25- 二羟基维生素D2先驱离子碎裂的示例性产物离子谱(覆盖约250至350的m/z范围)。图13C显示具有约568. 4的m/z的PTAD-I α，25- 二羟基维生素D2先驱离子碎裂的示例性产物离子谱(覆盖约250至350的m/z范围)。图13D显示具有约586. 4的m/z的PTAD-I α，25- 二羟基维生素D2先驱离子碎裂的示例性产物离子谱(覆盖约250至350的m/z范围)。详情在实施例16中描述。图14A显示PTAD-I α，25- 二羟基维生素D3离子的示例性Ql扫描谱(覆盖约520至620的m/z范围)。图14B显示具有约538. 4的m/z的PTAD-I α，25- 二羟基维生素D3先驱离子碎裂的示例性产物离子谱(覆盖约250至350的m/z范围)。14C显示具有约556. 4的m/z的PTAD-I α，25- 二羟基维生素D3先驱离子碎裂的示例性产物离子谱(覆盖约250至350的m/z范围)。图14D显示具有约574. 4的m/z的PTAD-I α，25- 二羟基维生素D3先驱离子碎裂的示例性产物离子谱(覆盖约250至350的m/z范围)。详情在实施例16中描述。图15A显示PTAD-维生素D2离子的示例性的Ql扫描谱(覆盖约500至620的m/z范围)。图15B显示具有约572. 2的m/z的PTAD-维生素D2先驱离子碎裂的示例性产物离子谱(覆盖约250至350的m/z范围)。详情在实施例17中描述。图16A显示PTAD-维生素D3离子的示例性Ql扫描谱(覆盖约500至620的m/z范围)。图16B显示具有约560. 2的m/z的PTAD-维生素D3先驱离子碎裂的示例性产物离子谱(覆盖约250至350的m/z范围)。详情在实施例17中描述。发明详述描述测量样品中留族化合物，如维生素D和维生素D相关化合物的方法。更具体地，描述在单个质谱测定中检测和定量多个试验样品中的留族化合物的方法。结合质谱法(MS)方法，该方法可利用Cookson型试剂，如PTAD，产生衍生的留族化合物，由此提供检测和定量多个试验样品中的留族化合物的高通量测定系统。优选实施方式特别适合自动化甾族化合物定量的大的临床实验室中的应用。用于本发明方法的合适的试验样品包括可含有感兴趣的分析物的任何试验样品。在一些优选实施方式中，样品是生物样品；即，从任何生物来源，如动物、细胞培养物、器官培养物等获得的样品。在某些优选实施方式中，样品从哺乳动物，如狗、猫、马等获得。特别优选的哺乳动物是灵长类，最优选男性或女性人类。优选的样品包括体液如血液、血浆、血清、唾液、脑脊液或组织样品；优选血浆(包括EDTA和肝素血浆)和血清；最优选血清。这样的样品可，例如，从患者；即，活人，男性或女性获得，在临床环境中呈现自身用于疾病或状况的诊断、预后或治疗。本发明还考虑一种或多种留族化合物的定量试剂盒。留族化合物定量测定的试剂盒可包括包含本文提供的组合物的试剂盒。例如，试剂盒可包括包装材料和测量过的量的同位素标记的内标——以足够至少一个测定的量。通常，试剂盒还将包括 以有形形式记录的说明书(例如，包含在纸或电子媒介上)用于使用留族化合物定量测定中使用的包装的试剂。用于本发明的实施方式的校准和QC库优选利用与期望的样品基体相似的基体来制备。用于质谱分析的样品制备在用于质谱分析的制备中，一种或多种留族化合物可通过本领域已知的任何方法，包括例如，液相色谱、过滤、离心、薄层色谱(TLC)、包括毛细管电泳在内的电泳、包括免疫亲和分离在内的亲和分离、包括乙酸乙酯或甲醇提取在内的提取法，和利用离液剂或以上或类似方法的任何组合相对于样品中的一种或多种其它组分(例如蛋白质)进行富集。这些富集步骤可在处理之前应用于个体试验样品，在衍生之后应用于个体处理的样品，或在处理的样品已被组合之后应用于多重样品。蛋白质沉淀是一种制备样品，特别是生物样品，如血清或血浆的方法。蛋白质纯化方法是本领域熟知的，例如，Poison et al. , Journal of ChromatographyB2003, 785:263-275，描述了适合用于本发明方法的蛋白质沉淀技术。蛋白质沉淀可用于从样品中去除大部分蛋白质，留下一种或多种留族化合物在上清液中。可将样品离心以从沉淀的蛋白质中分离液体上清液；可选地可将样品过滤以去除沉淀的蛋白质。然后可将得到的上清液或滤液直接应用于质谱法分析；或可选地应用于液相色谱和随后的质谱法分析。在某些实施方式中，个体试验样品，如血浆或血清，可通过杂化蛋白质沉淀/液-液提取法而被纯化。在这些实施方式中，将未处理的试验样品与甲醇、乙酸乙酯和水混合，并将产生的混合物涡旋和离心。将产生的上清液——包含一种或多种纯化的留族化合物——移去、完全干燥和在乙腈中重构(reconstituted)。然后可将乙腈溶液中的一种或多种纯化的甾族化合物用任何Cookson型试剂，优选PTAD或其同位素标记的变体衍生。可在质谱法之前使用的样品纯化的另一个方法是液相色谱(LC)。包括HPLC在内的液相色谱的某些方法依赖相对慢的层流技术。传统的HPLC分析依赖柱填充，其中通过柱的样品的层流是从样品中分离感兴趣的分析物的基础。熟练的技术人员将理解，这样的柱中的分离是扩散过程并可选择适合衍生的留族化合物使用的包括HPLC在内的LC、仪器和柱。色谱柱通常包括介质(即，填充材料)以促进化学部分的分离(即，分级)。介质可包括微小的颗粒，或可包括具有孔道的整体材料。介质的表面通常包括键合表面，其与各种化学部分相互作用以促进化学部分的分离。一个合适的键合表面是疏水键合表面如烷基键合、氰基键合表面或高纯的二氧化硅表面。烷基键合表面可包括C-4、C-8、C-12或C-18键合的烧基。在优选实施方式中，柱是高纯的二氧化娃柱(如Thermo Hypersil Gold Aq柱)。色谱柱包括用于接收样品的入口和用于排出包括分级的样品的流出液的出口。可将样品直接提供到入口，或从萃取柱，如联机SPE柱体或TFLC萃取柱。在优选实施方式中，多重样品可在质谱法之前通过液相色谱纯化。在一个实施方式中，可将多重样品在入口施加到LC柱，用溶剂或溶剂混合物洗脱，并在出口排出。可选择不同的溶剂方式用于洗脱感兴趣的分析物(或多个)。例如，液相色谱可利用梯度方式、等度方式或多变(即混合)方式进行。在色谱期间，物质的分离通过变量如洗脱液(也被称作“流动相”)、洗脱方式、梯度条件、温度等的选择来完成。在某些实施方式中，通过将多重样品在感兴趣的分析物被柱填充材料可逆地保留，而一种或多种其它物质不被保留的条件下施加到柱可将分析物纯化。在这些实施方式 中，感兴趣的分析物被柱保留时可利用第一流动相条件，一旦非保留的物质被洗过，随后可利用第二流动相条件以从柱去除保留的物质。可选地，通过在感兴趣的分析物相比一种或多种其它物质以有差别的速度洗脱的流动相条件下将多重样品施加到柱可纯化分析物。这样的操作可相对于样品的一种或多种其它组分在特定时间(即，特有的保留时间)富集洗脱液中感兴趣的分析物的量。在一个优选实施方式中，用烷基键合的分析柱色谱系统进行HPLC。在某些优选实施方式中，使用高纯二氧化娃柱(如Thermo Hypersil Gold Aq柱)。在某些优选实施方式中，利用HPLC级水作为流动相A和HPLC级乙醇作为流动相B进行HPLC和/或TFLC。通过仔细地选择阀和连接管道，需要时可将两个或多个色谱柱连接以便物质从一个通过到下一个无需任何手动步骤。在优选实施方式中，阀和管道的选择由预编程序的计算机控制以进行必需的步骤。最优�。�色谱系统还以这样的联机方式连接到检测器系统，例如，MS系统。因此，操作员可将样品的托盘放到自动进样器中，剩余的操作在计算机控制下进行，导致所有选择的样品得到纯化和分析。在一些实施方式中，在质谱法之前萃取柱可用于留族化合物的纯化。在这样的实施方式中，在电离之前利用捕获分析物的萃取柱，样品可被提�。�然后在第二萃取柱上或在分析HPLC柱上洗脱和层析。例如，用TFLC萃取柱的样品提取可用大粒度(50μπι)的填充柱实现。然后可将该柱的洗脱出的样品转移到HPLC分析柱用于质谱法之前的进一步纯化。因为这些色谱程序中包括的步骤可以以自动化方式连接，所以可将分析物纯化过程中操作员参与的需要减到最小。该特点可导致节省时间和成本，并消除操作员错误的可能。在一些实施方式中，蛋白质沉淀通过杂化蛋白质沉淀/液-液提取法一包括从血清试验样品的甲醇蛋白质沉淀和乙酸乙酯/水萃取一实现。在经历萃取柱之前产生的甾族化合物可被衍生。优选，杂化蛋白质沉淀/液-液提取法和萃取柱以联机方式连接。在甾族化合物选自维生素D和维生素D相关化合物的优选实施方式中，萃取柱优选是C-8萃取柱，如Cohesive Technologies C8XL联机萃取柱(50 μ m粒度，O. 5 X 50mm)或同等物。然后在质谱分析之前可将来自萃取柱的洗脱液施加到分析型LC柱，如以联机方式的HPLC柱。因为这些色谱程序中包括的步骤可以以自动化方式连接，所以可将分析物纯化过程中对操作员参与的需要减到最小。该特点可导致节省时间和成本，并消除操作员错误的可能。通过质谱法的检测和定暈在各种实施方式中，衍生的留族化合物可通过熟练的技术人员已知的任何方法而被电离。利用质谱仪进行质谱法，质谱仪包括用于电离分级的样品和产生用于进一步分析的带电荷分子的离子源。例如样品的电离可通过电子电离、化学电离、电雾化电离(ESI)、光电离、大气压化学电离(APCI)、光电离、大气压光电离(APPI)、快原子轰击(FAB)、液体二次电离(LSI)、基体辅助激光解吸电离(MALDI)、场致电离、场致解吸、热喷射/等离子体喷射电离、表面增强激光解吸电离(SELDI)、电感耦合等离子体(ICP)、颗粒束电离和LDTD进行。熟练的技术人员将理解，可基于将被测量的分析物、样品类型、检测器类型、阳性对阴性方式的选择等确定电离方法的选择。衍生的留族化合物可以以阳性或阴性方式电离。在优选实施方式中，衍生的甾族 化合物以阳性方式通过APCI而被电离。在相关的优选实施方式中，衍生的甾族化合物离子处于气态，惰性碰撞气体是IS或氮；优选気。在质谱法技术中，通常在样品已被电离之后，可分析由此产生的带正电荷或带负电荷的离子以测定质荷比。测定质荷比的合适的分析器包括四极分析器、离子阱分析器和飞行时间分析器。示例性的离子讲方法在Bartolucci, et al. , Rapid Commun. MassSpectrom. 2000，14:967-73 中被描述。可利用几种检测方式来检测离子。例如，选择的离子可被检测，即利用选择性离子监测方式(SIM)，或可选地，由碰撞诱导解离产生的质量变迁或中性丧失可被监测，例如，多重反应监测(MRM)或选择性反应监测(SRM)。优�。�利用四极分析器测定质荷比。例如，在“四极”或“四极离子阱”仪器中，振荡射频场中的离子经历与在电极之间施加的DC电势、RF信号的振幅和质荷比成比例的力。可选择电压和振幅以便只有具有特定质荷比的离子经历四极的长度，而所有其它离子偏离。因此，四极仪器可充当注射进仪器的离子的“质量过滤器”和“质量检测器”。人们可通过利用“串联质谱法”或“MS/MS”提高MS技术的分辨率。在该技术中，可将从感兴趣的分子产生的先驱离子(也称作母离子)在MS仪器中过滤，随后破碎先驱离子以产生一种或多种碎片离子(也称作子离子或产物离子)，然后将其在第二 MS程序中分析。通过仔细地选择先驱离子，只将某些分析物产生的离子送到碎裂室，在那里与惰性气体的原子碰撞产生碎片离子。因为先驱离子和碎片离子都在给定的电离/碎裂条件下以可再现的方式产生，所以MS/MS技术可提供非常强大的分析工具。例如，过滤/碎裂的组合可用于消除干扰物质，并可在复杂样品，如生物样品中特别有用。操作串联质谱仪器的替换方式包括产物离子扫描和先驱离子扫描。对于这些操作方式的描述，参见，例如，E. Michael Thurman, et al. , Chromatographic-MassSpectrometric Food Analysis for Trace Determination of Pesticide Residues,第 8 章(AmadeoR.Fernandez-Alba编,Elsevier 2005) (387)。可通过本领域已知的为数众多的方法将分析物测定的结果与最初样品中分析物的量关联。例如，假定仔细控制采样和分析参数，可将给定离子的相对丰度与将该相对丰度转化成原始分子的绝对量的表比较。可选地，外标可与样品一起进行，基于从那些标准产生的离子作标准曲线。利用这样的标准曲线，可将给定离子的相对丰度转化成原始分子的绝对量。在某些优选实施方式中，内标用于产生计算留族化合物的量的标准曲线。产生和利用这样的标准曲线的方法在本领域是众所周知的，普通技术人员能选择适当的内标。例如，在一些实施方式中，一种或多种同位素标记的维生素D代谢物(例如,250HD2-[6, 19, 19]-2H3和250HD3-[6，19，19]-2H3)可用作内标。将离子的量与原始分子的量相关联的为数众多的其它方法对本领域的普通技术人员来说将是熟知的。方法的一个或多个步骤可利用自动化机器进行。在某些实施方式中，一个或多个纯化步骤联机进行，更优选所有的纯化和质谱法步骤可以以联机方式进行。在某些质谱法技术中，如MS/MS，通过碰撞活化解离(CAD)将先驱离子分离用于进一步碎裂。在CAD中，先驱离子通过与惰性气体碰撞而获得能量，并随后通过称作“单分子分解”的过程被破碎。足够的能量必须沉积在先驱离子中以便由于增加的振动能，离子内的某些键可被断裂。
如下利用MS/MS，样品中的甾族化合物可被检测和/或定量。样品可首先通过蛋白质沉淀或杂化蛋白质沉淀/液-液提取来纯化。然后，将纯化的样品中的一种或多种甾族化合物用Cookson型试剂，如PTAD或其同位素变体衍生。然后可将纯化的样品经历液相色谱，优选在萃取柱(如TFLC柱)上，该萃取柱之后是分析柱(如HPLC柱)；来自色谱柱的液体溶剂流进入MS/MS分析器的雾化器接口 ；溶剂/分析物混合物在接口的加热的带电荷的管道中被转化成蒸汽。通过将大的电压施加到溶剂/分析物混合物而将溶剂中含有的分析物(一种或多种)(例如，衍生的留族化合物如衍生的维生素D代谢物)电离。当分析物退出接口的带电荷的管道时，溶剂/分析物混合物雾化，溶剂蒸发，留下分析物离子。可选地，在电离之前，纯化的样品中的衍生的留族化合物可不经历液相色谱。相反，可将样品点样于96孔板中并通过LDTD使之挥发和电离。离子，例如先驱离子，通过串联质谱(MS/MS)仪器的孔口并进入第一四极。在串联质谱仪器中，四极I和3(Q1和Q3)是质量过滤器，允许基于它们的质荷比(m/z)选择离子(即，分别选择Ql和Q3中的“先驱”离子和“碎片”离子)。四极2(Q2)是碰撞小室，离子在那里被破碎。质谱仪的第一四极(Ql)选择具有感兴趣的衍生的留族化合物质荷(m/z)比的分子。允许具有正确质/荷比的先驱离子进入碰撞室(Q2)，而具有任何其它质荷比的不需要的离子与四极的侧面撞击并被消除。进入Q2的先驱离子与中性氩气分子撞击并破碎。产生的碎片离子进入四极3 (Q3)，在那里感兴趣的衍生的留族化合物的碎片离子被选择，而其它离子被排除。方法可包括以阳离子方式或阴离子方式，优选阳离子方式进行的MS/MS。利用本领域熟知的标准方法，本领域的技术人员能鉴定可用于四极3(Q3)中选择的衍生的留族化合物的特定先驱离子的一种或多种碎片离子。当离子与检测器碰撞时，它们产生电子脉冲，其被转换成数字信号。将获得的数据传递给计算机，计算机绘制收集的离子计数对时间的图。产生的质谱图与传统的HPLC-MS方法产生的色谱图相似。可测量对应于特定离子的峰下面积或这样的峰的振幅并使之与感兴趣的分析物的量相关联。在某些实施方式中，测量碎片离子(一种或多种)和/或先驱离子的曲线下面积或峰的振幅，以测定特定留族化合物的量。如上所述，基于内部分子标准的一种或多种离子的峰，可利用校正标准曲线将给定离子的相对丰度转换成原始分析物的绝对量。处理患者样品用于多重患者样品的分析接着上面描述的程序，如果每个患者样品被不同地处理，那么多个患者样品可以是多重(即，一起混合和测定)。短语“不同地处理”指即将被包括在多重样品中的每个患者样品以这样的方式被处理最初通过质谱法不能区别的两个或多个患者样品中的留族化合物在处理之后变得可区别。这可通过用衍生留族化合物的不同的剂处理每个患者样品来实现。选择使用的衍生剂必须产生通过质谱法可区别的衍生的留族化合物。通过质谱法区分衍生的留族化合物的基础将是来自衍生的留族化合物的离子的质量差异。质量差异可由使用两种或多种不同的衍生剂，如PTAD和DMEQTAD的而引起。质量差异还可由使用相同衍生剂的两种或多种同位素变体，如PTAD和13C6-PTAD而引起。这两个方法不互相排斥，并且不同的衍生剂和相同剂的同位素变体的任何组合可用于独特地标记将被分析的多个患者样品中每个患者样品中的留族化合物。任选地，可处理来自多个患者样品的一个样品，而不用衍生剂。处理多个患者样品之后，来自一个患者样品的特定留族化合物将具有与其它患者 样品中的相同甾族化合物不同的质谱曲线。当将处理的患者样品混合以形成多重样品——其然后被分析以测定处理的留族化合物的水平——时，检测的处理的留族化合物的质谱曲线的差异允许将每个处理的留族化合物归因于起始的患者样品。因此，两个或多个患者样品中的留族化合物的量通过多重样品的单个质谱分析来测定。如上面所指出的，不同的Cookson型试剂可用作不同的患者样品的衍生剂；例如，可用PTAD衍生一个患者样品，并且用DMEQTAD衍生第二患者样品。利用不同的Cookson型试剂通常导致衍生的分析物之间大的质量差异。例如，用PTAD衍生的留族化合物和用DMEQTAD衍生的相同化合物之间的质量差异是约200个质量单位(TAD和DMEQTAD之间的质
量差异)。相同的Cookson型试剂同位素变体还可用于在许多患者样品中产生可区别的衍生物。例如，可用PTAD衍生一个患者样品，并且可用13C6-PTAD衍生第二患者样品。在该实例中，PTAD和13C6-PTAD之间的质量差异是约6个质量单位。以下实施例通过用PTAD的同位素变体处理许多患者样品而用于举例说明本发明。这些实施例决不是想要限制方法的范围。特别地，以下实施例显示利用250HD2-[6, 19，19]-屯3或250冊3-[6，19，19]-2H3作为内标通过质谱法定量维生素D代谢物。当应用于维生素D代谢物时，本发明方法的显示不将该方法的适用性限制为只是维生素D和维生素D相关化合物。相似地，250HD2-[6，19，19]-2 或250HD3-[6，19，19]」比用作内标不意味以任何方式受到限制。任何适当的化学物种——容易被本领域技术人员测定——可被用作甾族化合物定量的内标。实施例实施例I :杂化蛋白质沉淀/液-液提耳又和Cookson型衍生对患者血清样品进行以下自动化的杂化蛋白质沉淀/液-液提取技术。已将凝胶屏障血清(Gel Barrier Serum)(即，在血清分离管中采集的血清)以及EDTA血衆和肝素血浆建立为该测定所接受的。Perkin-Elmer Janus机器人和TomTec Quadra Tower机器人用于使以下程序自动化。对于每个样品，将50 μ L血清加到96孔板的孔中。然后向每个孔中加入25 μ L内标混合物(包含同位素标记的250HD2-[6, 19，19]-2H3和25OHD3-[6, 19，19]-2H3)，并将板涡旋。然后加入75 μ L甲醇,之后进行另外的涡旋。然后加入300 μ L乙酸乙酯和75 μ L水，之后进行另外的涡旋、离心，并将得到的上清液转移到新的96孔板。将来自实施例I的第二 96孔板中的转移的液体在流动的氮气歧管下干燥完全。通过向每个孔加入100 μ L的乙腈中的Cookson型衍生剂PTAD的O. lmg/mL溶液来实现衍生。允许衍生反应进行大约一个小时，并通过向反应混合物中加入100 μ L水而使之淬灭。实施例2 :用液相色谱提取维生素P代谢物利用Aria OS V I. 5. I 或更新的软件用 Cohesive Technologies Aria TX-4 TFLC系统进行样品注射。TFLC系统自动化地将上述制备的样品的等分试样注射进填充有大颗粒的 Cohesive Technologies C8XL 联机萃取柱(50 μ m 粒度，005 X 50mm,来自 CohesiveTechnologies, Inc.)。在高流速下装载样品以在萃取柱内部产生瑞流。该瑞流确保柱中衍生的维生素D代谢物与大颗粒优化的结合，和过量衍生试剂和碎片到废物的通道。装载之后,用水/乙醇洗脱梯度将样品洗脱到分析柱-Thermo Hypersil Gold
Aq分析柱(5 μ m粒度，50 X 2. Imm)。将HPLC梯度施加到分析柱以将维生素D代谢物与样品中含有的其它分析物分离。流动相A是水，流动相B是乙醇。HPLC梯度从35%有机梯度开始，其在大约65秒中上升到99%。实施例3 :通过MS/MS检测和定暈衍生的维生素D代谢物利用Finnigan TSQ Quantum Ultra MS/MS系统(Thermo Electron Corporation)进行MS/MS。以下软件程序——所有都来自Thermo Electron——在本文描述的实施例中使用Quantum Tune Master V I. 5 或更新的、Xcalibur V 2. 07 或更新的、LCQuan V2. 56 (Thermo Finnigan)或更新的和ARIA OS vl. 5. I (Cohesive Technologies)或更新的。退出分析柱的液体溶剂/分析物流到MS/MS分析器的雾化器接口。在接口的管道中溶剂/分析物混合物被转化成蒸气。雾化的溶剂中的分析物通过ESI被电离。离子经过第一四极(Ql)，其为衍生的维生素D代谢物选择离子。为PTAD_250HD2选择具有 570. 32 ±0. 50m/z 的离子；为 PTAD_250HD3 选择具有 558. 32 ±0. 50m/z 的离子。进入四极2(Q2)的离子与氩气碰撞，产生离子碎片，其被送到四极3(Q3)用于进一步选择。质谱仪设置显示在表I。同时，用内标，？1八0-250!102-[6，19，19]-2!13和PTAD-250HD3-[6, 19，19]-2H3进行利用同位素稀释质谱法的相同的过程。以下质量变迁用于验证过程中正极性的检测和定量。指示的质量变迁不意味着以任何方式受到限制。如接下来的实施例所见，可为每个分析物选择其它质量变迁以产生定量数据。表I.用于PTAD_250HD2和PTAD_250HD3检测的质谱仪设置。
权利要求
1.用单个质谱测定来测定多个试验样品的每个试验样品中的留族化合物的量的方法，其中在处理之前所述留族化合物在每个试验样品中是相同的，所述方法包括 不同地处理每个试验样品以形成多个处理的样品，其中由于所述处理，每个处理的样品中的所述留族化合物通过质谱法可区别于其它处理的样品中的所述留族化合物； 合并所述处理的样品以形成多重样品； 使所述多重样品在适于产生一种或多种通过质谱法可检测的离子的条件下经历电离源，其中一种或多种从来自每个处理的样品的所述留族化合物产生的离子不同于一种或多种从来自其它处理的样品的所述留族化合物产生的离子； 通过质谱法检测一种或多种来自每个处理的样品的所述留族化合物的离子的量；和 使一种或多种来自每个处理的样品的所述留族化合物的离子的量与每个试验样品中所述留族化合物的量相关联。
2.权利要求I所述的方法，其中所述多个处理的样品包括一个具有未衍生的留族化合物的处理的样品。
3.权利要求I所述的方法，其中所述处理包括在适合产生衍生的留族化合物的条件下将每个试验样品经历不同的衍生剂。
4.权利要求3所述的方法，其中所述不同的衍生剂是各自的同位素变体。
5.权利要求3所述的方法，其中所述不同的衍生剂是Cookson型衍生剂。
6.权利要求5所述的方法，其中所述Cookson型衍生剂选自4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)、4-甲基-I, 2，4-三唑啉-3，5_ 二酮(MTAD)、4_[2_(6，7- 二甲氧基-4-甲基-3-氧代-3，4- 二氢喹喔啉基)乙基]-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(DMEQTAD)、4-(4-硝基苯基)-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(NPTAD)、4_ 二茂铁基甲基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(FMTAD)和其同位素变体。
7.权利要求5所述的方法，其中所述Cookson型衍生剂是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)的同位素变体。
8.权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述多个样品包括两个样品，第一衍生试剂是4-苯基-I, 2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)，第二衍生试剂是13C6+苯基-I, 2，4-三唑啉-3，5- 二酮(13C6-PTAD)。
9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述留族化合物是维生素D或维生素D相关化合物。
10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述留族化合物选自维生素D2、维生素D3、25-羟基维生素D2 (250HD2)、25_羟基维生素D3 (250HD3)、I a，25- 二羟基维生素D2 (I a，250HD2)和 I a，25- 二羟基维生素 D3 (I a，250HD3)。
11.权利要求10所述的方法，其中所述留族化合物是25-羟基维生素D2(250HD2)或25-羟基维生素D3(250HD3)。
12.权利要求1-11中任一项所述的方法，进一步包括在经历电离源之前将所述多重样品经历萃取柱和分析柱。
13.权利要求12所述的方法，其中所述萃取柱是固相萃取(SPE)柱。
14.权利要求12所述的方法，其中所述萃取柱是湍流液相色谱(TFLC)柱。
15.权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述分析柱是高效液相色谱(HPLC)柱。
16.权利要求1-15中任一项所述的方法，其中质谱法是串联质谱法。
17.权利要求16所述的方法，其中所述串联质谱法作为多重反应监测、先驱离子扫描或产物离子扫描而进行。
18.权利要求12-17中任一项所述的方法，其中所述萃取柱、分析柱和所述电离源以联机方式连接。
19.权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述电离源包括激光二极管热解吸(LDTD)。
20.权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述电离源包括电雾化电离源(ESI)或大气压化学电离源(APCI)。
21.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述试验样品包括生物样品。
22.权利要求21所述的方法，其中所述试验样品包括血浆或血清。
23.用单个质谱测定来测定多个试验样品的每个试验样品中的两种或多种留族化合物的量的方法，所述方法包括 不同地处理每个试验样品以形成多个处理的样品，其中由于所述处理，每个处理的样品中的两种或多种留族化合物通过质谱法可区别于其它处理的样品中的两种或多种甾族化合物； 合并所述处理的样品以形成多重样品； 使所述多重样品在适于产生一种或多种通过质谱法可检测的离子的条件下经历电离源，其中一种或多种从来自每个处理的样品的每种所述留族化合物产生的离子不同于一种或多种从来自其它处理的样品的甾族化合物产生的离子； 通过质谱法检测一种或多种来自每个处理的样品的所述两种或多种留族化合物中每种甾族化合物的离子的量；和 使一种或多种来自每个处理的样品的所述两种或多种留族化合物中每种留族化合物的离子的量与每个试验样品中所述留族化合物中每种留族化合物的量相关联。
24.权利要求23所述的方法，其中所述多个处理的样品包括一个具有未衍生的留族化合物的处理的样品。
25.权利要求23所述的方法，其中所述处理包括在适合产生衍生的留族化合物的条件下将每个试验样品经历不同的衍生剂。
26.权利要求25所述的方法，其中所述不同的衍生剂是各自的同位素变体。
27.权利要求25所述的方法，其中所述不同的衍生剂是Cookson型衍生剂。
28.权利要求27所述的方法，其中所述Cookson型衍生剂选自4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)、4_ 甲基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(MTAD)、4_[2_(6，7-二甲氧基-4-甲基-3-氧代-3，4- 二氢喹喔啉基)乙基]-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(DMEQTAD)、4-(4-硝基苯基)-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(NPTAD)、4_ 二茂铁基甲基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(FMTAD)和其同位素变体。
29.权利要求27所述的方法，其中所述Cookson型衍生剂是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)的同位素变体。
30.权利要求23-29中任一项所述的方法，其中所述多个样品包括两个样品，第一衍生试剂是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)，第二衍生试剂是13C6_4_苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(13C6-PTAD)。
31.权利要求23-30中任一项所述的方法，其中每个试验样品中的所述两种或多种甾族化合物是维生素D或维生素D相关化合物。
32.权利要求23-31中任一项所述的方法，其中每个试验样品中的所述两种或多种甾族化合物选自维生素D2、维生素D3、25-羟基维生素D2 (250HD2)、25_羟基维生素D3 (250HD3)、I a，25- 二羟基维生素 D2 (I a，250HD2)和 I a，25- 二羟基维生素 D3 (I a，250HD3)。
33.权利要求32所述的方法，其中每个试验样品中的所述两种或多种留族化合物包括至少一个选自25-羟基维生素D2 (250HD2)和25-羟基维生素D3(250HD3)的留族化合物。
34.权利要求32所述的方法，其中每个试验样品中的所述两种或多种留族化合物是25-羟基维生素D2 (250HD2)和25-羟基维生素D3 (250HD3)。
35.权利要求23-34中任一项所述的方法，进一步包括在经历电离源之前将所述多重样品经历萃取柱和分析柱。
36.权利要求35所述的方法，其中所述萃取柱是固相萃取(SPE)柱。
37.权利要求35所述的方法，其中所述萃取柱是湍流液相色谱(TFLC)柱。
38.权利要求35-37中任一项所述的方法，其中所述分析柱是高效液相色谱(HPLC)柱。
39.权利要求23-38中任一项所述的方法，其中质谱法是串联质谱法。
40.权利要求39所述的方法，其中所述串联质谱法作为多重反应监测、先驱离子扫描或产物离子扫描而进行。
41.权利要求23-40中任一项所述的方法，其中所述萃取柱、分析柱和所述电离源以联机方式连接。
42.权利要求23-41中任一项所述的方法，其中所述电离源包括激光二极管热解吸(LDTD)。
43.权利要求23-42中任一项所述的方法，其中所述电离源包括电雾化电离源(ESI)或大气压化学电离源(APCI)。
44.权利要求23-44中任一项所述的方法，其中所述试验样品包括生物样品。
45.权利要求44所述的方法，其中所述试验样品包括血浆或血清。
46.用单个质谱测定来测定两个试验样品的每个试验样品中的维生素D或维生素D相关化合物的量的方法，其中在处理之前维生素D或维生素D相关化合物在每个试验样品中是相同的，所述方法包括 在适合产生维生素D或维生素D相关衍生物的条件下，通过将第一试验样品经历4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)的第一同位素变体而产生第一处理的样品； 在适合产生维生素D或维生素D相关衍生物的条件下，通过将第二试验样品经历4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)的第二同位素变体而产生第二处理的样品，其中所述PTAD的第一和第二同位素变体通过质谱法是可区分的； 混合所述第一处理的样品和所述第二处理的样品以形成多重样品； 使来自所述多重样品中每个处理的样品的维生素D或维生素D相关衍生物在适于产生一种或多种通过质谱法可检测的离子的条件下经历电离源，其中一种或多种来自所述第一处理的样品的所述维生素D或维生素D相关衍生物的离子不同于一种或多种来自所述第二处理的样品的所述维生素D或维生素D相关衍生物的离子；通过质谱法检测一种或多种来自每个处理的样品的所述维生素D或维生素D相关衍生物的离子的量；和 使所述测定的离子的量与所述第一和第二试验样品中的所述维生素D或维生素D相关化合物的量相关联。
47.权利要求46所述的方法，其中4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)的所述第一同位素变体是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)，4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)的所述第二同位素变体是13C6-4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(13C6-PTAD)。
48.权利要求46-47中任一项所述的方法，其中所述维生素D或维生素D相关化合物选自25-羟基维生素D2 (250HD2)和25-羟基维生素D3(250HD3)。
49.权利要求46-48中任一项所述的方法，其中所述试验样品进一步包括两种或多种维生素D或维生素D相关化合物，并且每个试验样品中所述两种或多种维生素D或维生素D相关化合物的所述量通过所述方法来测定。
50.权利要求49所述的方法，其中所述两种或多种维生素D或维生素D相关化合物包括25-羟基维生素D2 (250HD2)和25-羟基维生素D3(250HD3)。
51.权利要求49所述的方法，其中所述两种或多种维生素D或维生素D相关化合物是25-羟基维生素D2 (250HD2)和25-羟基维生素D3 (250HD3)。
52.权利要求46-51中任一项所述的方法，进一步包括在经历电离源之前将所述多重样品经历萃取柱和分析柱。
53.权利要求52所述的方法，其中所述萃取柱是固相萃取(SPE)柱。
54.权利要求52所述的方法，其中所述萃取柱是湍流液相色谱(TFLC)柱。
55.权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述分析柱是高效液相色谱(HPLC)柱。
56.权利要求52-55中任一项所述的方法，其中质谱法是串联质谱法。
57.权利要求56所述的方法，其中所述串联质谱法作为多重反应监测、先驱离子扫描或产物离子扫描而进行。
58.权利要求52-57中任一项所述的方法，其中所述萃取柱、分析柱和所述电离源以联机方式连接。
59.权利要求46-58中任一项所述的方法，其中所述电离源包括激光二极管热解吸(LDTD)。
60.权利要求46-59中任一项所述的方法，其中所述电离源包括电雾化电离源(ESI)或大气压化学电离源(APCI)。
61.权利要求46-60中任一项所述的方法，其中所述试验样品包括生物样品。
62.权利要求61所述的方法，其中所述试验样品包括血浆或血清。多重样品中的留族化合物的质谱法发明领域
本发明涉及通过质谱法的留族化合物的定量测量。在具体方面，本发明涉及通过质谱法的多个样品的留族化合物的定量测量的方法。
发明背景
留族化合物是任何为数众多的天然存在的或合成的脂溶性有机化合物，该化合物具有作为基础的以四个环排列的17个碳原子，并包括留醇和胆汁酸、肾上腺和性激素、某些天然药物如洋地黄化合物以及某些维生素和相关的化合物(如维生素D、维生素D类似物和维生素D代谢物)。
许多甾族化合物是生物学上重要的。例如，维生素D是在钙(Ca2+)稳态的正调节中具有重要生理作用的必需营养素。维生素D可通过暴露于日光而在皮肤中从头形成或它可从饮食吸收。存在两种形式维生素D :维生素D2 (麦角钙化醇)和维生素D3 (胆钙化醇)。维生素D3是由动物从头合成的形式。它还是加入到在美国生产的乳制品和某些食品中的常见补充物。饮食和内在合成的维生素D3必须经历代谢激活以产生生物活性的代谢物。在人类中，维生素D3激活的最初步骤主要发生在肝中并包括羟基化作用以形成中间体代谢物25-羟基胆钙化醇(骨化二醇；250HD3)。骨化二醇是循环中维生素D3的主要形式。然后循环的250HD3由肾转化，形成1，25-二羟基维生素D3 (骨化三醇；1，25 (OH)2D3),其通常被认为是具有最高生物活性的维生素D3的代谢物。
维生素D2来自真菌和植物来源。许多非处方膳食补充物(dietary supplements)含有麦角钙化醇(维生素％)而不是胆钙化醇(维生素队)。麦角骨化醇(Drisdol)—在美国可获得的唯一的维生素D的高效处方形式——是用麦角钙化醇配制的。维生素D2在人类中经历与维生素D3相似的代谢激活途径，形成代谢物250册2和1，25 (OH)2D20维生素仏和维生素D3已长期被假定在人类中在生物学上相等，然而最近的报道提出这两种形式的维生素D在生物活性和生物利用率上可存在差异(Armas et. al.，(2004) J. Clin. Endocrinol.Metab. 89:5387-5391)。
维生素D—无活性维生素D先驱体一的测量在临床情况中不常发生。相反，25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2和总25-羟基维生素D ( “250HD”)的血清水平是维生素D营养状况和某些维生素D类似物的效力的有用指示物。250HD的测量通常用于钙代谢病症的诊断和处理。在这方面，低水平250HD指示与疾病如低钙血症、低磷血症、继发性甲状旁腺功能亢进症、升高的碱性磷酸酶、成人中骨软化症和儿童中佝偻病有关的维生素D缺乏。在疑似维生素D中毒的患者中，升高水平的250HD使该病症区别于引起高钙血症的其它病症。
I, 25 (OH)2D的测量还用于临床情况。某些疾病状态可通过循环水平的1，25 (OH)2D反映，例如肾疾病和肾功能衰竭常常导致低水平的1，25 (OH) 2D。升高水平的1，25 (OH)2D可指示过量的甲状旁腺素或可指示某些疾病如结节病或某些类型的淋巴瘤。
维生素D代谢物的检测已通过用对250HD2和250HD3共同特异的抗体的放射免疫测定完成。因为目前的基于免疫学的测定不分别分辨250HD2和250HD3，所以不求助于其它试验，维生素D的任何营养缺乏的来源不能被确定。已发表了公开利用质谱法检测特定维生素D代谢物的方法的报道。在一些报道中，维生素D代谢物在质谱法之前被衍生，但是在其它的报道中，它们不是这样。例如Holmquist，et al. 2007年12月28日提交的美国专利申请系列号 11/946765 ;Yeung B，et al. , J Chromatogr. 1993，645 (I) : 115-23 ;Higashi T, et al. , Steroids. 2000, 65(5) :281-94 ；Higashi T, et al., Biol PharmBull. 2001，24(7) :738-43 ；Higashi T, et al.，J Pharm Biomed Anal. 2002，29(5) :947-55 ；Higashi T, et al. , Anal. Bioanal Chem, 2008, 391:229-38 ；和 Aronov, et al. , AnalBioanal Chem，2008，391:1917_30公开通过在质谱法之前衍生代谢物而检测各种维生素D代谢物的方法。检测未衍生的维生素D代谢物的方法在Clarke, et al.，2005年4月6日提交的美国专利申请系列号11/101，166和2006年3月21日提交的11/386,215中，和Singh，et al.，2004年10月24日提交的美国专利申请系列号10/977，121中被报道。还已公开了报道，其公开用Cookson型试剂，特别是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)和4-[2-(6，7-二甲氧基-4-甲基_3_氧代-3，4-二氢喹喔啉基(dihydroquinoxalyl))乙基]_1，2，4_三唑啉 _3，5_ 二酮(DMEQ-TAD)进行的维生素 D3 的衍 生。参见 Aberhart, J, et al. , J. Org. Chem. 1976, 41 (12) : 2098-2102 和 Kamao, M, et al. , JChromatogr. B2007, 859:192-200。
发明概述
本发明提供用单个质谱测定来测定多个试验样品中每个试验样品的留族化合物的量的方法。该方法包括不同地处理每个试验样品以形成多个处理的样品，其中由于处理，每个处理的样品中的留族化合物可通过质谱法区别于其它处理的样品中的留族化合物；合并处理的样品以形成多重样品；使多重样品在适于产生一种或多种通过质谱法可检测的离子的条件下经历电离源，其中一种或多种从来自每个处理的样品的留族化合物产生的离子不同于一种或多种从来自其它处理的样品的留族化合物产生的离子；通过质谱法检测一种或多种来自每个处理的样品的留族化合物的离子的量；和使一种或多种来自每个处理的样品的留族化合物的离子的量与每个试验样品中留族化合物的量相关联。
在一些实施方式中，处理试验样品包括使每个试验样品在适于产生衍生的留族化合物的条件下经历不同的衍生剂。在一些实施方式中，一个试验样品可被处理，无需使该样品经受衍生剂。
在一些实施方式中，在多个试验样品的处理中使用的不同的衍生剂是各自的同位素变体。在一些实施方式中，不同的衍生剂是Cookson型衍生剂；如选自4-苯基-1，2, 4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)、4- [2- (6，7- 二甲氧基-4-甲基-3-氧代-3，4- 二氢喹喔啉基)乙基]_1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(DMEQTAD)、4_(4_ 硝基苯基)-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(NPTAD)、4_ 二茂铁基甲基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(FMTAD)和其同位素变体的Cookson型衍生剂。在一个相关的实施方式中，Cookson型衍生剂是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)的同位素变体。在一个具体实施方式
中，多个样品包括两个样品，第一 Cookson型衍生试剂是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)，第二 Cookson型衍生试剂是13C6-4-苯基-I, 2，4-三唑啉-3，5- 二酮(13C6-PTAD)。
在一些实施方式中，留族化合物是维生素D或维生素D相关的化合物。在相关的实施方式中，留族化合物选自维生素D2、维生素D3、25-羟基维生素D2(250HD2)、25_羟基维生素03(250册3)、10，25-二羟基维生素02(10，2501102)和la，25_二羟基维生素D3(l a，250HD3)。在具体的实施方式中，留族化合物是25-羟基维生素D2(250HD2)或25-羟基维生素D3(250HD3)。
可进行上面描述的方法，用于分析多个试验样品的每个中的两种或多种留族化合物。在这些实施方式的一些中，每个试验样品中的两种或多种留族化合物可包括选自25-羟基维生素D2(250HD2)和25-羟基维生素D3(250HD3)的至少一种留族化合物。在一些实施方式中，每个试验样品中的两种或多种留族化合物是25-羟基维生素D2(250HD2)和25-羟基维生素D3(250HD3)。
在具体实施方式
中，用单个质谱测定两个试验样品的每个中的一种或多种维生素D或维生素D相关化合物的量。在该实施方式中，通过在适合产生一种或多种维生素D或维 生素D相关衍生物的条件下使第一试验样品经受4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)的第一同位素变体而产生第一处理的样品；通过在适合产生一种或多种维生素D或维生素D相关衍生物的条件下使第二试验样品经受4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)的第二同位素变体而产生第二处理的样品，其中PTAD的第一和第二同位素变体可通过质谱法区分；将第一处理的样品和第二处理的样品混合以形成多重样品；将来自多重样品中每个处理的样品的一种或多种维生素D或维生素D相关衍生物在适合产生一种或多种通过质谱法可检测的离子的条件下经历电离源，其中来自第一处理的样品的每种维生素D或维生素D相关衍生物的一种或多种离子不同于来自第二处理的样品的维生素D或维生素D相关衍生物的一种或多种离子；来自每个处理的样品的一种或多种维生素D或维生素D相关衍生物的一种或多种离子的量通过质谱法来测定；测定的离子的量与第一或第二试验样品中的维生素D或维生素D相关化合物的量相关。
在一些具体实施方式
中，4-苯基-1,2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)的第一同位素变体是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)，4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)的第二同位素变体是13C6-4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(13C6-PTAD)。
在一些具体实施方式
中，一种或多种维生素D或维生素D相关化合物选自25-羟基维生素02(250册2)和25-羟基维生素D3(250HD3)。在一些相关的具体实施方式
中，一种或多种维生素D或维生素D相关化合物包括25-羟基维生素D2 (250HD2)和25-羟基维生素D3(250HD3)。在一些相关的具体实施方式
中，一种或多种维生素D或维生素D相关化合物是25-羟基维生素D2 (250HD2)和25-羟基维生素D3 (250HD3)。
在一些实施方式中，使多重样品在经历电离源之前经历萃取柱和分析柱。在一些相关实施方式中，萃取柱是固相萃取(SPE)柱。在其它相关实施方式中，萃取柱是湍流液相色谱(TFLC)柱。在一些实施方式中，分析柱是高效液相色谱(HPLC)柱。
在利用萃取柱、分析柱和电离源中的两个或多个的实施方式中，这些组分中的两种或多种可以以联机方式连接以允许自动化的样品处理和分析。
在本文描述的方法中，质谱法可以是串联质谱法。在利用串联质谱法的实施方式中，串联质谱法可通过本领域已知的任何方法来进行，包括例如，多重反应监测、先驱离子扫描或产物离子扫描。
在本文描述的方法中，留族化合物可通过本领域已知的任何合适的离子化技术被离子化。在一些实施方式中，电离源是激光二极管热解吸(LDTD)电离源。
在优选实施方式中，试验样品包括生物样品，如血浆或血清。
如本文所用，术语“多重样品”指通过如下而制备的样品混合两个或多个样品以形成单个的“多重(multiplex)”样品，然后将该样品进行质谱分析。在本文描述的方法中，对两个或多个试验样品中的每个不同地处理以产生许多不同处理的样品。然后将这些许多不同处理的样品混合以产生单个“多重”样品，然后将该样品进行质谱分析。
如本文所用，术语“留族化合物”指为数众多的天然存在的或合成的脂溶性有机化合物中的任何一种，其具有作为基础的在四个环中排列的17个碳原子并包括留醇和胆汁酸、肾上腺和性激素、某些天然药物如洋地黄化合物、以及某些维生素和相关化合物(如维生素D、维生素D类似物和维生素D代谢物)。
如本文所用，术语“维生素D或维生素D相关化合物”指任何天然或合成形式的维生素D，或与通过维生素D的转化而产生的维生素D有关的任何化学物种，如维生素D代谢的中间体和产物。例如，维生素D可指维生素D2和维生素D3中的一种或多种。维生素D还 可被称作“营养性”维生素D以区别于通过维生素D的转化而产生的化学物种。维生素D相关化合物可包括维生素D2或维生素D3的类似物生物转化产生的化学物种，或与维生素D2或维生素D3有关的化学物种。维生素D相关化合物，特别是维生素D代谢物，可在动物的循环中找到和/或可由生物体，如动物产生。维生素D代谢物可以是天然存在的形式的维生素D代谢物或可以是合成的维生素D类似物的代谢物。在某些实施方式中，维生素D相关化合物可包括一种或多种选自25-羟基维生素D3、25_羟基维生素D2、I a，25- 二羟基维生素D3和I a，25- 二羟基维生素D2的维生素D代谢物。
如本文所用，“衍生”指使两个分子反应以形成新的分子。因此，衍生剂是与另一个物质反应以衍生物质的剂。例如，4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)是可与维生素D代谢物反应以形成PTAD-衍生的维生素D代谢物的衍生试剂。
如本文所用，“不同的衍生剂”是通过质谱法可区别的衍生剂。作为一个实例，相同衍生剂的两个同位素变体通过质谱法是可区别的。作为另一个实例，相同衍生剂的卤代变体通过质谱法也是可区别的。例如，可利用相同的Cookson型剂，如4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)的卤代和非卤代形式。另外，可利用相同的Cookson型剂的两个卤代形式，但用不同的卤素或用不同数目的卤素卤代。作为另一个实例，可利用两种不同的Cookson型剂，如4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)、4-甲基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(MTAD)和4- (4-硝基苯基)-I, 2，4-三唑啉-3，5- 二酮(NPTAD)。以上实例说明通过质谱法可区别的衍生剂的原理。如本领域技术人员将理解的，其它的实例——包括上面任何的组合一可以是可能的。
如本文所用，甾族化合物的衍生形式的名称包括关于衍生的性质的表示。例如，25-羟基维生素D2的PTAD衍生物被表示为PTAD-25-羟基维生素D2 (或PTAD_250HD2)。
如本文所用，“Cookson型衍生剂”是4_取代的1，2，4_三唑啉_3，5_ 二酮化合物。示例性的Cookson型衍生剂包括4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)、4_甲基-I, 2，4-三唑啉-3，5- 二酮(MTAD)、4_[2_(6，7- 二甲氧基-4-甲基 _3_ 氧代-3，4- 二氢喹喔啉基)乙基]-1,2，4-三唑啉-3，5-二酮(DMEQTAD)、4_(4-硝基苯基)-1，2，4_三唑啉-3，5- 二酮(NPTAD)和4- 二茂铁基甲基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(FMTAD)。另夕卜，在一些实施方式中可利用Cookson型衍生剂的同位素标记的变体。例如，13C6-PTAD
全文摘要
本发明涉及通过质谱法对甾族化合物的定量测量。在具体方面，本发明涉及通过质谱法对来自多个样品的甾族化合物的定量测量方法。
文档编号G01N31/00GK102812356SQ201080063451
公开日2012年12月5日 申请日期2010年12月9日 优先权日2009年12月11日
发明者B·霍尔奎斯特, N·J·克拉克 申请人:奎斯特诊断投资公司