专利名称：一种精子顶体酶活性定量检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于体外检测的方法及装置，尤其是一种适用于检测精子顶体酶活性的方法及试剂盒。
背景技术：
顶体酶存在于精子头部顶体内膜与赤道膜之间。当精子与卵母细胞结合后，精子头部发生顶体反应，顶体外膜破裂，顶体酶释放。顶体酶是受精过程中重要的蛋白水解酶， 可溶解卵母细胞周围的放射冠和透明带，使精子穿过透明带与卵细胞融合完成受精。精子顶体酶活性降低可影响精子穿透卵母细胞透明带，从而导致不育。除精子自身质量之外，严重的生殖系统感染，也可造成精子顶体酶活性降低。目前在实验室对精子顶体酶活性检测的方法有免疫学测定与酶活性测定两大类，免疫学测定操作复杂且反映的是总酶含量，而不是总酶活性；酶活性测定以Kennedy法为代表，是检测对苯甲脒敏感的人精子精氨酸酰胺酶活性，它能反映几乎全部精子顶体酶活性。但Kennedy法操作比较烦琐精子在反应结束后必须再次离心分离，每标本均需设立测定和对照孔，批量检测时难以实现同步反应从而影响了检测结果的准确性，反应时间较长(3小时)等等。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种方法学特异、操作简单、易于批量化检测、能实现手工操作和半自动化批量检测、清洁环保的精子顶体酶活性定量检测方法和试剂盒。为解决上述技术问题，本发明提供一种精子顶体酶活性的固相滤膜检测方法，其特征在于，包括如下步骤将精子吸附于固相滤膜表面；以离心或倾倒的方法去除固相滤膜表面除精子之外的液体和杂质；启动顶体酶活性检测反应吸附于固相滤膜表面的精子与底物溶液接触，启动顶体酶活性检测反应；反应4 40°C反应30 120分钟；终止反应将底物与固相表面精子分离或者加入质控终止液；反应产物比色； 根据比色结果计算精子顶体酶活性。所述的一种精子顶体酶活性的固相滤膜检测方法，其特征在于，所述精子顶体酶活性的固相滤膜检测的同时，同步进行质控液检测，即使质控液与底物溶液在同样条件下反应相同时间后，加入终止液终止反应，然后对质控液的反应产物进行比色，并根据比色结果计算质控液顶体酶活性；所述将精子吸附于固相滤膜表面之前还可以包括如下步骤调整精子浓度；所述将精子吸附于固相滤膜表面之前还可以包括如下步骤以重量比为 0. 001% 10%具旋光性的氨基己酸高分子聚合物包被滤膜。
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所述的一种精子顶体酶活性的固相滤膜检测方法，其特征在于，所述固相滤膜孔径为0. 2 20 μ m ；所述底物溶液为重量比为0. 1 % 10% N α -苯甲酰-DL-精胺酸-P -硝酰基苯胺的醇溶性溶液；所述反应条件是孵育60分钟。所述的一种精子顶体酶活性的固相滤膜检测方法，其特征在于，所述质控终止液为重量比为每100毫升水含有0. 1-10克溶剂的苯甲脒或KF-950 水溶液；所述比色的方法包括以标准比色皿比色或以非标准比色容器比色；所述顶体酶活性的计算公式为精子标本测定标准比色皿比色顶体酶活性(μ IU/106精子)=(标本吸光度-试剂空白吸光度)Χ106)/[9·9Χ反应时间(分钟)X精子数量(106)]，或，非标准比色皿比色顶体酶活性(μ IU/106精子)=(标本吸光度-试剂空白吸光度)X (吸光度校准品的标准吸光度X IO6)/[吸光度标准品的实际吸光度Χ9.9Χ反应时间(分钟)X精子数量(106)]；质控液测定标准比色皿比色顶体酶活性(μ IU/5ul)=(质控吸光度-试剂空白吸光度)χ IO6)/[9. 9X反应时间(分钟)X加入质控液体积+5]，或，非标准比色皿比色顶体酶活性(yIU/5ul)=(质控吸光度-试剂空白吸光度)X (吸光度校准品的标准吸光度X IO6)/[吸光度标准品的实际吸光度Χ9.9Χ反应时间(分钟)X加入质控液体积+5]。本发明还提供一种精子顶体酶活性定量检测试剂盒，包括反应装置、精子洗液、缓冲液、底物溶液和质控终止液。还可以包括吸光度校准品、和/或微孔板条或试管，和/或泡沫板。本发明优选采用如下反应装置进行检测，这是一种离心分离反应装置，包括一端敞口的离心管10，其特征在于，还包括反应管20和底盖30 ；所述反应管20为中空管身21， 一端为可与装有试剂的测定管40可拆卸密封连接的敞口端211，另一端则为可安装固相滤膜50的带筛网223的端口 22 ；所述带筛网的端口 22的底端设有可与所述离心管10的敞口端可拆卸地密封连接从而连通反应管和离心管、也可与所述底盖30可拆卸地密封连接从而将带筛网的端口封堵的接口 222。所述反应管20的管身21和带筛网的端口 22为分体制造、拆卸连接。所述带筛网的端口 22两端均为敞口凹槽、中部横截面上一体成型有一个筛网 223，该筛网上设有多个网眼221 ；所述带筛网的端口 22的底端的凹槽壁形成所述接口 222、 所述反应管20的管身21可部分伸入并连接在所述带筛网的端口 22另一端的凹槽中。所述反应管20的管身21与带筛网的端口 22螺纹连接。所述离心分离反应装置还包括固相滤膜50，所述固相滤膜的孔径为0. 2 20 μ m。所述管身21下方，至少一层所述固相滤膜50紧贴在所述筛网223上。在所述固相滤膜50与所述管身21端面之间还设有弹性垫圈60。所述带筛网的端口 22的接口 222可密封插接在所述离心管10内；也可密封插接在所述底盖30内。所述底盖30中间为一个上表面为平面的柱状的塞柱32，在塞柱外、沿底盖边缘则为一圈连续的纵截面为U形的U形凹槽31 ；所述接口 222为可紧密适配于所述U形凹槽31 中的环形，所述塞柱32上表面可紧贴在所述筛网223下表面以防液体自网眼泄露。所述离心分离反应装置还包括装有试剂的测定管40，所述装有试剂的测定管40 一端敞口，敞口端可与所述反应管20的敞口端211螺纹连接。所述固相滤膜孔径为0. 2 20 μ m ；所述固相滤膜被重量比为0. 001% 10% 具旋光性的氨基己酸高分子聚合物包被，方法为所述固相滤膜被用重量比为0.001% 10%的有旋光性的氨基己酸高分子聚合物溶液浸泡，溶剂为PH5 9、浓度为0. 01 lmol/ L的磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、碳酸盐缓冲、醋酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液、硼酸缓冲液、 羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液的一种或其中至少两种的混合溶液，浸炮后的滤膜在烤箱内80°C以下烘干或晾干。所述精子洗液为渗透压200 400m0sm/kg的盐溶液，为等渗的氯化钠溶液、氯化钾溶液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、碳酸盐缓冲、醋酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液、硼酸缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的一种或其中至少二种的混合液；所述的缓冲液为含阴离子表面活性剂、pH5 9、浓度为0. 01 lmol/L的磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、碳酸盐缓冲、醋酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液、硼酸缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的一种或其中至少两种的混合溶液；所述的阴离子表面活性剂为脂肪酸盐、磺酸盐、硫酸酯盐或磷酸脂盐中的一种或其中至少两种的混合溶液；所述的底物溶液为含重量比为0. 10% Na-苯甲酰-DL-精胺酸-P-硝酰基苯胺的醇溶性溶液；所述的吸光度校准品为有色溶液，具体为在比色光径为1cm、波长为400 420nm 时比色，吸光度为0. 2 3的有色溶液，例如硝酰基苯胺溶液或对硝基酚溶液；所述的质控终止液为0. 10% (此处意思是每100毫升水中含有溶质0. 1-10 克)的苯甲脒水溶液或KF-950水溶液；所述的泡沫板为其孔直径与反应装置相适应的泡沫板。本发明的试剂盒可用于检测精子顶体酶活性的用途。本发明还提供了利用所述的试剂盒进行精子顶体酶活性的固相滤膜检测的具体方法，如下所述1)标本准备采集精液标本，待精液标本完全液化；以上泳法或密度梯度法收集高活力精子，或者以生理盐水洗涤精子；调整精子浓度为35 175 X 106/ml，然后加入到所述反应管20和离心管10结合起来的反应装置的反应管中，其中反应管带筛网的端口 22装有固相滤膜50， 加入反应管的精子数量为1 35 X IO6个；在水平式离心机上离心，使精子粘附在固相滤膜上，液体则容纳于离心管10中；移除离心管10，并以底盖30封紧反应管的带筛网的端口， 待用；2)检测步骤
临用前60min内，将装缓冲液的0. 4ml 1. 5ml/管的多个小管插入到泡沫板上， 在装有缓冲液的小管内加入所述底物溶液0. 05 0. 5ml,即反应液；设立并标记试剂空白管、质控管和测定管；试剂空白管拧紧管盖即可；质控管内加入质控液5 175 μ 1后，拧紧管盖；其余为精子顶体酶检测的测定管；将步骤1)得到的反应装置的反应管敞口端朝下与所述测定管敞口端结合在一起；轻轻来回颠倒泡沫板混合，翻转泡沫板使质控管内的反应液流入质控管的管底、测定管中的反应液则与反应管中固相滤膜上的精子接触、启动顶体酶活性检测反应； 40C -40°C准确孵育30 120min ；轻轻来回颠倒泡沫板混合，翻转泡沫板，使反应管的底盖端朝上、反应液与固相滤膜分离从而终止反应；并迅速在质控管中加入2 50 μ 1质控终止液，混勻即可；将小管中的液体转移至微孔板内，每测试均设复孔，每孔加入液量100 300μ 1， 依次在微孔内设立标准、试剂空白、质控和测定孔，标准孔每孔直接加入吸光度校准品相同的体积；进行吸光度值的测定；3)通过比色得到的吸光度值计算顶体酶活性IIU顶体酶活性=M°C每分钟水解1. Oymol BAPNA ；吸光度校准品的标准吸光度指吸光度校准品在光径lcm、405nm条件下的吸光度；待测精子标本顶体酶活性(μ υ/106精子)=(标本吸光度_试剂空白吸光度)X (吸光度校准品的标准吸光度X IO6)/[吸光度标准品的实际吸光度Χ9.9Χ反应时间(分钟)X精子数量(106)]，或=(标本吸光度-试剂空白吸光度)X IO6)/[9. 9X反应时间(分钟)X精子数量(106)]；质控液顶体酶活性(μ IU/5ul)=(质控吸光度-试剂空白吸光度)X (吸光度校准品的标准吸光度X IO6)/[吸光度标准品的实际吸光度Χ9.9Χ反应时间(分钟)Χ加入质控液体积+5]，或=(质控吸光度-试剂空白吸光度)X IO6)/[9. 9X反应时间(分钟)X加入质控液体积+5]；式中“9. 9”为BAPNA被顶体酶分解后的产物硝酰基苯胺的摩尔吸光系数，IO6表示将IU转换成uiu。本发明的质控液中顶体酶活性需位于试剂的检测范围内，在精液标本进行检测的同时同步检测质控液中顶体酶的活性，用于监测试剂是否失效、检测结果是否可信，便于实验室开展质量控制。本发明为固相BAPNA法，以有旋光性的氨基己酸高分子聚合物将待测精子固着于滤膜表面，通过特制的反应装置控制反应液与滤膜表面精子的接触与分离，达到实现检测精子顶体酶和终止反应的目的。检测被固相捕获的精子的精氨酸酰胺酶活性，精子顶体内的精氨酸酰胺酶活性可反映全部顶体酶的活性。Na -苯甲酰-DL-精胺酸-P -硝酰基苯胺 (ΒΑΡΝΑ)在精氨酸酰胺酶的作用下，分解产生黄色的硝酰基苯胺，通过测定硝酰基苯胺的产量推算出精氨酸酰胺酶的活性。本发明操作简单，灵敏度高，特异性强，适合临床使用，突出的技术效果在于
1、配备有反应装置，通过离心，可直接去除对检测反应有干扰的精浆，而待检精子则粘附在滤膜表面，反应完成后可直接吸取反应液进行测定，由于检测的是去除精浆后的精子，每标本不必设立标本对照管，从而简化了检测过程。2、通过翻转反应装置控制精子与反应液的接触与分离，实现了批量化同步检测、 准确控制反应时间、方便终产物比色，从而简化了操作步骤、提高了检测的准确性、缩短了检测时间。3、通过设立吸光度校准品，可实现最终反应产物在非标准的Icm光径条件下进行比色，检测手段灵活；吸光度校准品具有的固定吸光度值，可减少实验室间因比色仪引起的误差，使不同检测机构的检测结果一致、更具可比性。4、通过设立质控终止液，可检测顶体酶质控液，方便实验室进行室内质量控制和室间质量评价。5、由于操作简单、采用即用型试剂且性能稳定、无需特殊检测仪器，便于临床常规应用与推广。
图1是本发明反应装置的部件分解立体外形图。图2是本发明反应装置组装为离心装置的主视示意图。图3是图2的纵向剖视示意图。图4是本发明反应装置组装为检测装置的主视示意图。图5是图4的纵向剖视示意图。
具体实施例方式本发明优选采用如下反应装置进行精子顶体酶活性定量检测。如图1-5所示，是本发明的离心分离反应装置，主要包括离心管10、反应管20和底盖30，还可以包括装有试剂的测定管40、固相滤膜50和弹性垫圈60。所述离心管10 —端封闭、一端敞口，其敞口端(图1-3中所示的上端)可与反应管可拆卸连接。图1-5所示，所述反应管20为中空管身21，一端为可与装有试剂的测定管40可拆卸密封连接的敞口端211、另一端则为带筛网223的端口 22。为便于安装固相滤膜50、将固相(例如精子)与液体(例如精浆等液体)过滤，如图1、3、5，所述反应管20的管身21 和带筛网的端口 22为分体制造、并可拆卸地连接在一起，可采用螺纹连接。所述带筛网的端口 22两端均为敞口凹槽、中部横截面上一体成型有一个筛网223，该筛网上设有多个网眼221。所述带筛网的端口 22的底端的凹槽壁形成接口 222 ；而顶端的凹槽内则可安装固相滤膜50、弹性垫圈60，其凹槽壁则与反应管的管身21可密封适配，所述反应管20的管身 21可部分伸入并螺纹连接在该凹槽壁上。本发明的离心分离反应装置还可以包括固相滤膜50，所述固相滤膜的孔径为 0. 2 20 μ m，可以是滤纸或纤维素或醋酸纤维或硝酸纤维或再生纤维素或混合纤维素酯或玻璃纤维或聚碳酸酯或聚酰胺或尼龙或聚四氟乙烯或聚丙烯纤维或聚砜或聚偏二氟乙烯或聚氯乙烯等材质制成。固相滤膜20位于所述管身21下方，至少一层(通常为一层或二层，根据实验需要也可以为更多层)，所述固相滤膜50紧贴在所述筛网223上，为压紧固相滤膜50，在所述固相滤膜50的上表面安放有弹性垫圈60，所述管身21的下边缘压紧在弹性垫圈60上表面(如图3和图5所示)，从而将固相滤膜压紧。如图1、3、5所示，所述带筛网的端口 22的接口 222为环形，与所述离心管10或所述底盖30的连接为插接，在该具体实施方式
中，所述接口 222密封适配于所述离心管10内壁或所述底盖30的U形凹槽中。所述底盖30中间为一个上表面为平面的柱状的塞柱32， 在塞柱外、沿底盖边缘则为一圈连续的纵截面为U形的U形凹槽31 ；如图5所示，所述接口 222紧密适配于所述U形凹槽31中，这时，所述塞柱32上表面紧贴在所述筛网223下表面以防液体自网眼221泄露。利用该装置进行检测的工作过程是将所述反应管20的接口 222密封地插接到所述离心管10的敞口端内，反应管与离心管连通，形成离心装置，如图2和图3所示；需要离心的样品自反应管敞口端装入后进行离心，当离心完成后，待检测的固相(如精子)粘附在所述固相滤膜上表面，而液体(如精浆或其它杂质等)滤入离心管中；移除离心管，使接口 22紧密地插接到所述底盖30的U形凹槽中，底盖将反应管下端封堵，可防止液体向外泄露，将底盖30朝上，这时待检测的固相粘附在固相滤膜上不会掉下，取装有试剂的测定管40(其内装有反应试剂)，将装有试剂的测定管的敞口端螺纹连接在反应管20的敞口端 211，密封连接好后，形成了反应装置，再倒转为装有试剂的测定管朝上，试剂流到固相滤膜处与固相(例如精子)进行反应，如图4、5所不。实施例1一、制备本发明的精子顶体酶活性定量检测试剂盒1.安装反应装置1)称取磷酸二氢钾13. 61克溶于IL纯化水，称取12水磷酸氢二钠35. 814克溶于 IL纯化水，在pH计监测下，将二种溶液混合至pH值为7，此混合液即为pH7、0. lmol/L磷酸盐缓冲液。(PH7、0. lmol/L的磷酸盐缓冲液)2)称取L-氨基己酸-球蛋白聚合物0.5克，置于烧杯内，加入pH7、0. lmol/L磷酸盐缓冲液搅拌溶解后，用pH7、0. lmol/L磷酸盐缓冲液定容至1L，混勻后保存。(旋光性氨基己酸高分子聚合物的浓度为0.05%，表示每100毫升缓冲液中含有L-氨基己酸-球蛋白聚合物0. 05克)3)选取孔径5.0 μ m的聚四氟乙烯膜(PTFE)作为固相滤膜，将该膜浸泡于L-氨基己酸-球蛋白聚合物溶液内，取出后烤箱内80°C以下烘干或晾干。4)将上述幻得到的固相滤膜放入反应管带筛网的端口 22的筛网223上，在该端口上拧上管身21，并将离心管10扣在反应管20下部(即带筛网的端口 22上)，从而组成了离心装置，如图2和图3所示。2.配制精子洗液称取氯化钠8. 766克，置于烧杯内，加入适量纯化水搅拌溶解后，用纯化水定容至 1L，混勻后保存。(氯化钠溶液渗透压为300m0sm/kg。)3.配制缓冲液1)称取羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPEQ 23. 831克，加入适量纯化水搅拌溶解后，在 PH计监测下，用浓盐酸或浓氢氧化钠溶液调整pH值至7，用纯化水定容至1L。(pH7、0. lmol/
10L HEPES缓冲液)2)称取1克十二烷基硫酸钠(SDS)，溶入IL的pH7、0. lmol/L HEPES缓冲液内，搅拌混勻。(SDS浓度为0. 1%，表示每IOOml缓冲液内含有0. 1克SDS)4.配制底物溶液称取N α -苯甲酰-DL-精胺酸-P -硝酰基苯胺(ΒΑΡΝΑ) 10克，溶入IL的二甲基亚砜中，搅拌混勻。(ΒΑΡΝΑ浓度为1 %，表示每IOOml 二甲基亚砜内含有1克ΒΑΡΝΑ)5.配制吸光度校准品1)称取氢氧化钠4克，溶入IL的纯化水中。(氢氧化钠浓度为0. lmol/L)2)称取对硝基酚0. 01克，溶入IL的0. lmol/L氢氧化钠溶液中，用浓对硝基酚溶液或0. lmol/L氢氧化钠溶，调整其比色波长为405nm、比色光径为Icm时的吸光度为1。(对硝基酚溶液吸光度为1。)6.配制质控终止液称取苯甲脒或KF-950(4_胍基苯甲酸盐)50克，溶入IL纯化水中。7.泡沫板板上空间直径与反应管相适应，以能固定反应管为宜。8.微孔板条市购。从以上步骤可进一步量取、封装得到本发明的试剂盒
反应装置30套精子洗液3瓶100ml/瓶缓冲液45管0.8ml/管底物溶液1瓶IOml/瓶吸光度校准品1瓶IOml/瓶质控终止液1瓶0.15ml/瓶泡沫板1块微孔板条8孔/条12条以上试剂盒中每样物品的用量不限于以上公布的。二、用上述试剂盒进行精子顶体酶活性定量检测(一)标本准备1.受试者禁欲2-7天后，通过手淫法(或用特制的精液采集套以性交方式)留取全部精液标本，待精液标本完全液化后进行检测。标本室温放置不得超过3小时，勿将顶体酶待测标本冷冻或长时间冷藏。2.在离心管或试管中加入液化完全的新鲜精液标本anl，加入精子洗液細1，颠倒混勻或以巴氏管吹打混勻。3. 800g离心lOmin。去除上层液体，保留底部精子沉淀。4.加入0. 5ml精子洗液，使精子重新悬浮。5.充分混勻后准确计数，精子的浓度为35X 106/ml。6.向PTFE反应管底加入0. 2ml精子悬液，即加入的精子数量为7. OX IO6个。
7.在水平式离心机上1500g离心lOmin。8.移除反应装置底部的离心管10，以底盖30封紧反应管底端，待用。(二)检测步骤1.临用前60min内，将装有缓冲液的多支小管插入到泡沫板上，在装有缓冲液的小管内加入底物溶液o.ani (此为反应液)。以其中ι支装有反应液的小管作为试剂空白 (RB)，1支装有反应液的小管作为质控(QC)，另1支为测定精子顶体酶活性的测定管，在各小管管体上进行标本标记。本发明可不设同步的质控液检测、而单独进行精子顶体酶活性检测，而设质控液检测是为了更方便评估实验结果的准确性和可靠性等，实施例2、实施例 3也是如此。2.将经上述步骤(一)处理得到的反应装置倒转后，与装有反应液的测定管结合在一起，如图4和图5所示。试剂空白和质控无需使用反应装置，检测在装有反应液的测定管内完成。每次检测均需设置试剂空白(RB)将1支装有反应液的小管拧紧管盖即可；质控管OiC)在1支装有反应液的小管内加入质控液(含顶体酶的精浆，通过真空冷冻干燥制成冻干粉，使用前用纯化水复溶，复溶后其中顶体酶的活性需要在10 ΙΟΟΟμ IU/5ul范围内方可用于检测，本实施例中的质控液顶体酶活性为400-500 μ IU/5ul。)35 μ 1后，拧紧管盖即可。3.轻轻颠倒混合泡沫板2次，180°翻转泡沫板，使反应液流入PTFE管底，反应液接触反应管中固相滤膜上的精子，启动顶体酶活性检测反应，4°C准确孵育60min。4.轻轻颠倒混合泡沫板2次，180°翻转泡沫板，使反应液从固相滤膜分离从而终止反应。迅速在质控管OiC)中加入10μ1质控终止液，混勻。拧开、移出与测定管小管结合的反应管。5.将小管中的液体转移至微孔板内，每测试均设复孔，每孔加入液量200μ1。 依次在微孔内设立标准、试剂空白、质控和测定孔。标准孔每孔直接加入吸光度校准品 200 μ 1。6.酶标仪405nm比色，以空气作为空白，读取各孔吸光度为标本吸光度为1. 752， 试剂空白吸光度为0. 307，质控吸光度为1. 928，吸光度校准品的实际吸光度为0. 817。(非标准比色皿为比色光径不是Icm的其它比色皿，可用的比色皿种类很多，不限于酶标仪，实施例2、3也是如此。)7.分光光度计上比色波长为405nm，比色光径为1cm，以空白比色皿调零，读取各孔吸光度为标本吸光度为2. 144，试剂空白吸光度为0. 376，质控吸光度为2. 36。(标准比色皿为比色光径是Icm的比色皿，可用的比色皿种类很多，不限于分光光度计，实施例2、3 也是如此。)(三)结果计算1.酶标仪上读数后计算IIU顶体酶活性=4°C每分钟水解1. 0 μ mo 1 ΒΑΡΝΑ。PNP校准液在光径lcm、405nm条件下的吸光度=1. 0 (此处即为吸光度校准品的标
准吸光度)
待测标本顶体酶活性(μ υ/106精子)
=(标本吸光度一试剂空白吸光度)χ (吸光度校准品的标准吸光度XlO6)
/[吸光度标准品的实际吸光度x9.9x反应时间(分钟)χ精子数量(106)]
权利要求
1.一种精子顶体酶活性的固相滤膜检测方法，其特征在于，包括如下步骤 将精子吸附于固相滤膜表面；以离心或倾倒的方法去除固相滤膜表面除精子之外的液体和杂质； 启动顶体酶活性检测反应吸附于固相滤膜表面的精子与底物溶液接触，启动顶体酶活性检测反应；反应4 40°C反应30 120分钟； 终止反应将底物与固相表面精子分离或者加入质控终止液； 反应产物比色；根据比色结果计算精子顶体酶活性。
2.如权利要求1所述的一种精子顶体酶活性的固相滤膜检测方法，其特征在于， 所述精子顶体酶活性的固相滤膜检测的同时，同步进行质控液检测，即使质控液与底物溶液在同样条件下反应相同时间后，加入终止液终止反应，然后对质控液的反应产物进行比色，并根据比色结果计算质控液顶体酶活性；所述将精子吸附于固相滤膜表面之前还可以包括如下步骤调整精子浓度； 所述将精子吸附于固相滤膜表面之前还可以包括如下步骤以重量比为0. 001% 10 %具旋光性的氨基己酸高分子聚合物包被滤膜。
3.如权利要求1或2所述的一种精子顶体酶活性的固相滤膜检测方法，其特征在于， 所述固相滤膜孔径为0. 2 20 μ m ；所述底物溶液为重量比为0. 10%Να -苯甲酰-DL-精胺酸-P -硝酰基苯胺的醇溶性溶液；所述反应条件是孵育60分钟。
4.如权利要求1或2所述的一种精子顶体酶活性的固相滤膜检测方法，其特征在于， 所述质控终止液为重量比为每100毫升水含有0. 1-10克溶剂的苯甲脒或KF-950水溶液；所述比色的方法包括以标准比色皿比色或以非标准比色容器比色；所述顶体酶活性的计算公式为精子标本测定标准比色皿比色顶体酶活性(μ υ/ιο6精子)=(标本吸光度-试剂空白吸光度)Χ106)/[9·9Χ反应时间(分钟)X精子数量(106)]， 或，非标准比色皿比色顶体酶活性(μ υ/106精子)=(标本吸光度-试剂空白吸光度)X (吸光度校准品的标准吸光度X IO6)/[吸光度标准品的实际吸光度Χ9.9Χ反应时间(分钟)X精子数量(106)]；质控液测定标准比色皿比色顶体酶活性(μ IU/5ul)=(质控吸光度-试剂空白吸光度)Χ106)/[9.9Χ反应时间(分钟)Χ加入质控液体积+5]， 或，非标准比色皿比色顶体酶活性(μ IU/5ul)=(质控吸光度-试剂空白吸光度)X (吸光度校准品的标准吸光度XlO6)/[吸光度标准品的实际吸光度Χ9.9Χ反应时间(分钟)X加入质控液体积+5]。
5.一种用于权利要求1或2所述的固相滤膜检测方法的定量检测试剂盒，其特征在于，包括反应装置、精子洗液、缓冲液、底物溶液和质控终止液。
6.如权利5所述的精子顶体酶活性的定量检测试剂盒，其特征在于还包括吸光度校准品、和/或微孔板条或试管，和/或泡沫板。
7.如权利6所述的精子顶体酶活性定量检测试剂盒，其特征在于所述反应装置为离心分离反应装置，包括离心管(10)、反应管00)和底盖(30)；所述反应管00)为中空管身(21)，一端为可与装有试剂的测定管00)可拆卸密封连接的敞口端011)，另一端则为可安装固相滤膜(50)的带筛网的端口 02)；所述带筛网的端口 02)可与所述离心管(10) 的敞口端可拆卸地密封连接从而连通反应管和离心管，也可与所述底盖(30)可拆卸地密封连接从而将带筛网的端口封堵。
8.如权利7所述的精子顶体酶活性定量检测试剂盒，其特征在于，所述固相滤膜孔径为0. 2 20 μ m ；所述固相滤膜被重量比为0. 001% 10%具旋光性的氨基己酸高分子聚合物包被，方法为所述固相滤膜被用重量比为0. 001% 10%的有旋光性的氨基己酸高分子聚合物溶液浸泡，溶剂为PH5 9、浓度为0. 01 lmol/L的磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、碳酸盐缓冲、醋酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液、硼酸缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液的一种或其中至少两种的混合溶液，浸炮后的滤膜在烤箱内80°C以下烘干或晾干。
9.如权利5或6所述的精子顶体酶活性定量检测试剂盒，其特征在于所述精子洗液为渗透压200 400m0sm/kg的盐溶液，为等渗的氯化钠溶液、氯化钾溶液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、碳酸盐缓冲、醋酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液、硼酸缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的一种或其中至少二种的混合液；所述的缓冲液为含阴离子表面活性剂、PH5 9、浓度为0. 01 lmol/L的磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、碳酸盐缓冲、醋酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液、硼酸缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的一种或其中至少两种的混合溶液；所述的阴离子表面活性剂为脂肪酸盐、磺酸盐、硫酸酯盐或磷酸脂盐中的一种或其中至少两种的混合溶液；所述的底物溶液为含重量比为0. 1 % 10% N α -苯甲酰-DL-精胺酸-P -硝酰基苯胺的醇溶性溶液；所述的吸光度校准品为有色溶液，具体为在比色光径为1cm、波长为400 420nm时比色，吸光度为0. 2 3的有色溶液，例如硝酰基苯胺溶液或对硝基酚溶液；所述的质控终止液为0. 10%的苯甲脒水溶液或KF-950水溶液；所述的泡沫板为其孔直径与反应装置相适应的泡沫板。
10.利用权利要求7所述的试剂盒进行精子顶体酶活性的固相滤膜检测的具体方法为1)标本准备采集精液标本，待精液标本完全液化；以上泳法或密度梯度法收集高活力精子，或者以生理盐水洗涤精子；调整精子浓度为35 175 X 106/ml，然后加入到所述反应管Q0)和离心管(10)结合起来的反应装置的反应管中，其中反应管带筛网的端口 02)装有固相滤膜 (50)，加入反应管的精子数量为1 35X IO6个；在水平式离心机上离心，使精子粘附在固相滤膜上，液体则容纳于离心管(10)中；移除离心管(10)，并以底盖(30)封紧反应管的带筛网的端口，待用；2)检测步骤临用前60min内，将装缓冲液的0. 4ml 1. 5ml/管的多个小管插入到泡沫板上，在装有缓冲液的小管内加入所述底物溶液0. 05 0. 5ml,即反应液；设立并标记试剂空白管、质控管和测定管；试剂空白管拧紧管盖即可；质控管内加入质控液5 175 μ 1后，拧紧管盖； 其余为精子顶体酶检测的测定管；将步骤1)得到的反应装置的反应管敞口端朝下与所述测定管敞口端结合在一起；轻轻来回颠倒泡沫板混合，翻转泡沫板使质控管内的反应液流入质控管的管底、测定管中的反应液则与反应管中固相滤膜上的精子接触、启动顶体酶活性检测反应；4°C -40°C 准确孵育30 120min ；轻轻来回颠倒泡沫板混合，翻转泡沫板，使反应管的底盖端朝上、反应液与固相滤膜分离从而终止反应；并迅速在质控管中加入2 50μ 1质控终止液，混勻即可；将小管中的液体转移至微孔板内，每测试均设复孔，每孔加入液量100 300μ 1，依次在微孔内设立标准、试剂空白、质控和测定孔，标准孔每孔直接加入吸光度校准品相同的体积；进行吸光度值的测定；3)通过比色得到的吸光度值计算顶体酶活性IIU顶体酶活性=M°C每分钟水解1. 0 μ mo 1 ΒΑΡΝΑ ；吸光度校准品的标准吸光度指吸光度校准品在光径lcm、405nm条件下的吸光度；待测精子标本顶体酶活性(μ IU/106精子)=(标本吸光度-试剂空白吸光度)X (吸光度校准品的标准吸光度XlO6)/[吸光度标准品的实际吸光度Χ9.9Χ反应时间(分钟)X精子数量(106)]，或=(标本吸光度-试剂空白吸光度)Χ106)/[9.9Χ反应时间(分钟)X精子数量 (106)]；质控液顶体酶活性(μ IU/5ul)=(质控吸光度-试剂空白吸光度)X (吸光度校准品的标准吸光度X IO6)/[吸光度标准品的实际吸光度Χ9.9Χ反应时间(分钟)Χ加入质控液体积+5]，或=(质控吸光度-试剂空白吸光度)X IO6)/[9. 9X反应时间(分钟)Χ加入质控液体积+5]；式中“9. 9”为BAPNA被顶体酶分解后的产物硝酰基苯胺的摩尔吸光系数，IO6表示将 IU转换成uIU。
全文摘要
本发明涉及一种精子顶体酶活性的固相滤膜检测方法，包括将精子吸附于固相滤膜表面；以离心或倾倒的方法去除固相滤膜表面除精子之外的液体和杂质；启动顶体酶活性检测反应吸附于固相滤膜表面的精子与底物溶液接触，启动顶体酶活性检测反应；4～40℃反应30～120分钟；将底物与固相表面精子分离或者加入质控终止液；反应产物比色；通过比色得到的吸光光度值计算顶体酶活性；本发明还涉及一种精子顶体酶活性定量检测试剂盒。本发明配以专门的反应装置，操作简单、结果准确，检测手段灵活，便于批量化检测、易于推广应用。
文档编号G01N21/78GK102353672SQ20111018134
公开日2012年2月15日 申请日期2011年6月30日 优先权日2011年6月30日
发明者庄学敏, 张翔, 王希上, 程锦军, 胡家纯, 钟彩颜 申请人:深圳市博锐德生物科技有限公司
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