专利名称：单头灰飞虱中水稻黑条矮缩病毒的免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种专用于单头灰飞虱中水稻黑条矮缩病毒的免疫检测 试剂盒及其在农业上的应用，属于农业科学技术领域。
背景技术：
水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)是一 种由灰飞虱传播的病毒病害，侵染水稻引发水稻黑条矮缩�。疽坏└� 病便无收获。该病害自1963年在我国浙江省余姚县发现以来，上世纪主 要在浙江南部籼稻产区发生�：Γ诮盏染局鞑聪视蟹⑾�。 2004年初水稻条紋叶枯病在江苏等省爆发成灾，镇稻88、徐稻3号和盐 稻8号等一批抗病品种迅速大面积推广应用，对病害的整体防控便起到了 关键的作用。可是进一步的研究表明，这类水稻条紋叶枯病抗病品种对 RBSDV的抗性普遍较差，由于同一病原引发的玉米粗缩病近年来也处于流
行期为病害的发生提供了充足的毒源，加之灰飞虱发生量的连年增加，植 保专家预测水稻黑条矮缩病有发生流行�：Φ那痹诜缦�。果然RSV抗病品 种推广两年后水稻黑条矮缩病便在江苏等粳稻主产区发生流行，据江苏省 植保站统计截止2007年病害已在该省沿海、淮北及里下河的盐城、连云 港、泰州、淮安、扬州和徐州等地严重发生，当年发生危害的面积达30.8 万亩，而2008年水稻黑条矮缩病的发生面积则超过400万亩，病害爆发 流行的态势一触即发。
水稻黑条矮缩病是以灰飞虱传播的植物病毒�。� 一旦发病为害尚无药 可治，生产上多釆用"治虫防病"的应急防止策略。而灰飞虱的带毒虫量 是水稻黑条矮缩病发生流行的主要影响因子，因此建立一种快速灵敏检测灰飞虱带毒率的方法对于预测水稻黑条矮缩病的流行及病害防治等是十
分必要的。目前国际上用于检测灰飞虱带毒率的方法包括ELISA、 RT-PCR、 Northern杂交等，但RT-PCR和Northern成本高，不适于大批量检测样品； 制备RBSDV多抗建立斑点免疫法的RBSDV检测方法具有快速灵敏、简单易 行的特点，有望检测一种适合于我国基层农技人员应用的RBSDV检测技术， 在早期开展对带毒虫的早期检测并及时预警，同时还可以应用于RBSDV、 灰飞虱和植物寄主三者之间互作关系的基础领域的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种专用于单头灰飞虱中灰飞虱体内水稻黑条 矮缩病毒的检测试剂盒。
本发明的水稻黑条矮缩病检测试剂盒包括
1. RBSDV多克隆抗体RBSDV S10基因原核表达蛋白免疫兔获得多克隆抗 体(l: 3000 ~ 1: 5000 ),每单位1 ja 1;
2. 酶标二抗碱性磷酸脂酶标记的羊抗兔，其工作效价为(1:5000 ~1: 10000 )，每单位3-5 pl，用于检测灰飞虱携带的RBSDV;
3. 硝酸纤维素膜；
4. 包被液碳酸盐缓冲液(0. 05M, pH值为9. 6);
5. 洗液磷酸盐吐温缓冲液(PBST) ( 1000 ml 0. 01 M pH值为7. 5的PBS 中力口 0. 5 ml Tween-20);
6. 封闭液1%脱脂奶粉(0. 01 M PBST)或2%小牛血清蛋白(BSA) (0. 01 M PBST);
7. 显色液6mg4-氯-l-萘酚、2ml无水乙醇、10ml 0.02MPBS(pH7.4)、 7 Ml 30训A临用前混合，用于检测灰飞虱携带的RBSDV;
本发明提供的试剂盒的使用分为标准程序和简化程序。1.单头灰飞虱中水稻黑条矮缩病毒试剂盒标准程序，具体步骤为 1.1灰飞虱的准备
选择2龄以上单头灰飞虱用于携带水稻黑条矮缩病毒的检测，将灰飞
虱置于离心管中，用牙签捣烂，加100斗包被液，离心(5 000r/min) 3min， 取上清液(灰飞虱提取液)备用。 1.2 封闭
预先用铅笔将硝酸纤维素膜(NC)划成5mmx5mm的正方格，取3pL 4.1 获得的上清液点于NC膜上正方格内(以不超出正方格一半为准)；同时各 取3^iL左右提纯的水稻黑条矮缩病毒和蒸馏水点于膜上预先标记好正方格
内，分别作为阳性对照和阴性对照，室温晾干膜。将干燥的膜置于塑料盒 或玻璃培养皿，加入1°/。脱脂奶粉或2%小牛血清蛋白(BSA)封闭液，要求 将膜完全浸没，37'C轻轻摇晃，封闭30min。 1.3孵育
用镊子压住膜倒弃封闭液，以水稻黑条矮缩病毒多克隆抗体和封闭液 按(1:5 000 ~ 1:10 000 )比例稀释配制孵育液，将膜完全浸入孵育液， 37'C轻轻摇晃，孵育(l~1.5)h。用镊子压住膜倒弃孵育液，加入磷酸 盐Tween20缓冲液，将膜完全浸没，轻轻摇晃，洗膜(3 ~ 5 ) min，用镊子
压住膜倒弃洗液，重复洗膜三次。
1.4 二抗孵育
用镊子压住膜倒弃洗液，以辣根过氧化物酶标记的二抗和封闭液按 (1:2 000 ~ 1:3 000 )比例稀释配制孵育液，将膜完全浸入二抗孵育液， 37'C轻轻摇晃，孵育(1.5~2)h，再用镊子压住膜倒弃二抗孵育液。加 入磷酸盐Tween20缓冲液，将膜完全浸没，轻轻摇晃，洗膜(3 ~ 5 ) min, 用镊子压住膜倒弃洗液，重复洗膜三次。
1.5 显色用镊子压住膜倒弃洗液，加入显色液，37。C静置显色30min。以蒸馏 水冲洗膜，室温晾干。 1.6 结果
显色后首先观察对照的颜色反应，阳性对照应显蓝紫色，阴性对照应 不显色，再观察样品的颜色反应，如果显蓝紫色，则认定该头灰飞虱携带 水稻黑条矮缩病毒；如果不显色，则认定该头灰飞虱不携带水稻黑条矮缩 病毒。
2.单头灰飞虱携带水稻黑条矮缩病毒试剂盒简化程序，具体步骤为 2. l灰飞虱的准备
选择2龄以上单头灰飞虱用于携带水稻黑条矮缩病毒的检测，将灰飞 虱置于离心管中，用牙签捣烂，加100pL包被缓冲液摇句，上清液备用。 2.2封闭
预先用铅笔将硝酸纤维素膜(NC)划成5mmx5mm的正方格，用牙签蘸 少许5.1获得的上清液点于NC膜上正方格内(以不超出正方格一半为准)； 同时用牙签蘸少许提纯的水稻黑条矮缩病毒(也可用已釆用本方法测定为 阳性的带毒灰飞虱提取液)和蒸馏水点于膜上预先标记好正方格内，分别 作为阳性对照和阴性对照，室温晾干膜。将干燥的膜置于塑料盒或玻璃培 养皿，加入1%脱脂奶粉或2%小牛血清蛋白(BSA)封闭液，要求将膜完全 浸没，室温条件下(15°C~30°C)轻轻摇晃，封闭60min。 2.3孵育
用镊子压住膜倒弃封闭液，以水稻黑条矮缩病毒多克隆抗体和封闭液 按(1:5 000 ~ 1:10 000 )比例稀释配制孵育液，将膜完全浸入孵育液， 室温条件下轻轻摇晃，孵育3h。用镊子压住膜倒弃孵育液，加入磷酸盐 Tween20缓冲液，将膜完全浸没，轻轻摇晃，洗膜(3 ~ 5 ) min，用镊子压 住膜倒弃洗液，重复洗膜三次。2.4 二抗孵育
用镊子压住膜倒弃洗液，以辣根过氧化物酶标记的二抗和封闭液按 (1:2 000 ~ 1:3 000 )比例稀释配制孵育液，将膜完全浸入二抗孵育液， 室温条件下轻轻摇晃，孵育3h，再用镊子压住膜倒弃二抗孵育液。加入磷 酸盐Tween20缓冲液，将膜完全浸没，轻轻摇晃，洗膜(3 5)min，用镊
子压住膜倒弃洗液，重复洗膜三次。 2.5显色
用备 住^^#1#^鲁「如入显色液，室温条件下静置显色(1~2) h。以蒸馏水冲洗膜，室温晾干。 2.6结果
显色后首先观察对照的颜色反应，若阳性对照显现蓝紫色而阴性对照 未显现出蓝紫色时，观察检测样品的颜色反应，如果显现出蓝紫色，则认 定该头灰飞虱携带水稻黑条矮缩病毒；如果未显现出蓝紫色，则认定该头 灰飞虱不携带水稻黑条矮缩病毒。
本专利的原理是利用硝酸纤维素膜具有的强静电吸附力，在中性条件 下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子。因而，将抗原吸附于硝酸纤维素 膜后，就可利用膜作为固相载体进行抗原抗体反应。当加入抗体后，即可 与膜上的抗原结合，然后再加入带有标记物的抗抗体，使标记通过抗抗体 和相应抗体的结合间接地交联于纤维素膜上。最后加入标记物相应的底物 后，标记物即可与底物作用形成不溶性产物，呈现斑点状着色，从而判定结 果。而这一方法在单头灰飞虱中水稻黑条矮缩病毒的检测上使用迄今为止 尚未见报道。
利用水稻黑条矮缩病(RBSDV)特异性多克隆抗体建立了 一种斑点免疫 (DIBA)检测方法，以该方法建成了水稻黑条矮缩病的检测试剂盒，其主 要试剂均以工作液或浓缩液形式提供，具有使用方便、操作简单、检测快速灵敏、结果准确可靠等特点。
本发明试剂盒中提供的水稻黑条矮缩病毒的检测方法较原有的
RT-PCR、 Northern blot和常规ELASA检测方法具有更加经济、简便和快 捷的特点。同时本发明的水稻黑条矮缩病检测试剂盒的使用分为标准程序 和简化程序，可大大拓宽本试剂盒的使用范围和适用人群，便于将该项技 术推广应用至基层单位。另外水稻黑条矮缩病简化程序可以在不需要离心 机、摇床等仪器的非实验室条件下开展检测，这在全世界范围内均未见报 4---—
图1为本专利提供试剂盒标准程序检测单头灰飞虱带毒率结果示意图 (每方格代表一头灰飞虱，呈蓝紫色为带毒，否则为不带毒)
具体实施方法
实施例1，标准程序检测灰飞虱携带水稻黑条矮缩病毒 2008年6月从江苏省兴化县常年水稻黑条矮缩病发生区釆集龄次在3 龄以上的灰飞虱，采用单头灰飞虱中水稻黑条矮缩病毒的免疫试剂盒标准 检测方法，得到结果如图l，表明这一方法检测是可行的，其能够特异性检 测出单头灰飞虱中是否含有水稻黑条矮缩病毒。
本发明主要服务于水稻黑条矮缩病在水稻及带毒昆虫的快速准确检 观!l，可使基层及检疫部门及时对病害进行预测预报预警并制定总体防治策 略，即可防治高带毒率的灰飞虱的进一步扩散取食成灾，又可减少盲目用 药造成的农本增加和环境污染的加重。同时该项技术在病毒与传毒介体的 互作关系、品种的抗性鉴定及抗性遗传分析等方面也具有很大的应用价 值。鉴于国内外还没有一种适于基层农技部门使用及拥有自主知识产权的水稻黑条矮缩病的检测试剂盒，本发明可以说是对当前国内外现状的一个 及时填补。
上述实施不以任何形式限定本发明。
权利要求
1、一种用于单头灰飞虱中水稻黑条矮缩病毒的免疫检测试剂盒，其特征在于包含水稻黑条矮缩病毒多克隆抗体、酶标二抗、硝酸纤维素膜、包被液、封闭液、洗液和显色液。
2、 单头灰飞虱中水稻黑条矮缩病毒的免疫检测试剂盒的标准程序和 简化程序；其特征在于1)所述标准程序是在有离心机和水浴摇床 等仪器条件下进行了； 2)所述标准程序是不需要离心机和摇床等仪 器即可操作完成。
全文摘要
本发明公开了一种专用于单头灰飞虱中水稻黑条矮缩病毒的免疫检测试剂盒及其使用方法。利用水稻黑条矮缩病(RBSDV)特异性多克隆抗体建立了一种斑点免疫(DIBA)检测方法，以该方法建成了水稻黑条矮缩病的检测试剂盒，其主要试剂均以工作液或浓缩液形式提供，具有使用方便、操作简单等特点。同时本发明的水稻黑条矮缩病检测试剂盒的使用分为标准程序和简化程序，可大大拓宽本试剂盒的使用范围和适用人群，便于将该项技术推广应用至基层单位，进而应用于病害的预测预报和防治策略制定等领域。此外，还可在水稻黑条矮缩病品种抗性选育中用于测定接种强度等。
文档编号G01N33/544GK101430335SQ20081023503
公开日2009年5月13日 申请日期2008年11月13日 优先权日2008年11月13日
发明者任春梅, 彤 周, 周益军, 季英华, 熊如意, 程兆榜 申请人:江苏省农业科学院
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