专利名称：通过毛细管电泳进行的糖化血红蛋白分析及测定、用于毛细管电泳的缓冲液组合物及试剂盒的制作方法
通过毛细管电泳进行的糖化血红蛋白分析及测定、用于毛细管电泳的缓冲液组合物及试剂盒技术领域
本申请涉及通过毛细管电泳进行的糖化血红蛋白(具体而言血红蛋白AJ的分析及测定领域。
本发明涉及一种通过生物试样的毛细管电泳来进行分析的方法，该生物试样包含一种或若干种血红蛋白且具体而言一种或若干种糖化血红蛋白，以及涉及用于该分析的适当缓冲液组合物、及用于通过毛细管电泳进行的糖化血红蛋白的分析及测定的试剂盒。
背景技术：
血红蛋白(Hb)是通常包含四个亚单元的球形分子，各亚单元由结合至血红蛋白部分的多肽链构成。多肽链笼统地由名称血红蛋白分子的“珠蛋白部分”命名。
所有人类血红蛋白由四条多肽链构成，两条相同链为一组分成两组。在成年人类中，通常存在三种类型的血红蛋白血红蛋白A(HbA)，其占绝大多数(其通常代表成年人中的约97%血红蛋白)，其由2条α链及两条β链构成(血红蛋白α2β2)；血红蛋白A2(HbA2，其通常代表成年人中的约1-3%血红蛋白)，其由两条α链及两条δ链构成 (血红蛋白α2δ》；及胎儿血红蛋白(HbF)，其由两条α链及两条Υ链构成(血红蛋白 α 2 Υ2)，其仅存在痕量(在成年人中通常小于血红蛋白)且限于限制细胞群体(“F细胞”)。
血红蛋白含有称为次要物质的物质；其是糖化血红蛋白。
糖化血红蛋白(亦称为糖基化血红蛋白或糖基血红蛋白)对应于通过在珠蛋白的胺官能团(NH2)上结合糖(主要为葡萄糖)而修饰的血红蛋白分子组；血红蛋白的NH2基团与源自还原糖的醛基团发生缩合。随后通过阿马道里重排稳定此非酶促反应。潜在糖化位点是血红蛋白的四条珠蛋白链(视血红蛋白的类型为α链及β、S、或Υ链)的N-端氨基酸及血红蛋白的珠蛋白链中的游离氨基-ε基团(具体而言，赖氨酸残基的那些)。
存在许多形式的糖化血红蛋白；其视结合糖的数量、珠蛋白链及所述链上所结合糖的性质及所述糖于珠蛋白链上的位置而定。
当考虑任一 NH2S基上的糖化血红蛋白分子时，使用术语“总糖化血红蛋白”。
术语“血红蛋白Al (HbAl) ”是指有一个糖分子结合至蛋白质一或两条β链的N-端氨基酸的血红蛋白A分子。非均相的Al部分具体而言包含次要部分Ala、~b及尤其Alc;。血红蛋白Ala(HbAla)包括血红蛋白Alal (HbAlal)(其中结合至N-端氨基酸的糖是果糖1，6_二磷酸)及血红蛋白Ala2 (HbAla2)(其中结合至N-端氨基酸的糖是葡萄糖-6-磷酸)。在血红蛋白Alb(HbAlb)的情形下，结合至N-端氨基酸的糖是丙酮酸。最终，结合至血红蛋白A1JHbAJ 的β链的N-端氨基酸的糖是葡萄糖；HbA1。通过使一个葡萄糖分子与β链的N-端缬氨酸的NH2基团缩合获得，源自先前形成的不稳定醛亚胺(称为不稳定HbA1。或preAj的重排 (阿马道里重排)形成稳定酮-胺。
最终，术语血红蛋白Atl(HbAtl)通�：遣话岷现力铝吹腘-端位置处的氨基酸的糖的非糖化A血红蛋白及糖化A血红蛋白。
蛋白质糖化(包括糖化血红蛋白且具体而言血红蛋白A1。，以及其他)是由血液中过高浓度的糖造成(如同糖尿病的情形一般)。蛋白质的糖化会改变其功能，从而造成细胞损伤、组织损伤及血管老化，并参与若干疾病(例如，动脉硬化、肾机能不全、糖尿病性视网膜病及白内障)的发展。血红蛋白一旦糖化则不能充分运输氧。
在所包括的所有血红蛋白群及亚群中，HbA1。尤其令人感兴趣，此乃因其用作患者的糖尿病状态的长效标记。HbA1。的形成取决于血糖(血液中的葡萄糖浓度)。其参与红血细胞的寿命的整个过程，通常为120天。因而，HbAlc的血液浓度指示测定前2-3个月期间的平均血糖。HbA1。的血液浓度的评价可指示该阶段期间的长期高血糖症。HbA1。的血液浓度并不受血液葡萄糖含量的短期波动的影响。因而，通过测量两个日期之间的HbA1。含量， 可监测糖尿病的演化。
在糖尿病患者中，目的是获得与特征为良好血糖平衡的图表尽可能接近的HbAle 含量。在血液中，与A血红蛋白(糖化血红蛋白及非糖化血红蛋白)的总浓度相比，具有正常血糖的非糖尿病人类的参照值是4%至6% HbAleWPdO-AZmm0Vm0I ；Panteghini等人， 2007)。
因而，对糖化血红蛋白的检测、具体而言HbA1。含量升高的检测备受关注，用于诊断糖尿病(1型或2型)或监测糖尿病患者、具体而言用于评价抵抗糖尿病(1型或2型) 的治疗功效。
然而，阐释结果偶尔可较为困难，此乃因许多因素(具体而言异常血红蛋白的存在)可窜改所述结果。
实际上，在某些患者中出现称为“异常”或变体、具体而言由字母S、C、D、E、H及J 表示的血红蛋白。血红蛋白A部分或完全由一种或若干种异常血红蛋白替代。具体而言， 其源自某些珠蛋白链的合成减少和/或由于另一氨基酸取代一氨基酸而对α、β、Y或δ 链的结构的修饰。因而，β链的修饰可产生例如S或C血红蛋白(其中β链中6位置的谷氨酸分别经缬氨酸或赖氨酸取代的α 2 β 2血红蛋白)。
这些异常血红蛋白亦容易发生糖化。因而，存在与HbA1。一样包含一个结合至β 链上的N-端缬氨酸的葡萄糖分子的血红蛋白Sle(HbSle)及Cle(HbCle) (Abraham等人，1984)。
糖化血红蛋白且具体而言血红蛋白HbAle的分析及测定方法可分为2大类。
第一类(主要类)包括诸如免疫测定或亲和层析等方法。其是基于结合至血红蛋白的糖分子的结构特征。作为一实例，Wilson等人于1993的公开案及专利US 6，162，645阐述一种通过亲和层析测定人类血样中发现的糖化血红蛋白的方法。该方法是基于使用经由聚阴离子化合物(例如，聚丙烯酸)偶联至硼酸(boronic acid)、苯基硼酸、正硼酸(boric acid)或类似硼酸盐化合物的固体带正电相。当用该固相温育欲分析血样时，使该试样中存在的糖化血红蛋白分子的葡萄糖残基与硼酸盐化合物复合。由此将糖化血红蛋白分子接枝于固相上。随后可相对于未固定血红蛋白的比例对固定于固相上的糖化血红蛋白的比例进行定量。通过测量荧光的消光(Wilson等人，199 或通过使用针对人类血红蛋白的标记抗体(US 6，162, 645)实施此测定。
用于糖化血红蛋白分析及测定的第二类方法包括离子交换层析或电泳。其利用分子的理化特性且基于糖化蛋白质与非糖化蛋白质之间存在的电荷差。
在阐述于文献中的可测定糖化血红蛋白的各种分析方法中，电泳方法分成若干类凝胶分析包括聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦分析(Beccaria，1978 ；Simon, 1982 ； Stickland, 1982 ；Bosisio, 1994)及琼脂凝胶分析(US 5，246，558 ；US 4，222，836 ；Menard, 1980)。毛细管电泳分析包括等电聚焦分析(Molteni，1994 ；Hempe, 1994)、使用抗-A1。抗体的自由溶液分析(US 5，431，793)、使用裸毛细管的自由溶液分析(US 5，599，433)及使用动态涂布的自由溶液分析(EP O 733 900 A2 ；US 5，611，903)。
通过生物试样的电泳来进行的分析可分离试样中存在的各种蛋白质、具体而言各种血红蛋白，且使得能够测定生物试样中之一种或若干种目标蛋白质的量和/或比例。在毛细管电泳中，在填充有电解质的毛细管中，生物试样的蛋白质随其质量及其电荷的变化在电场效应下自阳极迁移至阴极。其由此产生包含一系列峰(亦称为部分)的电泳迁移曲线，所述峰的每一种对应于一种或若干种蛋白质。异常血红蛋白(例如HbS、HbC及HbE) 具有不同于HbA的电泳迁移率。此外，由于结合至β链的N-端氨基酸的糖残基，HbA1具有减少的等电点且因此具有稍微不同于其它HbAtl型血红蛋白的电荷。因而，在电泳场 (electrophoretic field)中或在离子交换树脂中，HbA1的迁移速率不同于HbAtl的迁移速率，这使得可分离具有不同电荷的HbA1与HbA。。
毛细管电泳的优势亦在于以下事实仅需要极少量欲分析的生物试样。此外，通过此技术的分离可极为快速，此乃因为在分离期间可使用高电压而不会造成试样加热过度。
在经涂布毛细管中实施通过等电聚焦的分析(Molteni，1994 ；Hempe, 1994)。使用甲基纤维素进行涂布。所用阴极电解质是氢氧化钠(NaOH)且阳极电解质是磷酸(H3PO4)15 通过使用两性电解质，此分析使得能够分离血红蛋白的各种变体，包括HbA1。，其峰极其接近 HbA的峰(ΔρΙ < 0. 10)。尽管此方法运行良好，但按常规并不易于实施且需极大精确度， 具体而言在两性电解质的PH范围方面(HbA1。的等电点(pi)极为接近HbAtlW等电点)。
在碱性ρΗ(ρΗ 8-10)的正硼酸盐(borate)缓冲液中，使用已与抗HbAle单克隆抗体反应的试样，实施利用抗-HbAle抗体的自由溶液分析(US 5，431，793)。更确切而言，使用未预先与抗-HbA1。抗体反应的工作试样产生第一电泳图。获得单峰，面积为X，其含有所有血红蛋白(包括HbAJ。通过分析已与抗-HbA1。抗体接触的工作试样获得第二电泳图。 由此分离未结合的抗-HbAle抗体、抗-HbAle抗体/HbAlc;复合物及未被抗体的复合的血红蛋白。随后通过第一电泳图的峰下面积与第二电泳图中未复合抗-HbA1。抗体的血红蛋白之峰下面积(面积为y)之间的差值(即χ-y值)来测定HbAle的量。由此证明此方法实施起来耗时且复杂。
使用裸毛细管的自由溶液分析方法(US 5，599，433)于碱性pH(pH9_12)下包括结合至血红蛋白的糖复合剂(正硼酸盐)及两性缓冲液(CAPQ。在所述条件下获得的曲线 (示于本申请的
图1中)显示HbA1的峰(在专利US-5，599，433中阐述为HbAle的峰)与 HbA0的峰(参见实施例1)的分离相当小。此外，已纯化次要部分的分析显示HbAla、Alb部分与HbA1。共迁移，此会干扰最终测定结果(参见本申请的实施例2及图幻。事实上，该技术分离HbAtl与HbA1部分，但不分离HbA1部分本身。
利用动态双涂布的毛细管分析的技术(EP 0 733 900 A2 ;US5，611，903)仅用于基于市售毛细管电泳(Analis CEofix HbAlc试剂盒)的测试。其由用含有聚阳离子的 “起始剂”(存于溶液中，PH 4.6)首次洗涤毛细管组成，从而用该聚阳离子涂布毛细管壁。随后利用含有聚阴离子的分析缓冲液(PH 4.6)实施第二次洗涤，其具有通过与聚阳离子相互作用提供第二涂布层的效应。则毛细管内壁上存在的负电荷的量甚至比裸毛细管上的高，从而产生更高电渗回流(electroosmotic flux)。所分析的各种形式的血红蛋白(包括糖化Al血红蛋白)之间获得的拆分是令人满意的，且分析时间较短。自实践角度来讲，必须在每一分析之间使用由试剂盒制造商提供的精确程序重新施加此双重涂布，但该程序仅针对单毛细管设备((P/ACE，Beckman)，不适于常规分析)阐述。
因而，需要可有效分离糖化血红蛋白(具体而言HbAJ与含有其它血红蛋白的生物试样中存在的其它血红蛋白、变体、干扰形式(不稳定形式、乙酰化形式、氨甲酰化形式) 及其它次要部分(尤其HbAla及HbAlb)的试剂及简单实践方法。理想地，此一方法可直接自所得电泳曲线实施糖化血红蛋白(具体而言HbAJ的半定量或定量测定。发明内容
本发明提出一种替代性毛细管电泳方法，其使得可对一种或若干种糖化血红蛋白实施半定量或定量分析，该糖化血红蛋白包含于包含(具体而言)其它血红蛋白(糖化和 /或非糖化)的生物试样中且包含至少一条珠蛋白链，该珠蛋白链包含结合至N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基。本发明的所述方法利用结合至所述糖化血红蛋白的葡萄糖分子的结构特性及试样的各种血红蛋白之间存在的电荷差。
本发明者已显示，通过使用特定缓冲液组合物可获得糖化血红蛋白的大大改良的分离、且更具体而言HbA1。的大大改良的分离，所述糖化血红蛋白包含结合至至少一条珠蛋白链上、且具体而言链β上的N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基。
本发明方法的优势之一的由于使用该缓冲液组合物，故对应于存于生物试样中的一种或若干种类型的目标糖化血红蛋白(一种或若干种类型的血红蛋白，其包含结合至至少一条珠蛋白链上的N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基，例如HbAJ的电泳峰相对于不使用缓冲液组合物时可获得的峰位置发生位移。此位移并不干扰试样中其它蛋白质、具体而言其它血红蛋白(糖化和/或非糖化)的分离。具体而言，此使得可分离HbA1。与其它次要HbA1 (具体而言HbAla及HbAlb)。因此，意味着分析结果可可靠地读取且可使得准确测定一种或若干种目标糖化血红蛋白，所述糖化血红蛋白包含一个或若干个葡萄糖残基，其中一个葡萄糖结合至至少一条珠蛋白链的N-端位置处的氨基酸(例如，血红蛋白AJ。
因而，本发明方法是用于建立糖尿病患者的诊断或监测、具体而言用于评价抗糖尿病治疗效力的所选方法。
因而，本申请提供一种通过糖化血红蛋白(一种或若干种糖化血红蛋白)的毛细管电泳来进行分析的方法，所述糖化血红蛋白包含一个或若干个葡萄糖残基且包含于包含一种或若干种血红蛋白的生物试样中，该方法包括使用包含至少一种化合物的缓冲液组合物，该化合物能够专一性复合生物试样的糖化血红蛋白(一种或若干种糖化血红蛋白)的葡萄糖残基(一个或若干个残基)并且于碱性ΡΗ(即大于7的ρΗ)下提供所述糖化血红蛋白若干负电荷。
本申请上下文中所用术语“若干”意指至少两个、即两个或多于两个，例如，2个、3 个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个。
本申请上下文中所用术语“至少一个”意指一个或若干。
本申请上下文中所用术语“血红蛋白”意指血红蛋白的任一形式或部分(包括次要部分)(不管其正常或异常)、以及所述血红蛋白的许多变体(已阐述至少1000种血红蛋白变体)。
本申请上下文中所用术语“糖化血红蛋白”意指任何通过将一个或若干个糖(具体而言，一个或若干个葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖1，6- 二磷酸或丙酮酸)结合至一条或若干条珠蛋白链(任何珠蛋白链)来修饰的血红蛋白。可将所述糖结合至珠蛋白链上的 N-端位置处的氨基酸和/或结合至具有游离氨基酸基团的氨基酸(例如，赖氨酸)。
本申请中所用术语“珠蛋白链”意指本领域技术人员已知的任一珠蛋白链、具体而言选自alpha(a)、beta(i3)、delta(S)及gamma(Y)链的链(不管其正常或异常)、或所述链中之一的变体。根据一特定实施方式，所述“珠蛋白链”是β链，例如A1血红蛋白(具体而言、。、S或C)的β链。
当在本发明实施方式中提及“糖化血红蛋白”时，应了解，所述实施方式对本申请中引用的每一特定类型的糖化血红蛋白具有特定应用。
除非另有说明，否则本申请中所示的每一实施方式皆可独立地和/或与任何一个或若干个其它所述实施方式组合使用。
本发明的毛细管电泳分析方法适用于包含至少一种糖化血红蛋白的生物试样，该糖化血红蛋白包含一个或若干个葡萄糖残基且必须包含结合至一条或若干条珠蛋白链上且具体而言在β链上N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基。在本申请中，所述血红蛋白称为“在N-端位置糖化的血红蛋白”。
所述方法使得可分离一种或若干种在N-端位置糖化的血红蛋白与其它糖化血红蛋白(即，其中珠蛋白链无结合至N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基的糖化血红蛋白)或非糖化血红蛋白(其可存在于所分析的生物试样中)。
根据一特定实施方式，β链上N-端位置处的氨基酸是缬氨酸。
在一优选实施方式中，本发明的分析方法欲用于分析包含血红蛋白Alc;的生物试样。具体而言，其适于分离血红蛋白A1。与所分析生物试样中可能存在的其它血红蛋白或其它血红蛋白(以不同方式糖化或非糖化)以及具体而言其它次要部分(例如与HbAla& HbAlb 分离)。
根据一特定实施方式，本发明的分析方法可分离血红蛋白S1。和/或血红蛋白Clc; 与所分析生物试样中可存在的其它血红蛋白(以不同方式糖化或非糖化)。
术语“缓冲液组合物”意指尽管添加少量酸或碱或尽管稀释仍保留大约相同pH的组合物、具体而言溶液。
在本申请中使用术语“复合”(“to complex”或“complexing”)表示在两个实体之间、具体而言在两个分子(例如，小分子及大分子)之间经由官能团发生缔合(化学或仅仅物理缔合)。
在一优选实施方式中，该两个实体中之一(能够复合葡萄糖残基的化合物)与来自另一实体(糖化血红蛋白)的葡萄糖残基的顺式-二醇基团、具体而言两个邻位羟基组合(例如，与其反应)。
如可在“实施例”部分中所见，“专一性复合一种或若干种糖化血红蛋白的葡萄糖残基并且在碱性PH下为所述糖化血红蛋白提供负电荷”在本申请中意指本发明上下文中所用化合物使得对应于在N-端位置由葡萄糖糖化的血红蛋白的电泳迁移峰可位移出对应于在N-端位置由另一糖(例如，葡萄糖-6-磷酸、果糖1，6_ 二磷酸或丙酮酸)糖化的血红蛋白的电泳迁移区以外，且优选可位移出对应于试样中其它血红蛋白的电泳迁移峰的区域以外。因而，不包含与β链的N-端氨基酸结合的任一葡萄糖残基的次要部分(具体而言Ala 及Alb部分)并不干扰根据本发明方法进行的HbAlc;分析。
作为一实例，在本发明上下文中，可使用以下测试证实化合物专一性复合一种或若干种糖化血红蛋白的葡萄糖残基并在碱性PH下提供负电荷的能力将含有糖化血红蛋白的各种纯化部分且具体而言A0及Aic部分或ApAlb及Ala部分的参考试样(例如，“HbAla、 HbA11^g合物”、“A1。”及“A。”，来自Exocell，USA)引入含有以下缓冲液组合物的毛细管电泳毛细管中200mM CHES、20mM腐胺、IOmM与120mM之间(例如，30mM或50mM)的测试化合物、(若需要)2. 5g/l氯化钠、水、及(若需要)将pH值调节至大于9 (例如9. 4)的碱。随后使用例如Capillaries (Sebia)设备于415nm的波长下实施裸毛细管自由溶液毛细管电泳。其后，研究所得电泳曲线；若对应于HbA1。的峰与对应于HbAtlW峰之间(或者视所用试样的类型，对应于HbAle的峰与对应于HbApHbAlb及HbAla的峰之间)的分离完全，则在本发明意义上，测试化合物被视为能够专一性复合葡萄糖残基并能够在碱性PH下提供负电荷。 相反，若对应于HbAle的峰及对应于HbAlb的峰(或者视所用试样的类型，对应于HbAle的峰及对应于HbApHbAlb及HbAla的峰)迭置或重迭，则该测试化合物不被视为适用于实施本发明。
上文所示测试中的测试化合物的浓度仅以指示方式给出；若在上文所示测试上下文中，浓度为IOmM至120mM的测试化合物不能在对应于HbAle的峰与对应于试样的其它血红蛋白的峰的间产生足够分离，则为获得对应于HbAlc;的峰的最佳分离可超出此浓度范围。
在本发明上下文中可使用任一化合物(即，通常为有机分子)、任一抗体、多肽、 肽、或在本发明意义上能够专一性复合葡萄糖残基并在碱性PH下提供负电荷的任意其它化合物。可使用本领域技术人员已知的任一方法产生适当抗体且其可为例如多克隆或单克隆抗体、嵌合抗体或抗体片段(例如，Fab片段)。
如可在“实施例”部分中所见，正硼酸(boric acid)并非在本发明意义上能够专一性复合葡萄糖残基并在碱性PH下提供负电荷的化合物，此乃因其并不使得可实施可靠分析且具体而言糖化血红蛋白且(具体而言)HbA1。的可靠测定。下文更详细定义适当化合物的实例。
与能够专一性复合葡萄糖残基的化合物复合的每一葡萄糖残基与不同化合物分子相互作用。
根据一特定实施方式，当所述化合物以足量存于本发明缓冲液组合物中时，其尤其能够专一性复合糖化血红蛋白的N-端葡萄糖残基，即对于包含结合至N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基的每一珠蛋白链(具体而言β链)而言，能够专一性复合该葡萄糖残基。因而，该化合物能够专一性复合在A1。血红蛋白或S1。或C1。血红蛋白的β链上的N-端位置处结合的每一葡萄糖残基。
根据一特定实施方式，当在本发明缓冲液组合物中存在足量该化合物时，其能够专一性复合在N-端位置处由葡萄糖糖化的血红蛋白的所有葡萄糖残基。
根据一特定实施方式，当在本发明缓冲液组合物中存在足量该化合物时，不管其在珠蛋白链上的位置如何，该化合物均能够专一性复合血红蛋白的所有葡萄糖残基。因而， 当该化合物在本发明缓冲液组合物中存在足量时，包含数量为X的葡萄糖残基的血红蛋白分子可结合数量为X的该化合物分子。
通过与生物试样中糖化血红蛋白的一个或若干个葡萄糖残基专一性复合，该化合物在碱性PH下提供所述糖化血红蛋白或多种血红蛋白若干负电荷，即，使得这些糖化血红蛋白于碱性PH下能够带有额外负电荷。
所述化合物可使与其复合的相同血红蛋白的每一葡萄糖残基皆于碱性pH下带有若干负电荷。由于在碱性PH下这种负电荷供应，故由于包含至少一个葡萄糖残基的血红蛋白与所述化合物复合，其电泳迁移率得以改良。这在电泳曲线上通过对应于糖化血红蛋白的电泳峰的位移来表现，所述糖化血红蛋白包含一个或若干个葡萄糖残基且存在于所分析的生物试样中。
包含至少一个葡萄糖残基且存于生物试样中的所有血红蛋白与复合葡萄糖并于碱性PH下提供负电荷的化合物形成复合物(当然，前提条件为该化合物存在足量以与这些血红蛋白中每一种复合)。然而，不同血红蛋白且具体而言包含至少一个葡萄糖残基的不同血红蛋白均具有不同等电点(由于其珠蛋白链的性质、这些珠蛋白链上的葡萄糖残基的数量及位置、及可结合至该血红蛋白的其它糖的数量、性质及位置)。由于通过每一葡萄糖残基与该化合物复合而在碱性PH下提供负电荷，这些不同血红蛋白之间的电荷差异在其呈与该化合物复合的形式时甚至更显著。
包括结合至糖化血红蛋白的珠蛋白链的至少一个上(具体而言在β链上)的 N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基的糖化血红蛋白因此比其它血红蛋白(不同糖化或非糖化)多至少一个葡萄糖。具体而言，血红蛋白A1。在β链上比血红蛋白Al的其它次要部分多至少一个葡萄糖。因此，这些在N-端位置处糖化的血红蛋白当根据本发明与该化合物复合时在碱性PH下载有比其它血红蛋白(不包含结合至珠蛋白链的N-端氨基酸的葡萄糖残基的糖化血红蛋白或非糖化血红蛋白)更多的负电荷。
因而，通过增大包含葡萄糖的不同血红蛋白之间和/或包含葡萄糖的一种或若干种血红蛋白与所分析生物试样中存在的其它血红蛋白之间存在的电泳迁移率之差，可在 N-端位置处糖化的一种或若干种血红蛋白与该试样中可能存在的其它血红蛋白之间、具体而言在血红蛋白Ale与该试样中可能存在的血红蛋白A1血红蛋白的其它次要部分之间达成更好分离。
因而，本发明方法可有效分离在N-端位置糖化的血红蛋白(具体而言HbAJ与含有其它血红蛋白的生物试样中存在的其它血红蛋白、某些变体及其它次要部分。此外，常规干扰分子(例如，不稳定、乙酰化或氨甲酰化形式)并不干扰使用本发明方法的HbA1。的测定。具体而言，本发明方法使得能够在电泳分离步骤期间避免干扰，所述干扰可能是在碱性 PH下不存在通过复合提供的负电荷时由血红蛋白A1。及生物试样中存在的血红蛋白A1的其它次要部分(包括HbAla及HbAlb)的共迁移所致。
随后可在所分析生物试样中可存在的另一或其它血红蛋白存在下测定N-端位置处糖化的经分离血红蛋白。因而，作为一实例，可在血红蛋白A1的其它次要部分存在下且具体而言在HbAla和/或HbAlb存在下测定HbA1。，且所分析生物试样中存在的这些其它次要部分不干扰该测定。
本申请中的术语“测定”(“to assay”或“assay”)意指可能在所分析生物试样的一种或若干种其它血红蛋白存在下测定目标血红蛋白或多种目标血红蛋白的量和/或测定所述目标血红蛋白相对于该试样中存在的血红蛋白总量或某些血红蛋白之量的比例。
在本发明上下文中实施的测定可为半定量测定，因而，测量给定血红蛋白相对于该试样中存在的另一血红蛋白或其它血红蛋白之量的百分比。因而，在HbA1。情形下，通常测量HbAle相对于一种或若干种其它A血红蛋白之量的百分比；通常用对应于HbAle的电泳峰面积除以对应于HbAtl的峰面积或除以(对应于HbAle的峰面积+对应于HbAtl的峰面积) 之和、或除以所有HbA峰面积之和或除以(对应于HbAle的峰面积+对应于HbAtl的峰面积+ 对应于HbA2的峰面积)之和、或甚至除以电泳曲线的总表面积。
测定亦可为定量测定；随后以该生物试样中存在的给定血红蛋白的毫摩尔数 (mmol)/摩尔另一血红蛋白或其它血红蛋白、例如以HbAle的毫摩尔数/摩尔HbA来表示所述结果。
根据本发明的一特定实施方式，专一性复合糖化血红蛋白的葡萄糖残基并使所述糖化血红蛋白在碱性PH下具有负电荷的化合物包含若干官能团、具体而言两个或两个以上官能团。
所述官能团中的至少一个通过与(例如)葡萄糖残基的顺式-二醇基团、具体而言两个邻位羟基相互作用而专一性复合葡萄糖残基(具体而言，结合至珠蛋白链上N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基)。作为一实例，该(这些)基团可为硼酸根基团、具体而言如本申请中所定义的硼酸根基团。
所述葡萄糖复合基团可使糖化血红蛋白中每个复合葡萄糖残基皆在碱性pH下具有一个负电荷，即，使每个复合血红蛋白分子皆在碱性PH下具有一个或若干个负电荷(若血红蛋白分子仅包含一个葡萄糖残基则有一个负电荷，且若血红蛋白分子包含η个葡萄糖残基则有η个负电荷)。
该化合物的另一官能团、其它官能团之一、或其它官能团(即，不与葡萄糖复合的官能团)可使糖化血红蛋白中的该血红蛋白分子的每个经复合葡萄糖残基皆在碱性PH下具有一个或若干个负电荷。
因而，在本发明的此特定实施方式中，每个根据本发明专一性复合葡萄糖残基的化合物分子皆包含至少一个能够复合糖化血红蛋白的葡萄糖残基(且具体而言在N-端位置糖化的血红蛋白的N-端葡萄糖残基)的官能团及至少一个并不复合葡萄糖但使得该糖化血红蛋白能够在碱性PH下带有多个额外负电荷的官能团，这是因为该官能团使该糖化血红蛋白在碱性PH下具有一个或若干个补加负电荷。能够复合葡萄糖的官能团亦可在碱性PH下提供负电荷。
根据本发明的一特定实施方式，专一性复合葡萄糖残基并于碱性pH下提供负电荷的化合物(更确切而言该化合物的每一分子)可使糖化血红蛋白分子(且具体而言在 N-端位置处糖化的血红蛋白)中该糖化血红蛋白分子的每一经复合葡萄糖残基皆在碱性 PH下具有若干负电荷。优选地，其使一个糖化血红蛋白分子中的每一复合葡萄糖残基皆在碱性PH下具有至少两个(具体而言2个、3个、4个、5个或6个)负电荷。
根据本发明的一特定实施方式，专一性复合葡萄糖残基的一官能团或官能团中的至少一个在碱性PH下带有负电荷。
根据本发明的一特定实施方式，能够专一性复合糖化血红蛋白的葡萄糖残基并能使所述糖化血红蛋白在碱性PH下具有负电荷的化合物包含一个或若干个可在碱性pH下离子化(具体而言可阴离子化)的基团。该化合物可为各种类型。举例而言，该化合物可包含一个或若干个羧酸根、羧基、磺酸根和/或磺酰基。具体而言，该化合物可为多羧酸、具体而言二羧酸或三羧酸。该化合物亦可为聚磺酸，具体而言二磺酸或三磺酸。
根据本发明的一特定实施方式，可使糖化血红蛋白分子中该糖化血红蛋白分子的每一复合葡萄糖残基在碱性PH下具有一个或若干个负电荷的基团、多个基团之一或多个基团包含一个或若干个可在如本申请中所定义碱性PH下离子化的基团且具体而言一个或若干个(具体而言2个或3个)羧酸根、羧基、磺酸根和/或磺酰基或由其组成。
根据本发明的一特定实施方式，专一性复合葡萄糖残基的一基团、所述基团之一或所述基团包含一个或若干个硼酸根基团或由其组成。
在本申请中，术语“硼酸根基团(boronate group) ”意指具有下式的基团
权利要求
1.一种通过一种或若干种糖化血红蛋白的毛细管电泳来进行分析的方法，所述糖化血红蛋白包含于含有血红蛋白的生物试样中且包含至少一条珠蛋白链、具体而言β链，该珠蛋白链包含结合至N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基，所述方法包括使用包含至少一种化合物的缓冲液组合物，该化合物能够专一性复合该生物试样中的糖化血红蛋白的葡萄糖残基、具体而言结合至糖化血红蛋白中所述N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基并能使所述糖化血红蛋白在碱性PH下具有若干负电荷。
2.如权利要求1所述的方法，其用于通过毛细管电泳分析包含于含有血红蛋白的生物试样中的血红蛋白Alc;。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述能够专一性复合该生物试样中的糖化血红蛋白的葡萄糖残基并能在碱性PH下提供负电荷的化合物包含两个或多于两个的官能团， 所述官能团中的至少一种专一性复合一个或若干个葡萄糖残基，另一官能团、其它官能团之一或所有其它官能团使所述糖化血红蛋白在碱性PH下具有一个或若干个负电荷。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述能够专一性复合该生物试样中的糖化血红蛋白的葡萄糖残基并能在碱性PH下提供负电荷的化合物包含一个或若干个在碱性PH下可阴离子化的基团，具体而言一个或若干个羧酸根、羧基、磺酸根和/或磺酰基。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述能够专一性复合该生物试样中的糖化血红蛋白的葡萄糖残基并能在碱性PH下提供负电荷的化合物包含一个(或多个)硼酸基和/或硼酸根基团，且具体而言是(i)硼酸根基化合物，其具有通式RB (OH) 2或RB (OH) ”其中基团R包含至少一个芳基和 /或烷基(直链、支链或环状)和/或芳烷基和/或其它官能团或杂原子、和/或其组合，且所述基团R使糖化血红蛋白中与该硼酸根基团复合的每一葡萄糖残基在碱性PH下具有一个或若干个负电荷；或( )所述硼酸根基化合物的盐。
6.如权利要求5所述的方法，其中该硼酸根基化合物是多取代的苯基硼酸酯、具体而言是经例如羧基和/或磺酰基基团二取代的苯基硼酸酯，且更具体而言是基团R为二酸、优选二羧酸的化合物。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中该硼酸根基化合物是二羧基苯基硼酸，优选选自 3,4- 二羧基苯基硼酸及3，5- 二羧基苯基硼酸，更优选为3，5- 二羧基苯基硼酸。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在该缓冲液组合物中所述能够专一性复合该生物试样中的糖化血红蛋白的葡萄糖残基并能在碱性PH下提供负电荷的化合物的浓度相对于蛋白质的总量、相对于该生物试样中存在的所有血红蛋白的总量或相对于该生物试样中存在的所有包含葡萄糖的血红蛋白的总量在化学计量上过量。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在该缓冲液组合物中所述能够专一性复合该生物试样中的糖化血红蛋白的葡萄糖残基并能在碱性PH下提供负电荷的化合物的浓度在0. IOmM至IOOmM范围内、优选在IOmM至60mM范围内、且更优选在20mM至50mM范围内，例如30mM。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述缓冲液组合物还包含阻流剂， 具体而言所述阻流剂是脂族二胺、更具体而言所述阻流剂是选自以下的脂族二胺1，3_ 二氨基丙烷、1，4_ 二氨基丁烷(腐胺)、1，5_ 二氨基戊烷(尸胺)、1，6_ 二氨基己烷、精胺及DETA，或所述脂族二胺的衍生物，例如脂族聚胺、环状聚胺或脂族二胺盐、或其混合物之一， 且仍更具体而言所述阻流剂是腐胺或衍生物。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述缓冲液组合物中的阻流剂的浓度在0.IOmM至 40mM范围内、优选在IOmM至30mM范围内且更优选在15mM至25mM范围内，例如20mM。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述缓冲液组合物还包含-缓冲化合物，其pKa在8. 0至11. 0范围内；和/或-碱；和/或-盐，具体而言钠盐，例如氯化钠；和/或-适当的稀释溶液，例如水。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述缓冲化合物是两性离子化合物，具体而言选自 AMP、AMPD, AMPSO, N- 二甘氨酸、CABS、CAPS、CAPSO, CHES, HEPBS,甲胺、TABS、TAPS、氨基乙磺酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸及iTris的化合物，例如CHES、CAPS或CAPS0。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述缓冲液组合物中的所述缓冲化合物的浓度在20mM至500mM范围内、优选在50mM至400mM范围内且更优选在150mM至300mM范围内，例如200mM。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述缓冲液组合物的pH为9或更大、优选在9. 0至11. 0范围内且pH更优选在9. 0至10. 0范围内，例如pH为9. 4。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其包括以下步骤a)将所述缓冲液组合物及生物试样引入电泳毛细管中；及b)通过毛细管电泳分离所述生物试样的各成分。
17.如权利要求16所述的方法，其中在分离所述生物试样中各成分的步骤后实施检测该生物试样中所存在的一种或若干种血红蛋白的步骤。
18.如权利要求16或17所述的方法，其还包括自与所检测血红蛋白之量成比例的检测信号产生电泳图的步骤。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其还包括如下步骤具体而言自如权利要求18中所定义的电泳图测定所述生物试样中所存在的一种或若干种血红蛋白的量和/ 或该生物试样中所存在的一种或若干种血红蛋白相对于该生物试样中存在的蛋白质总量、 血红蛋白的总量或某些血红蛋白的量的比例。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其还包括相对于一种或若干种标准化校正剂对所述生物试样中存在的一种或若干种血红蛋白进行定量的步骤。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述生物试样是血样、具体而言正常或不正常血样、经洗涤、经倾析、经离心血样或全血血样，若适当所述试样经溶血。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中将所述生物试样稀释于溶血溶液、具体而言选自下述的溶血溶液中-溶血溶液Capillaries 血红蛋白(e)；-溶血溶液Hydragel HbAlc ；-溶血溶液MINICAP 血红蛋白(e)；-纯水；-补充有表面活性剂的水，具体而言补充有Triton的水；及-其混合物。
23.一种缓冲液组合物，其适于通过毛细管电泳分析一种或若干种糖化血红蛋白，所述糖化血红蛋白包含结合至至少一条珠蛋白链上、且具体而言β珠蛋白链上的N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基且包含于含有一种或若干种血红蛋白的生物试样中，所述组合物如权利要求1至15中任一项中所定义。
24.一种试剂盒，其包含如权利要求23所述的缓冲液组合物且若适当则包含使用说明。
25.如权利要求1至7中任一项中所定义的能够专一性复合生物试样的糖化血红蛋白的葡萄糖残基并能在碱性PH下提供负电荷的化合物、和/或如权利要求1至15或23中任一项所定义的缓冲液组合物和/或如权利要求M所述的试剂盒，其用于诊断人类或非人类哺乳动物的糖尿病和/或监测人类或非人类哺乳动物的血糖平衡。
26.一种化合物，其能够专一性复合生物试样的糖化血红蛋白的葡萄糖残基并能在碱性PH下提供负电荷，其用于如权利要求25所述的用途，其中所述化合物是(i)硼酸根基化合物，其具有通式RB (OH) 2或RB (OH) ”其中基团R包含至少一个芳基和 /或烷基(直链、支链或环状)和/或芳烷基和/或其它官能团或杂原子、和/或其组合，且该基团R使糖化血红蛋白中与该硼酸根基团复合的每一葡萄糖残基在碱性PH下具有一个或若干个负电荷；或( )所述硼酸根基化合物的盐。
27.—种如权利要求1至7中任一项中所定义的能够专一性复合生物试样的糖化血红蛋白的葡萄糖残基并能在碱性PH下提供负电荷的化合物、和/或如权利要求1至15或23 中任一项所定义的缓冲液组合物和/或如权利要求M所述的试剂盒用于下述的用途通过毛细管电泳分离一种或若干种糖化血红蛋白与生物试样中存在的其它蛋白质、具体而言至少一种另一血红蛋白及优选其它血红蛋白，所述糖化血红蛋白包含至少一条珠蛋白链，该珠蛋白链含有结合至N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基。
全文摘要
本发明涉及一种通过糖化血红蛋白的毛细管电泳进行分析的方法，所述糖化血红蛋白包含于生物试样中且包含至少一条珠蛋白链，该珠蛋白链包含结合至N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基，其中所述方法包括使用包含至少一种化合物的缓冲液组合物，该化合物能够专一性复合一种或多种糖化血红蛋白的葡萄糖残基并且在碱性pH下能够向所述血红蛋白传递多个负电荷。举例而言，所述化合物可为3，4-或3，5-二羧基苯基硼酸、优选为3，5-二羧基苯基硼酸。所述方法尤其可用于分离及测定生物试样中存在的HbA1c血红蛋白，该生物试样任选包含其它血红蛋白、具体而言其它次要部分。本发明还涉及用于该分析中的缓冲液组合物、以及用于通过毛细管电泳进行的糖化血红蛋白的分析及测定的试剂盒。
文档编号G01N27/447GK102498392SQ201080038819
公开日2012年6月13日 申请日期2010年6月30日 优先权日2009年7月1日
发明者D.西莫宁, F.罗伯特, G.德沙姆普斯 申请人:落碧亚公司
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