专利名称：莱克多巴胺残留快速检测试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测受体兴奋剂的器具，特别是涉及一种莱克多巴胺(Ractopamine ，简称RA)残留快速检测试纸条。二、 技术背景禁用兽药在畜牧业及水产养殖业中的滥用，仍然是人们担 忧的重大问题，也是动物源性食品源头污染的重要因素之一。在水产养殖、畜 禽饲养过程中，禁用兽药莱克多巴胺、盐酸克伦特罗("瘦肉精")、己烯雌酚、 呋喃唑酮、安眠酮、氯丙嗪、氯霉素等的非法使用是造成虾、蟹、鱼、猪、禽 等产品变为非安全的食品的重要因素之一。食品安全是人们生命安全的初级保 障，事关人民的健康和社会稳定，是关系国计民生的大问题。目前我国食品安 全监管工作己进入"攻坚破难"的关键阶段，需要建立和完善我国的检测方法 标准体系，对有些违禁药物残留检测目前还没有国家标准或行业标准，有时难 以对食品中的这些残留实施有效监控，导致国内畜禽产品及水产品因禁用药残 留超标而不能出口，国外残留超标因我们检测不出而进口，�：θ嗣巧硖褰】�。 目前亟待解决的问题是，如何用简单的技术方法对集贸市场、批发市场上的菜 和肉进行快速检测，并及时发现和处理问题。盐酸克伦特罗(俗称瘦肉精)被非法用作饲料添加剂，饲喂猪、鸡、牛、 羊、兔、鸭等动物，制造出许多不安全肉食品，给人们的健康带来了很大的危 害。由于我们己研制开发出"瘦肉精"快速检测试纸条，在推广应用过程中产 生了巨大的威慑作用，因此，"瘦肉精"的非法使用得到了有效的控制。但"瘦 肉精"快速检测试纸条无法检测莱克多巴胺的残留，因此，随着"瘦肉精"快 速检测试纸条的推广应用，"瘦肉精"的非法使用逐步减少，而"瘦肉精"的替 代品莱克多巴胺的非法应用逐渐增加。农办牧[2004]70号文件，2004年下半年 全国饲料质量安全监测结果的通报检测养殖企业(户)和屠宰场的"饲料/水"、 猪尿样品2824批次，检出含有盐酸克仑特罗和莱克多巴胺等违禁药品55批次， 违禁药品检出率1.95%。其中，莱克多巴胺呈阳性的猪尿和猪配合饲料样品28 批次，含有盐酸克仑特罗的猪饲料和尿液样品2批次，与2003年相比，违禁药品检出率有所上升，主要原因是添加莱克多巴胺、地西泮等其他违禁药品现象 增加。浙江省农业厅的通报2005上半年，浙江省农业厅对全省的生猪养殖场 和屠宰场的生猪尿样进行了例行监测。监测人员共随机抽取了l 0 5家生猪养殖场的3 3 0份尿样，盐酸克仑特罗("瘦肉精")阳性检出率为0.6% (2例阳 性)莱克多巴胺阳性检出率为2.7% (9例阳性)。针对莱克多巴胺的残留检测， 2005年上海市质量技术监督局发布了 〔2005〕 64号文，制定了检测莱克多巴胺 的地方标准，但我国目前尚无统一检测标准。莱克多巴胺与"瘦肉精"属同类的化学合成药物，均属P -肾上腺素受体激动 剂-激动剂)，大剂量饲喂造成动物组织残留，中毒症状症状主要表现为 破坏快縮肌纤维与慢縮肌纤维的协调性，心率失常、心动过速、肌肉疼痛，行 走不稳,头晕头痛、恶心、呕吐，肌肉不自主震颤等症状，甚至有生命危险，长 期过量摄入会积蓄中毒，还有导致染色体畸变的可能。1997年3月25日，我国 农业部发布了《关于严禁非法使用兽药的通知》，严禁将P-激动剂等药物作为动 物促生长剂使用。2002年3月5日，农业部发布了《食品动物禁用的兽药及其 他化合物清单》，莱克多巴胺名列其中，要求对词料生产、经营、使用和动物饮 用水中非法使用违禁药物的违法行为严厉打击。莱克多巴胺现有的检测方法主 要有高压液相色谱法、气相色谱法、气质连用法以及ELISA等。色谱技术是非 常有效、准确、敏感的方法，但是待检样品需经一系列的预处理，繁琐费时， 从样品预处理到得出检验结果至少需2 3天时间，检测费用很高。另一方面这 种检测方法还必须有昂贵的仪器设备。只有特定的专业人员才能应用，而且每 次检测的样品有限，不适应大批样品的筛查，严重阻碍了该检测方法的推广应 用，更不适应于现场检验。ELISA也是一种常用的检测技术，它是以竟争性酶 联反应为检测原理，检测全过程约需2-4小时。由于ELISA是一种敏感性很强 的检测方法，不同的操作者往往会出现不同的结果，所以该方法常常造成人为 的误检和漏检。因此在实际生产中急需一种快速检测莱克多巴胺的检测方法。 目前各级食品检验部门和外贸出口单位，都加强对莱克多巴胺的检测力度，以 确保人民群众吃上放心肉。因此研制灵敏、快速，准确的莱克多巴胺检测方法， 检测家畜组织及饲料中是否含莱克多巴胺有着十分重要的意义。
三、实用新型内容本实用新型的目的研制出特异、敏感、快速、简便的莱克多巴胺残留快 速检测试纸条。本实用新型的技术方案 一种莱克多巴胺残留快速检测试纸条，含有底层 为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护层固定在吸附层上，吸附 层从测试端依次为纤维层，吸附金标抗体纤维层，纤维素膜层及手柄端的吸水 材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联莱克多巴胺的载体蛋白溶液印制的直线 式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和 对照印迹平行组合排列为"II "。不吸水的支撑层薄片层用硬质塑胶片条，或不吸水的硬纸条制成。 测试端纤维层用玻璃棉、或尼龙膜、或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、或聚酯 膜制成，优选玻璃棉。吸水材料层用吸水纸制成。纤维素膜层用硝酸纤维素膜、或纯纤维素膜，或羧化纤维素膜制成。 金标抗体纤维层用吸附莱克多巴胺的金标抗体玻璃棉，莱克多巴胺金标抗 体为胶体金标记莱克多巴胺的单克隆抗体或多克隆抗体，偶联莱克多巴胺的载 体蛋白溶液为莱克多巴胺与载体蛋白偶联的复合溶液。在测试端吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在 测试端纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧约0.5cm处。偶联莱克多巴胺的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，或为鸡卵清白蛋白 (OVA)，或为铁蛋白，或为血蓝蛋白。本实用新型的莱克多巴胺残留快速检测试纸条具有以下优点(1) 特异性强，敏感性高。RA快速检测试纸条以胶体金标记高亲和力的单克 隆抗体(Wl)为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形 成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单克隆抗体(Wl)特 异性和亲和力影响很�。揖哂薪细叩谋昙锹�。因此，快速检测试纸条具有较 高的特异性和敏感性，可检测到O.l纳克的微量RA残留。(2) 操作简便快速。使用本实用新型试纸条时无需任何其它试剂，只要将其 插入待检样品IO秒左右，在2分钟内即可判定检测结果。(3) 结果显示形象、直观、准确。本实用新型测试纸条以显示红棕色"I "及"II "印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条棕红色"I"印迹表示在被检测样品液中含有RA，两条棕红色"II "印迹表示在被检样品中 不含RA，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误 判。(4) 成本低，投资少。使用快速检测试纸条，不需另配仪器设备及其它试剂， 随时随地进行检测，费用低廉，节省大量贵重仪器及设备费用。(5) 应用范围广，便于推广应用。本实用新型快速检测试纸操作简单，能满 足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜 产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社 会效益。四、
图1为莱克多巴胺残留快速检测试纸条结构示意图。图2为莱克多巴胺残留快速检测试纸条俯视结构示意图。五具体实施方式
要制成莱克多巴胺残留快速检测试纸条，首先需制备偶联RA的载体蛋白和 金标抗体，从而制备检测印迹和金标抗体纤维；其次需制备羊抗或兔抗小鼠IgG 抗体，用于制备对照印迹。1. 莱克多巴胺RA与载体蛋白Xi的偶联采用碳化二亚胺法、重氮化法或戊二酸法，将RA与载体蛋白进行偶联制备 免疫抗原。将5mg莱克多巴胺溶解于预冷(2 8°C)的稀盐酸(pH3.0)中，加 入10mg亚硝酸钠(重量比为2: 1)，室温避光搅拌6小时，溶液颜色变为黄色。 将载体牛血清白蛋，或鸡卵清白蛋白或铁蛋白，或血蓝蛋白溶于PBS缓冲液中， 按摩尔比25: l加入上反应中，温室搅拌过夜。将反应液用PBS缓冲液透析即 可。2. 抗莱克多巴胺RA单克隆抗体(Wl)的制备以50u g 100 u g/只的偶联RA的载体蛋白免疫BALB/c系小鼠三次，每次 间隔15 30天；第三次加强免疫后3 4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死， 于75%酒精浸泡5 10min，无菌取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤， 1000r/min离心10min，收集脾细胞；将1 X 108的脾细胞与2 5 X 107的NSO浆 细胞瘤细胞混合，1000r/min离心10min弃上清，细胞沉淀于37°C的水溶中缓缓 加入0.7 lml的40 50。/oPEG4000 (pH8.5 9.0)作用lmin，然后缓慢加入无 血清1640培养基15ml，以终止PEG的作用，37。C水浴5 10min， 1000r/min 离心10min弃上清，将细胞沉淀重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔培养 板(100W 200fil/孔)，置于37"5。/。C02培养箱中培养。培养7 10天后，以 5iig 10ug/ml的偶联RA的载体蛋白包被酶标板(40孔/块)，以酶联免疫吸 附试验(ELISA)检测杂交瘤的培养上清，挑取强性细胞克隆(OD492=0.8以上)， 进行连续三次的有限稀释法克隆化，所生产的杂交瘤细胞染色体数为92 98， 其分泌的单克隆抗体(Wl)特异地与RA反应，而不与其它蛋白发生交叉反应， 亲和力常数达109~1G，轻链亚型为k或A ，重链亚型为IgG,、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3， 针对RA特异抗原决定簇的单克隆抗体(W1)，用于制备金标抗体。3. 莱克多巴胺RA金标抗体(Wl)和金标抗体(Wl)玻璃棉的制备 以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在50 100ml沸腾的0.01 0.05%氯金酸水溶液中加入2 4ml的0.5 2%柠檬酸三钠溶液，获得直径15nm左右的胶体 金。以0.1mol/L的K2CO3调胶体金pH至8.5 9.5，置于以1:1000 1300的标 记比将待标记的RA单克隆抗体(Ml)加入pH8.5 9.5的金溶胶中，标记lOmin 后，加20。/。PEG10000至终浓度0.05。/。， 4°C、 1500 3000rpm离心20min，除去 未结合的胶体金颗粒，4°C、 15000rpm离心lh，弃上清，获初步纯化金标抗体 蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获得RA胶体 金标记抗体。将l: (100 500)稀释的胶金标记抗体吸附于精制玻璃棉中，4°C 低温真空干燥，制备RA金标抗体棉。4. 羊抗或兔抗小鼠IgG的制备以饱和硫酸铵提取小鼠血清IgG，取1份小鼠血清加2份PBS (pH 7.2)混 匀，加等体积饱和硫酸铵混匀，置4。C冰箱2h， 4°C、 1200r/min离心15min，弃 上清；以适量PBS(pH7,2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵至终浓度33%,置化冰箱 2h,4。C、 1200r/min离心15min，弃上清，以少量PBS(pH7.2)溶解沉淀，置4。C冰 箱内用PBS(pH7.2)过夜透析，换液2 3次，4°C、 12000r/min离心15min,收集 上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以50Pg 100yg/kg体重(小鼠血 清IgG)经皮下和肌肉注射免疫健康羊或家兔3 4次，末次免疫10天后，静脉 采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1: 2000以上，心脏采血或颈动脉放血， 收集其高免血清，以饱和硫酸铵提取羊抗或兔抗小鼠IgG (方法与提取小鼠血清 IgG相同，不重述)，用于RA快速检测试纸条对照显示印迹的制备。5. 莱克多巴胺RA快速检测试纸条实施检测反应原理当莱克多巴胺RA快速检测试纸条样品端插入待检测样品溶液后，待检溶液 通过虹吸带动待检RA及金标抗体棉中的金标抗体(Wl) —起向硝酸纤维素膜 扩散，并最终渗入手柄端滤纸中，扩散过程中待检RA可与的金标抗体(Wl) 相结合，进而封闭金标抗体(Wl)上RA的抗原结合点，阻止金标抗体(Wl) 与纤维素膜上偶联RA的载体蛋白(Xi)的检测印迹结合，不能显示检测印迹， 而羊抗或兔抗小鼠IgG (Y)则可与金标抗体(Wl)结合，形成红棕色对照印 迹"I "，即一条红棕色"I "印迹为阳性标记，反之样品溶液中无RA则不能 阻止金标抗体(Wl)与纤维素膜上偶联RA的载体蛋白(Xi)检测印迹结合， 显示红棕色检测印迹"I "，同样羊抗或兔抗小鼠IgG (Y)也与金标抗体(Wl) 结合，显示红棕色对照印迹"I "，形成两条红棕色"II "为阴性标记，如果纤 维素膜上没有红棕色标记显示，则表明试纸条已失效。6. 莱克多巴胺RA快速检测试纸条检测操作方法检测样品液的制备，若检测肉或肉制品可将样品剪碎、研磨，以生理盐制 成1:2 10待检测样品悬液；若检测的对象是蛋或奶，可直接将蛋或奶用生理盐 水制成1:2 10待检测样品悬液；若用动物的血液作为待测样品，则提取血清， 用血清作为待测样品，或直接取动物的尿液作为检测样品。将RA快速检测试纸条样品端插入待检测样品液中，插入深度不超过标记线 9，约IO秒后取出检测试纸条，水平放置约2分钟，观察结果。检测结果判断如果在纤维素膜上有一条红棕色标记"I "显示，表示测 检结果呈阳性，说明在被检测的样品液中含有RA，即该动物饲喂过含有违禁的
莱克多巴胺添加剂饲料，这样的动物肉料和肉制品不能在市场上流通，人吃了上述肉类将会影响健康，甚至会发生食物中毒。如果RA快速检测试纸条上的纤维素膜出现有两条红棕色标记"II "，表示检测结果呈阴性，即在待检样品中不含莱克多巴胺成份，则呈阴性结果的动物肉类和肉制品中不含RA成份，食用安全。实施例一参见图1和图2。图中l为支撑层，用塑胶薄片条制成，2为测 试样品端的纤维层，用玻璃棉制成，3为吸附有莱克多巴胺RA的金标抗体(W1) 纤维层，根据上述具体实施方式
3中所述的制备方法，制备吸附有莱克多巴胺 单克隆抗体的金标抗体(Wl)玻璃棉，4为纤维素膜层，本实施例采用硝酸纤 维素膜，5为吸水材料层，用吸水滤纸制成，将编号2、 3、 4、 5各层从左至右 粘贴在塑胶薄片条1上，彼此之间交界处纤维互相交叉渗透。在硝酸纤维素膜 层4上，6为用偶联莱克多巴胺的载体蛋白BSA溶液印上检测印迹"I "， 7为 用羊抗小鼠IgG(Y)溶液印上对照印迹"I "，两条印迹带平行排列形成组合印迹 带"II "。8 — 1为覆盖在纤维层2和金标抗体纤维层3上面的样品端白色保护膜， 在2和3交界处对应保护膜8-1位置上偏向于玻璃棉2 —侧0.5cm处印有标记线 9， 9的右端印有箭头及max字样，吸水层5 (手柄端)上覆盖有其它颜色(如 黄色)保护膜8-2。待测样品溶液的制备及检测操作步骤，同具体实施方式
6中 的检测操作方法，不重述。实施例二莱克多巴胺残留快速检测试纸条结构和实施例一基本相同， 不同之处在于支撑层1用不吸水的硬纸条制成，测试端纤维层2用尼龙膜， RA金标抗体纤维层3吸附有胶金标记莱克多巴胺RA多克隆抗体，纤维素膜层 4采用纯纤维素膜，隐形检测印迹带6中偶联RA载体蛋白溶液为铁蛋白，隐形 对照印迹带7用兔抗小鼠IgG溶液在纤维素膜上制备而成。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同具体实施方式
6中的 操作方法，不重述。实施例三、莱克多巴胺残留快速检测试纸条结构和实施例一基本相同， 不同之处在于测试端吸附纤维层2用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，纤维素膜层 4釆用羧化纤维素膜，隐形检测印迹带6中偶联RA载体蛋白溶液为鸡卵清白蛋
白(OVA)，隐形对照印迹带7用羊抗小鼠IgG溶液在纤维素膜上制备而成。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同具体实施方式
6中的 检测操作方法，不重述。实施例四莱克多巴胺残留快速检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于测试端吸附纤维层2用聚酯膜，隐形检测印迹带6中偶联RA载体蛋白溶液为血蓝蛋白。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同具体实施方式
6中的 检测操作方法，不重述。
权利要求1.一种莱克多巴胺残留快速检测试纸条，含有底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护层固定在吸附层上，其特征是吸附层从测试端依次为纤维层，吸附金标抗体纤维层，纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联莱克多巴胺的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印�：投哉沼〖Ｆ叫凶楹吓帕形啊�。
2. 根据权利要求1所述的试纸条，其特征是不吸水的支撑层薄片层用硬 质塑胶片条，或不吸水的硬纸条制成。
3. 根据权利要求1所述的试纸条，其特征是测试端纤维层用玻璃棉、或 尼龙膜、或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、或聚酯膜制成。
4. 根据权利要求3所述的试纸条，其特征是测试端纤维层用玻璃棉制成。
5. 根据权利要求1所述的莱克多巴胺残留快速检测试纸条，其特征是吸 水材料层用吸水纸制成。
6. 根据权利要求1所述的试纸条，其特征是纤维素膜层用硝酸纤维素膜、 或纯纤维素膜，或羧化纤维素膜制成。
7. 根据权利要求1所述的试纸条，其特征是金标抗体纤维层用吸附莱克 多巴胺的金标抗体玻璃棉，莱克多巴胺金标抗体为胶体金标记莱克多巴胺的单 克隆抗体或多克隆抗体，偶联莱克多巴胺的载体蛋白溶液为莱克多巴胺与载体 蛋白偶联的复合溶液。
8. 根据权利要求1所述的试纸条，其特征是在测试端吸附纤维层、金标 抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端纤维层与金标抗体纤维层 交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧约0.5cm处。
9. 根据权利要求1所述的试纸条，其特征是偶联莱克多巴胺的载体蛋白 为牛血清白蛋白(BSA)，或为鸡卵清白蛋白(OVA)，或为铁蛋白，或为血蓝 蛋白。
专利摘要本实用新型涉及一种检测受体兴奋剂的器具，特别是涉及一种莱克多巴胺残留快速检测试纸条。本实用新型莱克多巴胺残留快速检测试纸条含有底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护层固定在吸附层上，吸附层从测试样品端依次为纤维层，吸附偶联RA的金标载体蛋白Xi纤维层，纤维素膜层，手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上有用偶联莱克多巴胺的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印�：投哉沼〖Ｆ叫凶楹吓帕形啊�。该快速检测试纸条，特异性强，敏感性高，操作简便快速；检测结果显示形象，直观，准确，成本低，投资少，不需专用仪器设备及专业人员，容易推广实施。
文档编号G01N33/558GK201051101SQ20062003141
公开日2008年4月23日 申请日期2006年4月3日 优先权日2006年4月3日
发明者张改平, 李学伍, 李灵霞, 李青梅, 杨继飞, 杨艳艳, 柴书军, 王建中, 王自良, 王选年, 肖治军, 东 赵, 邓瑞广, 邢广旭 申请人:河南省动物免疫学重点实验室
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