专利名称：IgY－McAb夹心ELISA检测旋毛虫循环抗原的方法
技术领域：
本发明涉及生物学、寄生虫学、血清学及免疫学技术，尤其是涉及鸡卵黄免疫球蛋白(Egg Yolk Immunoglobulin, IgY)—单克隆抗体(Monoclonal Antibody, McAb)夹心 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)检测血清中旋毛虫循环抗原的方法。
背景技术：
旋毛虫病(trichinellosis)是一种呈世界性分布的严重�：θ颂褰】档娜耸薰不技纳娌。饕蛏郴虬肷澈行娓腥拘杂壮娴娜饫嗉捌渲破匪隆Ｒ阎�150 多种动物可自然感染旋毛虫spiralis)，mM予66个国家(或地区)。我国除海南省以外，其他省、市、自治区均有动物感染旋毛虫的报道，近年来我国已发生多起人体旋毛虫病暴发。由于旋毛虫感染的传统检测方法主要依靠肌肉活检，该法检出率低且实施困难，近年来，国内外学者试图通过检测血清中的旋毛虫抗体来实现对旋毛虫感染的检测， 但是通常只能在感染后3、周才能检出旋毛虫抗体，而此时部分重度感染者可能已因急性期并发症而死亡，故检测旋毛虫抗体不能用于旋毛虫病的早期诊断。研究结果表明，旋毛虫幼虫在宿主体内移行和发育过程中所产生的排泄-分泌(Excretory-Secretory，ES)物及虫体表面脱落物可进入血液而成为循环抗原(Circulating Antigens, CAg)，此类抗原含量与感染强度成正比，且出现时间早于特异性抗体，其半衰期亦明显短于特异性抗体，因而， 检测血清中旋毛虫CiVg有望用于对旋毛虫感染的早期检测、既往和现症感染的鉴别以及疗效考核；然而，血清中的CiVg含量通常较低，应用常规方法时检出率仅为19%、4%，极大地限制了检测CAg的推广应用，因此，目前亟需建立一种敏感性高、特异性强的检测旋毛虫CAg 的新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高度敏感性和特异性的IgY-McAb夹心ELISA检测旋毛虫循环抗原的方法。为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案
本发明所述的IgY — McAb夹心ELISA检测旋毛虫循环抗原的方法，它是以抗旋毛虫肌幼虫ES抗原鸡卵黄抗体IgY作为捕获抗体，以抗旋毛虫ES抗原McAb作为检测抗体；所述抗旋毛虫肌幼虫ES抗原鸡卵黄抗体IgY和抗旋毛虫ES抗原McAb分别通过下述方法制备而成
(A)制备抗旋毛虫肌幼虫ES抗原鸡卵黄抗体IgY
将旋毛虫肌幼虫加入培养基中无菌培养，上清纯化透析后浓缩干燥即得ES抗原，测定蛋白浓度后分装待用；用上述旋毛虫肌幼虫ES抗原免疫罗曼蛋鸡，所产鸡蛋卵黄用饱和硫酸铵沉淀法收集IgY，纯化后测定浓度，既得抗旋毛虫肌幼虫ES抗原鸡卵黄抗体IgY，分装后备用；
(B)制备抗旋毛虫ES抗原McAb建立分泌抗旋毛虫肌幼虫ES抗原的杂交瘤细胞株，使用有限稀释法进行克隆化，应用辛酸-硫酸铵法纯化McAb，测定浓度后分装备用。检测时，采用棋盘滴定法确定IgY最适包被浓度，用碳酸盐包被缓冲液将最适浓度的IgY包被到酶标板的反应孔中作为捕获抗体；加入最佳比例稀释的待检血清；将作为检测抗体的McAb和辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG依次加入反应孔，最后加底物显色并判定检测结果。本发明的优点在于为感染动物血清中旋毛虫CAg的早期检测提供了一种敏感性更高且具有广泛应用前景的新方法，克服了常规方法由于血清中CiVg含量低而难于检出的缺点，有利于血清中旋毛虫CiVg检测在实践中的推广应用。本发明经体外培养收集旋毛虫肌幼虫ES抗原，并使用抗旋毛虫肌幼虫ES抗原IgY和McAb分别作为捕获抗体和检测抗体， 建立了血清中旋毛虫CAg检测的IgY-McAb夹心ELISA方法，可实现对旋毛虫感染的早期检测，与已有方法相比，在很大程度上提高了早期检测的灵敏度和特异度，本发明亦可用于既往和现症感染的甄别以及疗效考核。IgY (鸡卵黄免疫球蛋白)是鸡血液中的IgG被选择性转移到卵黄中形成的，而且是卵黄中唯一的免疫球蛋白类，其结构虽与IgG相似，但在血清学检测方面比哺乳动物源性的IgG更具优势，可避免与类风湿因子等结合发生交叉反应，特异性更高；此外，IgY能与更多的抗原表位结合而起到信号放大作用，可提高检测的敏感性；目前国内外尚未有将 IgY用于旋毛虫病诊断的报道。McAb是由B细胞杂交瘤细胞株产生的、只针对一种抗原决定簇的单一抗体，可为旋毛虫感染的检测提供高度特异、敏感的工具。
图1是IgY-McAb夹心ELISA检测感染旋毛虫小鼠不同时间血清中CAg变化。图2是IgY-McAb夹心ELISA检测感染旋毛虫小鼠治疗后不同时间血清CAg变化。
具体实施例方式本发明所述的IgY — McAb夹心ELISA检测旋毛虫循环抗原的方法，它是以抗旋毛虫肌幼虫ES抗原鸡卵黄抗体IgY作为捕获抗体，以抗旋毛虫ES抗原McAb作为检测抗体； 所述旋毛虫肌幼虫ES抗原鸡卵黄抗体IgY和抗旋毛虫ES抗原McAb分别通过下述方法制备而成
(1)制备抗旋毛虫肌幼虫ES抗原鸡卵黄抗体IgY (1.1)旋毛虫肌幼虫ES抗原的制备
将改良贝氏法收集的旋毛虫肌幼虫按5 000条幼虫/mL的比例加入1640培养基中，培养时加入青霉素(100U/mL)和链霉素(100U/mL)，37°C 5%C02培养箱中培养18h，高速离心机4°C离心，将上清4°C透析3 d，快速真空浓缩系统浓缩干燥即得ES抗原，测定浓度后分装，置一 80°C保存备用。整个过程必须严格无菌操作。(1. 2)抗旋毛虫肌幼虫ES抗原鸡卵黄抗体IgY的制备
取IOOyg旋毛虫肌幼虫ES抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后经翅下静脉免疫罗曼蛋鸡，间隔2周以同样剂量加弗氏不完全佐剂静脉免疫，共免疫4次。首次免疫7d 后开始收集鸡蛋，取卵黄与蒸馏水以1: 9混合后充分搅拌15min，4°C过夜；取上清，4°C10 OOOg离心25min ;50%、33%饱和硫酸铵沉淀2次，弃上清，适量PBS将沉淀洗下，置透析袋中以消毒蒸馏水透析3djh换水1次，收集上清液，快速真空浓缩系统干燥浓缩后， Bradford法测其浓度，分装后置一 80°C备用。(2)制备抗旋毛虫ES抗原McAb
(2. 1)旋毛虫肌幼虫ES抗原免疫BALB/c小鼠
选择6、周龄雌性BALB/c小鼠，取旋毛虫肌幼虫ES抗原50 μ g与等量弗氏完全佐剂充分乳化后腹股沟及颈背部皮下多点注射，此后每间隔3周以25 μ g ES抗原与弗氏不完全佐剂等体积充分混合乳化后用相同方式注射，共免疫3次；末次免疫2周后，于融合前3d直接对免疫小鼠脾内注射无佐剂ES抗原50 μ g加强免疫。(2. 2)杂交瘤细胞株的建立
(2. 2a)免疫脾细胞的制备用 RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute-1640) 不完全培养基冲洗出上述免疫鼠脾细胞，将脾细胞转移至50mL离心管内，1 OOOg离心 5min，用培养基洗涤2次后适当稀释，计数备用。(2. 2b)SP2/0细胞的复苏和制备融合前2周复苏冻存的SP2/0骨髓瘤细胞株，加入8-AG (20 μ g/mL), 5% CO2培养箱中37°C连续培养3代以上，以筛选并保持次黄嘌呤_鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷型。融合前Μ、》ι，选择生长良好、形态完整的处于对数分裂期的SP2/0细胞进行半传代培养。(2. 2c)细胞融合取对数生长期的SP2/0和免疫脾细胞，分别1 OOOg离心 5min,弃上清后，用RPMI-1640不完全培养基混悬细胞后计数，将骨髓瘤细胞与脾细胞按 1:10^1:5的比例混合在一起；用培养基洗涤1次，1 OOOg离心lOmin，尽弃上清，将离心管置于37°C水浴中，逐滴缓慢滴入ImL 37°C预温的融合剂50%聚乙二醇(Polyethylene Glycol, PEG，分子量4 000,30s内加完)，使其与细胞混勻；终止PEG作用，将反应终止的细胞悬液1 OOOg离心5min，弃上清后轻悬于含20%胎牛血清的HAT (Hypoxanthine-Aminop terin-Thymidine, HAT)培养液中，将融合后细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔板中， 100 μ L/孔，5%C02培养箱37°C培养。(2. 3)有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化
将抗体分泌阳性的杂交瘤细胞集落(强阳性孔)轻轻吹起，混勻，进行活细胞计数，计算细胞密度；取混勻的细胞悬液，用完全培养基准确进行系列稀释，将细胞稀释至5、10、 50个细胞/mL ；将稀释好的细胞悬液分别加入已铺好饲养细胞的96孔培养板中，每孔 100 μ L，使每孔分别含0. 5、1和5个细胞；置5% CO2细胞培养箱中37°C培养，注意观察细胞的生长状况，待细胞集落生长到孔底1/1(Γ /5面积时半换液；当肉眼可见细胞克隆时， 吸取适当培养液上清进行抗体检测；初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养基中加HT (Hypoxanthine-Thymidine, HT)；每次克隆化的同时将剩余细胞进行扩大培养并及时冻存，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率达到100% ；—般经过2 3次克隆化操作，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(2. 4)体内诱生腹水法制备腹水
取8周龄BALB/c小鼠，每只小鼠经腹腔注射灭菌液体石蜡0. 5mL进行预处理，1周后再腹腔注射0. 5mL处于对数生长期的杂交瘤细胞悬液(广2X IO6个/mL)，IOd后小鼠腹部明显膨大，无菌条件下收集腹水。
(2. 5)辛酸-硫酸铵法纯化腹水中的单克隆抗体
将收集的腹水在高速低温离心机中4°C 10 OOOg离心20min，弃去表面油脂后收集上清，用4倍体积醋酸缓冲液稀释，缓慢逐滴加入2. 5倍体积的正辛酸，4°C静置Ih后10 OOOg 离心30min ；取上清，加入1/10体积的10XPBS，4°C预冷后逐滴加入45%饱和硫酸铵沉淀， 4°C静置lh，10 OOOg离心20min ；弃上清，将沉淀悬浮于少量PBS中，稀释后转入透析袋，在 100倍体积的PBS中4°C透析3d，每Mi换液1次；回收透析产物，4°C 10 OOOg离心30min， 除去不溶性沉渣即得所制备抗旋毛虫肌幼虫ES抗原的McAb，用考马斯亮蓝G-250法测定其浓度并分装，一 80°C保存备用。(3) IgY-McAb夹心ELISA检测旋毛虫循环抗原
(3. 1)包被IgY 棋盘滴定法确定IgY最适包被浓度及血清最佳稀释度；用碳酸盐包被缓冲液(PH9. 6)将已测浓度的IgY稀释至最适包被浓度，ΙΟΟμ ν孔包被酶标板，4°C过夜。(3.2)洗涤垂直倒空酶标板孔中的液体，拍干，孔内加满洗涤液(PBST)，静置細in，反复3次，最后将酶标板倒置在吸水纸上，拍干。(3. 3)封闭用5%脱脂奶粉封闭，200μ 7孔，37°C Ih。(3. 4)洗涤同上。(3. 5)加被检血清用稀释液将被检血清以最佳比例稀释，取IOOPL稀释血清加入酶标板，每板均设阳性、阴性及空白对照，37 °C Ih。(3. 6)洗涤同上。(3. 7)加一抗用稀释液将单克隆抗体以最佳稀释度稀释，ΙΟΟμ ν孔，37°C Ih0(3. 8)洗涤同上。(3.9)加酶标二抗用稀释的HRP-羊抗小鼠IgG为二抗，每孔加入酶标山羊抗小鼠 IgG 10(^L，37°C Ih0(3. 10)洗涤同上。(3. 11)加底物各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液10(^L，37°C 20min。(3. 12)加终止液各反应孔中加入终止液50μ ，立即测OD值。(3. 13)观察结果肉眼观察后用酶联免疫检测仪(λ =490nm)测吸光值(Α490值)。(3. 14)结果判定肉眼观察淡黄色为阴性，桔红色为阳性。用酶联免疫检测仪测 OD值，以待测样品OD值/阴性对照平均OD值彡2. 1者为阳性。本发明的有益效果主要体现在
1、本发明所涉及抗旋毛虫肌幼虫ES抗原的IgY和McAb均由旋毛虫肌幼虫ES抗原免疫动物制备，针对性强，对血清中旋毛虫CAg进行捕获时具有高度的特异性。2、本发明所涉及ELISA法为成熟技术，易于掌握，在生物医学领域应用广泛，可大范围推广。3、本发明所涉及IgY-McAb夹心ELISA方法在对血清中旋毛虫CAg进行检测时不仅具有高度的敏感性和特异性，而且稳定性和重复性良好；可实现对旋毛虫感染的早期、快速检测，并可用于既往和现症感染的鉴别、疗效考核及血清流行病学调查。夹心ELISA方法在对血清中旋毛虫CAg检测的敏感性
取已知浓度的旋毛虫肌幼虫ES抗原，按一定梯度依次倍比稀释，按照本发明说明书中所述IgY-McAb夹心ELISA法步骤操作，注意同时设置阴性对照和空白对照。测定结果表明，当旋毛虫肌幼虫ES抗原稀释至Ing/mL时，其S/N值仍大于2. 1，结果仍为阳性，说明本发明对ES抗原的最小检出量可低至Ing/mL，具有较高的敏感性，如表1所示。
表1 IgY-McAb夹心ELISA敏感性检测(S/N值)
权利要求
1. 一种IgY - McAb夹心ELISA检测旋毛虫循环抗原的方法，其特征在于它是以抗旋毛虫肌幼虫ES抗原鸡卵黄抗体IgY作为捕获抗体，以抗旋毛虫ES抗原McAb作为检测抗体； 所述旋毛虫肌幼虫ES抗原鸡卵黄抗体IgY和抗旋毛虫ES抗原McAb分别通过下述方法制备而成(A)制备抗旋毛虫肌幼虫ES抗原鸡卵黄抗体IgY将旋毛虫肌幼虫加入培养基中无菌培养，上清纯化透析后浓缩干燥即得ES抗原，测定蛋白浓度后分装待用；用上述旋毛虫肌幼虫ES抗原免疫罗曼蛋鸡，所产鸡蛋卵黄用饱和硫酸铵沉淀法收集IgY，纯化后测定浓度，即得抗旋毛虫肌幼虫ES抗原鸡卵黄抗体IgY，分装后备用；(B)制备抗旋毛虫ES抗原McAb建立分泌抗旋毛虫肌幼虫ES抗原的杂交瘤细胞株，使用有限稀释法进行克隆化，应用辛酸-硫酸铵法纯化McAb，测定浓度后分装备用。
全文摘要
本发明公开了一种IgY－McAb夹心ELISA检测旋毛虫循环抗原的方法，它是以抗旋毛虫肌幼虫ES抗原鸡卵黄抗体IgY作为捕获抗体，以抗旋毛虫ES抗原McAb作为检测抗体；所述IgY的制备方法为将旋毛虫肌幼虫加入培养基中无菌培养，上清纯化透析后浓缩干燥即得ES抗原，测定蛋白浓度后用其免疫罗曼蛋鸡，所产鸡蛋卵黄用饱和硫酸铵沉淀法收集IgY，纯化后测定浓度即可分装备用；所述McAb的制备方法为建立分泌抗旋毛虫肌幼虫ES抗原的杂交瘤细胞株，使用有限稀释法进行克隆化，应用辛酸-硫酸铵法纯化McAb，测定浓度后分装备用。本发明的优点在于为感染动物血清中旋毛虫CAg的早期检测提供了一种具有高度敏感性和特异性且具有广泛应用前景的新方法。
文档编号G01N33/531GK102331501SQ201110167550
公开日2012年1月25日 申请日期2011年6月21日 优先权日2011年6月21日
发明者井丰军, 付光宇, 姜鹏, 崔晶, 李旭旭, 王中全, 王烨 申请人:郑州大学
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